加貝酯對腦缺血再灌注損傷大鼠的影響及機(jī)制研究

喬建新 劉熙鵬 劉 明 王靜輝 管超楠

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075000

腦缺血再灌注損傷是指缺血性腦血管病患者通過溶栓、介入手術(shù)等手段實(shí)現(xiàn)血流灌注后出現(xiàn)的缺血區(qū)腦組織損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響著該類患者的治療效果和生命健康，是臨床上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一[1]。近年來，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)許多合成或天然物質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)劑經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究，證明具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，但是由于動(dòng)物與人類生理機(jī)制及耐受性等方面的差異以及腦缺血后級聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜性，單一阻斷某一病理環(huán)節(jié)的藥物可能難以奏效，多數(shù)神經(jīng)保護(hù)劑未能在臨床得到廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)臨床和理論的嚴(yán)重脫節(jié)。所以在目前的臨床治療中，理想的神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)該具備針對缺血再灌注損傷多個(gè)損傷環(huán)節(jié)發(fā)揮保護(hù)作用的特性[2-3]。加貝酯作為一種非肽類蛋白水解酶抑制劑，近年來在改善缺血方面的作用備受關(guān)注[4]。本研究重點(diǎn)探討加貝酯是否對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用并探討其機(jī)制，形成科研成果，為加貝酯應(yīng)用于腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供臨床前研究數(shù)據(jù)，為腦缺血再灌注損傷的治療提供新的治療方案，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取河北北方學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室125 只實(shí)驗(yàn)用清潔級雄性SD 大鼠，鼠齡7 周，體質(zhì)量200～2420 g，清潔級，室溫環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，由乾元浩生物股份有限公司提供。動(dòng)物許可證號：SCXK（豫）2018-0001。本研究已通過河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核并得到批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號（科）倫審第〔2019〕107 號］。

1.1.2 藥品與試劑 加貝酯（常州四藥制藥有限公司，規(guī)格：0.1 g，批號：201936854）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所（批號：2013685），Tunel 檢測試劑盒購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司（批號：2015227）；丙二醛（MDA）水平采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒美國CST（批號：2018429）；相關(guān)基因[B 細(xì)胞淋巴瘤因子2（bcl-2）mRNA、水溶性相關(guān)蛋白（Bax）mRNA] 表達(dá)及相關(guān)蛋白[半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、核因子κB（NF-κB）] 試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich 公司（批號：2016594）。

1.1.3 儀器 BX53M 光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司；Mini-Sub 電泳儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建 選取125 只實(shí)驗(yàn)用清潔級雄性SD 大鼠采用改良線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，制備流程：2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉沙土鼠，5～10 min 后將動(dòng)物固定于手術(shù)臺上，沿腹部頸中線開一口，分離兩側(cè)腺體及頸肌，暴露氣管及左右兩頸動(dòng)脈，將頸動(dòng)脈與神經(jīng)分離，穿線備用，雙側(cè)同時(shí)進(jìn)行無創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉5 min，然后松開血夾恢復(fù)血流，再灌注72 h。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、加貝酯高中低劑量組，每組25 只，其中加貝酯低、中、高劑量組分別經(jīng)腹腔注射加貝酯25、50、75 mg 進(jìn)行干預(yù)治療。假手術(shù)組和模型組同步給予等體積生理鹽水。

1.2.3 觀察指標(biāo) 治療滿療程后，行盲法神經(jīng)功能評分[5]，取大鼠腦組織測定其含水量和梗死體積，石蠟包埋，切片處理后行HE 染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化；行TUNEL 染色觀察大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況；測定大鼠腦組織中抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）] 的活性并測定MDA 水平，測定大鼠腦組織中炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）] 水平，測定大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因（bcl-2 mRNA、Bax mRNA）表達(dá)及相關(guān)蛋白（Caspase-3、NF-κB）表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

模型組神經(jīng)功能缺損評分低于假手術(shù)組，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評分高于加貝酯低劑量組，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于加貝酯低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯高劑量組神經(jīng)功能缺損評分高于加貝酯中劑量組，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于加貝酯中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評分高于模型組，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化

與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)細(xì)胞萎縮，胞質(zhì)與胞核、核仁均縮小、模糊，合并大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，加貝酯低、中劑量組的仍有大量神經(jīng)細(xì)胞萎縮，胞質(zhì)與胞核、核仁均縮小、模糊，且存在一定炎癥細(xì)胞，但尚有小部分神經(jīng)細(xì)胞功能正常；而加貝酯高劑量組僅有小部分神經(jīng)細(xì)胞萎縮、模糊，大部分的神經(jīng)細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核正常，且炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯降低。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE 染色，100×）

2.3 各組大鼠腦組織MDA 和抗氧化酶活性比較

模型組MDA、SOD、CAT 水平高于假手術(shù)組，GSHPx 水平低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組MDA、SOD 水平高于加貝酯低劑量組，GSH-Px、CAT 水平低于加貝酯低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯高劑量組MDA、SOD 水平高于加貝酯中劑量組，GSH-Px、CAT 水平低于加貝酯中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組MDA、SOD 水平高于模型組，CAT 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯低劑量組GSH-Px 水平高于模型組，加貝酯中、高劑量組GSHPx 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較

模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于加貝酯低劑量組，加貝酯高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于加貝酯中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

