茶多酚脂質(zhì)體溫敏凝膠的制備工藝研究

宋婷婷，羅 珊，何碧玉，徐應(yīng)淑

(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

牙周疾病在全世界非常普遍，而氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)在牙周疾病的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用[1-2]。茶多酚(Tea polyphenol,TP)是從茶葉中提取出來的多酚類化合物，具有良好的生物和藥理作用，如抗氧化、抗菌、抗癌、降血脂等[3]。查閱近年文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚可通過提供氫原子，作為自由基的受體，中斷氧化反應(yīng)，或通過螯合金屬離子而用作抗氧化劑，并可抑制牙周病原體的生長，是控制牙周疾病的健康替代品[4-6]。然而，茶多酚中含有多羥基結(jié)構(gòu)，對(duì)氧氣和光的敏感性降低了其在加工和儲(chǔ)存中的穩(wěn)定性，并且其在人體內(nèi)代謝時(shí)易與蛋白質(zhì)結(jié)合而失去藥理活性，導(dǎo)致其生物利用度較低，從而限制了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[7]。

脂質(zhì)體是由膜狀脂質(zhì)分散在水性溶劑中形成的微觀雙層囊泡，可通過提高成分的溶解度，從而提高其生物利用度來改善產(chǎn)品性能，這些特性已在食品，化妝品和藥品行業(yè)中廣泛使用[8]。脂質(zhì)體溫敏凝膠作為一種新的透皮給藥制劑，具有良好的生物相容性，對(duì)藥物釋放具有顯著的緩釋作用，可減少給藥次數(shù)，提高患者的順應(yīng)性[9-10]。本研究擬將自制TP脂質(zhì)體分散在以泊洛沙姆為基質(zhì)的凝膠中，制備成脂質(zhì)體溫敏凝膠，并對(duì)TP脂質(zhì)體溫敏凝膠的制備工藝進(jìn)行研究，篩選出最佳處方，提高制劑質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 T9CS雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；NanoBrook 90Plus PALS激光粒度儀(美國布魯克海文儀器公司)；DL-820D智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SK220生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 茶多酚(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)MB5041，純度≥98%)，蛋黃卵磷脂(PC-98T，艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)EK16068，BR)，膽固醇(CH，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)2017090601，BR)，泊洛沙姆188(P188，武漢華翔科潔生物科技有限公司，AR)，泊洛沙姆407(P407，廣州通哲生物科技有限公司，AR)，1,2-丙二醇，0.02%苯扎溴銨、無水乙醇、三氯甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TP含量測(cè)定

2.1.1 TP紫外吸收波長的確定 精密稱取茶多酚對(duì)照品適量，用無水乙醇配制成適宜濃度，以無水乙醇作為參比溶液，在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[11]，并記錄紫外吸收光譜(見圖1)。結(jié)果，TP對(duì)照品溶液在276 nm處有最大吸收，空白脂質(zhì)體破乳溶液在276nm處無明顯吸收，說明處方中輔料在276 nm處對(duì)TP含量測(cè)定無干擾。

圖1 空白脂質(zhì)體破乳溶(A)液和TP對(duì)照品溶液(B)的紫外吸收光譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取茶多酚對(duì)照品0.0150 g至50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解稀釋至300 μg/mL，得TP對(duì)照品儲(chǔ)備液。再取配制好的TP對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加無水乙醇稀釋成6.0、12.0、18.0、24.0、30.0、36.0、42.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以無水乙醇為參比溶液，在276 nm處測(cè)定吸光度A，并進(jìn)行吸光度A-濃度C的線性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=0.024 8C+0.002 2(R2=0.999 9)。結(jié)果表明，TP在6.0～42.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 TP脂質(zhì)體的制備及處方優(yōu)化

2.2.1 TP脂質(zhì)體的制備 采用薄膜超聲分散法[12]制備TP脂質(zhì)體。分別精密稱取處方用量的蛋黃卵磷脂、膽固醇、TP于250 mL茄形瓶中，加入氯仿-無水乙醇(v/v 1∶1)混合溶劑超聲溶解，35℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑得到均勻透明薄膜。將膜用PBS緩沖液水合，在40℃水浴中保持30 min，超聲處理即得TP脂質(zhì)體混懸液，置于4℃保存。同法以不加TP制備空白脂質(zhì)體。

2.2.2 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定 采用高速離心法[13]測(cè)定TP脂質(zhì)體的包封率。精密吸取400 μL TP脂質(zhì)體混懸液于離心管中，加無水乙醇混合至4 mL，超聲破乳，吸取上清液加無水乙醇稀釋至10 mL，在276 nm處測(cè)量其吸光度A，計(jì)算脂質(zhì)體混懸液中TP總量(m1)；另精密吸取400 μL TP脂質(zhì)體混懸液加蒸餾水混合至2 mL，然后以12 000 r/min離心30 min，吸取上清液加無水乙醇稀釋至10 mL，計(jì)算游離TP的量(m2)。根據(jù)公式計(jì)算TP脂質(zhì)體的包封率EE%：包封率EE%=(m1-m2)/m1×100%；其中m1是脂質(zhì)體混懸液中TP的總量，m2是脂質(zhì)體混懸液中游離TP的量。