2.5 各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)比較

模型組Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均高于假手術(shù)組，bcl-2 mRNA、質(zhì)NF-κB 均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均低于加貝酯低劑量組，bcl-2 mRNA、質(zhì)NF-κB 均高于加貝酯低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯高劑量組Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均低于加貝酯中劑量組，bcl-2 mRNA、質(zhì)NF-κB 均高于加貝酯中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組bcl-2 mRNA、質(zhì)NF-κB 均高于模型組，Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表4。

表2 各組大鼠腦組織MDA 和抗氧化酶活性比較（）

表2 各組大鼠腦組織MDA 和抗氧化酶活性比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05。MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSHPx：谷胱甘肽過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（）

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白細(xì)胞介素1β；IL-6：白細(xì)胞介素6

3 討論

隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及勞動(dòng)強(qiáng)度的降低，尤其是高血壓、高血脂、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等基礎(chǔ)疾病患病人數(shù)的增多，腦血管病發(fā)病率逐年升高，尤其隨著我國人口老齡化的加劇，我國腦血管病致死率已躍居疾病譜首位[6-7]。根據(jù)最新的流行病學(xué)資料顯示[8]，在我國每年新發(fā)生的250 萬例腦血管病患者中，河北省是腦血管病發(fā)病大省。腦血管病分出血性和缺血性腦血管病兩大類，其中缺血性腦血管病最為普遍（約占75%），缺血性腦血管病造成的死亡率僅次于心臟疾病，在我國國民的死亡原因統(tǒng)計(jì)中腦血管病已位列第2 位[9-10]。腦缺血梗死后可引起的認(rèn)知功能障礙、血管性癡呆等并發(fā)癥，存活者中約2/3致殘，且5 年復(fù)發(fā)率高達(dá)41%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，已逐漸發(fā)展成為危害人類生命健康的主要疾病之一，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，且近年來逐漸有年輕化的趨勢[11-12]。

腦組織發(fā)生缺血后及時(shí)通過溶栓、介入手術(shù)等治療手段恢復(fù)血供，挽救缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞是治療目的，也是目前臨床上在缺血性腦血管病康復(fù)治療中的首選治療手段[13-14]。未接受溶栓治療者腦組織中若腦血管出現(xiàn)自然再通有可能引起過度再灌注，而接受溶栓治療者血管再通可達(dá)到部分有效再灌注，但部分患者在實(shí)現(xiàn)血流再灌注后不僅沒有使組織功能恢復(fù)，反而使缺血所致的功能障礙和腦組織結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，即腦缺血再灌注損傷[15]。其主要由于微血管結(jié)構(gòu)與功能完整性出現(xiàn)損傷，血腦屏障破壞、自身調(diào)節(jié)衰竭，同樣可能發(fā)生瀑布式神經(jīng)損傷級聯(lián)反應(yīng)所造成[3]。缺血再灌注并發(fā)癥的存在嚴(yán)重影響缺血性腦血管病患者的預(yù)后，因此以抑制缺血再灌注損傷為切入點(diǎn)，研究降低腦缺血再灌注并發(fā)癥損傷的藥物及治療方法，對于臨床上解決腦缺血再灌注損傷具有積極推動(dòng)意義[16-17]。缺血性腦血管病包括局灶性腦缺血和全腦缺血兩種類型，以前者較為多見，多由腦血管栓塞所致，因此本研究選擇局灶性腦缺血為研究疾病。而加貝酯是一種非肽類蛋白水解酶抑制劑，可抑制胰蛋白酶、激肽釋放酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶等蛋白酶的活性，從而制止這些酶所造成的病理生理變化，是臨床上急性輕型（水腫型）胰腺炎的常用藥物[18-19]。近年來藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，加貝酯對肝臟、小腸、肺組織缺血再灌注損傷動(dòng)物模型均具有一定的保護(hù)作用，具有良好的開發(fā)前景和廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用加貝酯的大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，腦組織病理損傷改善，提示加貝酯可降低神經(jīng)損傷，對腦缺血后腦損傷有保護(hù)作用[22-23]。另外調(diào)查大鼠腦組織抗氧化酶活性及脂質(zhì)氧化含量、炎癥因子、凋亡相關(guān)基因和蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，采用加貝酯的大鼠MDA、SOD、GSH-Px 均顯著升高，TNF-α、IL-1β、IL-6、CAT 均顯著降低，Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均顯著降低，bcl-2 mRNA、質(zhì)NF-κB 均顯著升高。由于細(xì)胞凋亡是腦缺血疾病細(xì)胞死亡的主要原因[24]，而本研究提示，加貝酯能抑制Caspase-3 凋亡通路激活，同時(shí)能抑制NF-κB 通路對缺血后腦損傷起保護(hù)作用。

表4 各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05。Caspase-3：半胱氨酸蛋白酶3；bcl-2：B 細(xì)胞淋巴瘤因子2；Bax：水溶性相關(guān)蛋白；NF-κB：核因子κB

綜上所述，加貝酯能有效減輕大鼠腦缺血再灌注所致的病理損傷程度，能夠抑制再灌注后脂質(zhì)氧化反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)能夠減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的損傷，而以上作用可能是通過抑制NF-κB 信號通路，提高抗氧化酶活性，以降低腦組織炎癥損傷及神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡所致。