2.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取蛋黃卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比(EPC:CH)、蛋黃卵磷脂與茶多酚質(zhì)量比(EPC:TP)、水化介質(zhì)pH值、超聲時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素選定三水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)[14]，對(duì)TP脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)一步優(yōu)化(因素與水平見表1)。

表1 因素水平表

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果(見表2～3)可知，各因素對(duì)包封率的影響順序?yàn)锽>D>A>C，即蛋黃卵磷脂與藥物質(zhì)量比為主要影響因素，水化介質(zhì)pH值的影響最小。最佳制備工藝條件為A3B2C1D3，即EPC:CH為4∶1、EPC:TP為5∶1、水化介質(zhì) pH 值為6.0、超聲時(shí)間為4 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.2.4 最佳工藝的驗(yàn)證 按優(yōu)化出的最佳工藝條件平行制備3批樣品，測(cè)定包封率并計(jì)算載藥量。測(cè)得茶多酚脂質(zhì)體的平均包封率為68.84%(n=3)，平均載藥量為7.40%(n=3)。

2.3 TP脂質(zhì)體質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 顯微形態(tài)觀察 取適量TP脂質(zhì)體混懸液于載玻片上，加蒸餾水稀釋，晾干后在顯微鏡下觀察。如圖2所示，在顯微鏡下TP脂質(zhì)體形態(tài)均勻，呈球形或類球形。

圖2 TP脂質(zhì)體顯微形態(tài)(×40)

2.3.2 粒徑、粒度分布及Zeta電位的測(cè)定 取適量TP脂質(zhì)體混懸液，加適量蒸餾水稀釋，采用NanoBrook 90PlusPALS激光粒度儀測(cè)定其粒徑、粒度分布及Zeta電位。結(jié)果見圖3、表4。

圖3 TP脂質(zhì)體粒徑分布

表4 粒徑及Zeta電位測(cè)定結(jié)果

2.3.3 TP脂質(zhì)體穩(wěn)定性的考察 將TP脂質(zhì)體在4 ℃條件下儲(chǔ)存7、15、30 d后，測(cè)定脂質(zhì)體的包封率和滲漏率，結(jié)果見表5。由表中數(shù)據(jù)可以看出TP脂質(zhì)體儲(chǔ)存在4℃條件下穩(wěn)定性較好。

表5 滲漏率測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.4 TP脂質(zhì)體溫敏凝膠的制備[15]稱取處方量1,2-丙二醇、0.02%苯扎溴銨溶于適量蒸餾水中，再稱取處方量的P407和P188撒布于上述溶液表面，置4℃冰箱中冷藏，使其充分溶脹至溶液澄清透明。另取TP脂質(zhì)體混懸液，邊攪拌邊加入至上述凝膠中，充分?jǐn)嚢杌靹?，使TP脂質(zhì)體均勻分散在凝膠體系中，即得TP脂質(zhì)體溫敏凝膠。

2.5 膠凝溫度的測(cè)定 采用倒置試管法[16]測(cè)定膠凝溫度。量取適量冷藏的TP脂質(zhì)體溫敏凝膠溶液于試管中，置水浴鍋中，以1 ℃/min的速率升溫，每升高1℃，取出試管并傾斜90 °，觀察溫敏凝膠溶液的流動(dòng)性。當(dāng)完全無法流動(dòng)時(shí)的溫度即為膠凝溫度。觀察溶膠-凝膠狀態(tài)的可逆變化，重復(fù)測(cè)量3次膠凝溫度，計(jì)算平均值。

2.6 TP脂質(zhì)體溫敏凝膠處方用量的考察 以膠凝溫度為考查指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)分別考察P407用量，P188用量，TP脂質(zhì)體用量及1,2-丙二醇用量對(duì)TP脂質(zhì)體溫敏凝膠膠凝溫度的影響。

2.6.1 P407用量的考察 固定處方中其他用量，改變P407的用量(16%、18%、20%、22%、25%)，按2.4項(xiàng)下方法制備TP脂質(zhì)體溫敏凝膠，并分別測(cè)定其膠凝溫度。結(jié)果顯示(見圖3 A)，P407濃度越高，膠凝溫度越低。因此，選定P407的用量為16%進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.6.2 1,2-丙二醇用量的考察 固定處方中其他用量，改變1,2-丙二醇的用量，分別設(shè)為1%、3%、5%、10%、15%，按2.4項(xiàng)下方法制備TP脂質(zhì)體溫敏凝膠，并測(cè)定膠凝溫度。結(jié)果見圖3 B，1,2-丙二醇用量對(duì)其膠凝溫度影響不大，選取3%的用量進(jìn)行后續(xù)的單因素試驗(yàn)。

2.6.3 TP脂質(zhì)體用量的考察 固定處方中其他用量，改變TP脂質(zhì)體的用量，使其分別為20%、40%、60%、70%、80%，按2.4項(xiàng)下方法制備TP脂質(zhì)體溫敏凝膠，并測(cè)定膠凝溫度。結(jié)果見圖3 C，TP脂質(zhì)體用量對(duì)其膠凝溫度影響不大，選定20%的用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.6.4 P188用量的考察 在P407用量為16%，1,2-丙二醇為3%，TP脂質(zhì)體為20%，苯扎溴銨為0.02%的基礎(chǔ)上，改變P188用量，分別為3%、5%、8%、10%、15%制備凝膠。結(jié)果見圖3 D，P188在3%～15%用量范圍內(nèi)均能使膠凝溫度升高，但其升高溫度的作用在此范圍內(nèi)無明顯區(qū)別，即膠凝溫度沒有隨濃度增大而增大的趨勢(shì)。

圖4 不同P407用量、1,2-丙二醇用量、TP脂質(zhì)體用量及P188用量對(duì)膠凝溫度的影響

2.7 確定TP脂質(zhì)體溫敏凝膠的處方 根據(jù)2.6項(xiàng)的考察結(jié)果，確定1,2-丙二醇用量為3%，TP脂質(zhì)體為20%，苯扎溴銨為0.02%。為進(jìn)一步確定P407、P188的用量，分別選擇用量為16%、17%的P407和2%、3%、4%的P188進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)制備溫敏凝膠，并測(cè)定其膠凝溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

因該制劑應(yīng)用于口腔，用藥時(shí)需為膠凝狀態(tài)。由表中數(shù)據(jù)確定，當(dāng)P407 16%，P188 3%，苯扎溴銨0.02%，丙二醇3%，TP脂質(zhì)體20%時(shí)，其膠凝溫度為36.8℃。經(jīng)處方驗(yàn)證，該載有茶多酚脂質(zhì)體溫敏凝膠的膠凝溫度為36.3℃(n=3)，接近正常人口腔溫度(36.3～37.2)℃。因此，本實(shí)驗(yàn)制備的溫敏凝膠制劑適合局部遞送藥物。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜超聲分散法制備茶多酚脂質(zhì)體，簡單易行，穩(wěn)定性好。茶多酚脂溶性較差，將其制備成脂質(zhì)體，可利用脂質(zhì)體良好的透皮吸收特性，促進(jìn)藥物的吸收。采用高速離心法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，準(zhǔn)確率高，操作簡便。處方及制備工藝是影響脂質(zhì)體質(zhì)量的關(guān)鍵步驟，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：①EPC:TP變化是影響脂質(zhì)體包封率的主要因素，且EPC:TP為5∶1時(shí)，包封率最高，可能是由于包封茶多酚的脂質(zhì)體囊泡體積有限。②膽固醇可鑲嵌到磷脂膜中，調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性，減少磷脂的氧化，但是過量的膽固醇會(huì)使膜的形成變得困難，導(dǎo)致包封率降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)[17]，隨著磷脂與膽固醇比的增加，包封率會(huì)先升高再降低。③PBS緩沖液pH值約為6.0時(shí)，包封率最高。查閱文獻(xiàn)得知[18]，部分氫化的蛋黃卵磷脂在pH 6.5左右具有最大的穩(wěn)定性。④荷電脂質(zhì)體可以減少聚集和融合，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。Zeta電位是衡量電荷量的重要指標(biāo)。一般情況下，如果Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV，體系是穩(wěn)定的。本實(shí)驗(yàn)制備的脂質(zhì)體的Zeta電位值為-48.82，說明該脂質(zhì)體混懸液穩(wěn)定性良好。

由于脂質(zhì)體難以黏附在皮膚表面，而凝膠與皮膚接觸時(shí)，皮膚表層迅速被潤濕，藥物以被動(dòng)擴(kuò)散方式透過表皮，所以將TP脂質(zhì)體與溫敏凝膠相結(jié)合。脂質(zhì)體溫敏凝膠具有制備簡單，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，通過改變泊洛沙姆188和泊洛沙姆407的用量，使其在室溫時(shí)為溶膠，到達(dá)給藥部位后能迅速發(fā)生相轉(zhuǎn)變形成凝膠。利用凝膠載體的包封與阻滯作用[19]，可在皮膚表層形成藥物儲(chǔ)庫，延長藥物作用時(shí)間；同時(shí)借助其良好的黏附特性降低脂質(zhì)體的流動(dòng)性，防止藥物滲出脂質(zhì)體，增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，從而提高藥物生物利用度[20-21]，為茶多酚新劑型的臨床應(yīng)用提供參考。本實(shí)驗(yàn)制備的TP脂質(zhì)體溫敏凝膠成型性較好，與正常人的口腔溫度相近，是具有溫敏特性的凝膠溶液。但TP脂質(zhì)體以液體狀態(tài)存在，即使用量為80%時(shí)，凝膠的含藥量也較低。因此，后期研究中可先將TP脂質(zhì)體混懸液冷凍干燥后以脂質(zhì)體凍干粉制備TP脂質(zhì)體溫敏凝膠。TP脂質(zhì)體溫敏凝膠的藥效學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步研究。