藜麥蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化

馬洪鑫，劉粟心，楊許花，郭鵬輝，高丹丹*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730124；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅蘭州730030）

藜麥（Chenopodium quinoa Wild.）又名奎藜、灰米、金谷子等，是藜科一年生草本開花植物。藜麥原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈的哥倫比亞、厄瓜多爾、秘魯?shù)戎懈吆０紊絽^(qū)等地[1]。1987 年，藜麥在我國(guó)西藏地區(qū)引進(jìn)種植，現(xiàn)已在山西、吉林、青海、甘肅等地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化種植[2]。研究表明，藜麥含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白（大部分為白蛋白和球蛋白），其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于一般谷物，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到12%～23%[3]。與水稻相比，其必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)的含量更高，是具有較高營(yíng)養(yǎng)特性的谷類食品，還富含多酚等抗氧化物[4]。由于其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，藜麥被FAO 認(rèn)定為非轉(zhuǎn)基因營(yíng)養(yǎng)食品，被稱為“營(yíng)養(yǎng)黃金”。NASA 也將其列為宇航員的理想食物。因此，藜麥因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在食品界擁有巨大的應(yīng)用潛能。

目前對(duì)藜麥總蛋白的提取方法主要有堿溶酸沉法、酶法、復(fù)合提取法等，其中堿溶酸沉法為目前最主要的提取方法。目前國(guó)內(nèi)外的研究中，主要利用正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化藜麥總蛋白的提取，但正交實(shí)驗(yàn)只能分析離散型數(shù)據(jù)，具有精確度不高、預(yù)測(cè)性較差等缺點(diǎn)。而響應(yīng)面法采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，能得到高精度的回歸方程，可進(jìn)行合理預(yù)測(cè)來找出最佳工藝條件。本實(shí)驗(yàn)采用堿溶酸沉法進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，采用單因素和響應(yīng)面法對(duì)蛋白質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為研發(fā)藜麥生物制品提供理論支持和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥（產(chǎn)地青海，由青海新綠康食品公司提供）；氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸、酚酞、乙醇、氯化氫、氯化鈉（均為國(guó)產(chǎn)分析純）；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀（日立高新技術(shù)公司），X1R 冷凍離心機(jī)、Multiskan GO 多功能讀數(shù)儀（美國(guó)Thermo 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥蛋白提取工藝流程 藜麥→除皂苷→干燥（50℃）→粉碎過篩（100 目）→正己烷脫脂→干燥（50℃）→藜麥粉加水→調(diào)pH 至堿性→適宜溫度下浸提一段時(shí)間→離心（4 500 r/min，10 min）→上清液加鹽酸調(diào)pH 至等電點(diǎn)→沉淀→水洗→離心→冷凍干燥→蛋白質(zhì)干粉。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定 采用凱氏定氮法[5]分別測(cè)定藜麥粉中、藜麥提取液中的蛋白質(zhì)含量，其公式如下：

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 藜麥蛋白質(zhì)的基本提取條件：料液比1∶15，pH 為11，溫度45℃，提取時(shí)間3 h。每個(gè)參數(shù)的變化如下：溫度：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃；料液比：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；pH：7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12；時(shí)間：0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別確定各提取條件的自變量，采用響應(yīng)面[6]設(shè)計(jì)，對(duì)藜麥蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，其實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與因素水平

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s 表示，用Origin 2018 和Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥蛋白質(zhì)提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖1 可知，蛋白質(zhì)提取率隨溫度升高先增大后減小，在45℃時(shí)蛋白質(zhì)提取率最大。因溫度小幅度升高，使蛋白質(zhì)溶解度增大，因堿性條件會(huì)促進(jìn)藜麥淀粉的糊化[7]，所以當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，藜麥淀粉顆粒吸水膨脹甚至發(fā)生糊化，使體系黏稠，不利于蛋白質(zhì)的溶出，同時(shí)溫度升高會(huì)引起部分蛋白質(zhì)變性，影響了藜麥蛋白的溶解性，從而使提取率下降。與袁詩涵等[8]研究不同，他們從黃米中提取的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)隨溫度的升高，黃米蛋白提取率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，但變化幅度較小。主要是由于黃米中耐熱蛋白質(zhì)含量較多，其耐熱蛋白質(zhì)會(huì)隨著溫度升高而溶出量增大，導(dǎo)致提取率增加。

圖1 溫度對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響

圖2 料液比對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)料液比從1∶5 上升至1∶30 時(shí)，藜麥蛋白的提取率不斷升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25 之后，提取率比變化不大。這與高丹丹等[9]的研究結(jié)果一致，他們從棉籽中提取蛋白質(zhì)，提取率隨料液比的增大而升高，當(dāng)?shù)竭_(dá)1∶25 后，其提取率雖然升高，但基本趨于穩(wěn)定，且料液比太大會(huì)使產(chǎn)品成本增加，加大后續(xù)處理的負(fù)擔(dān)，因此本研究選取料液比1∶25 進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。

2.1.3 pH 值對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，蛋白質(zhì)提取率隨pH 增加而增大，當(dāng)增至11時(shí)，其提取率達(dá)到最大，比pH 為7.5 時(shí)高34.71%。堿性環(huán)境會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的次級(jí)鍵產(chǎn)生破壞作用，發(fā)生酸式解離，使分子表面帶相同電荷，從而使蛋白質(zhì)溶出量增加，這種增溶作用隨pH 的升高而增大[10]。綜上，pH 選取在11 為宜。

圖3 pH 值對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)藜麥蛋白質(zhì)的影響 由圖4 可知，蛋白質(zhì)提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，在0.5～2.0 h 提取率升高變化較大，2.0 h 之后提取率增加趨勢(shì)緩慢，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所需耗能增加，生產(chǎn)成本與周期增大，故選擇時(shí)間范圍為3.0 h。趙東霞等[11]從大豆中提取水溶性蛋白質(zhì)，其提取率隨時(shí)間的增加先增大后減小，其研究結(jié)果與本研究略有不同，主要是由于水溶性蛋白的增加使溶出量達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，因此出現(xiàn)提取率降低的狀態(tài)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)藜麥蛋白質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性分析 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，其響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Benhnken原理設(shè)計(jì)了29 組試驗(yàn)，其響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用響應(yīng)面軟件對(duì)表2 結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對(duì)溫度（A）、料液比（B）、pH（C）、時(shí)間（D）等4 個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程（Y 代表蛋白質(zhì)提取率）：Y=76.50+0.46 A+0.47 B+0.81 C+1.64 D+0.27 AB+0.47 AC-0.15 AD+0.77 BC-0.13 BD+0.045 CD-4.96 A2-3.44 B2-4.97 C2-4.02 D2。

其實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著性分析見表3。模型F 值為47.11（P＜0.000 1），說明回歸模型是極顯著的。B、C、D、A2、B2、C2、D2的P 值均小于0.05，說明這些是顯著的模擬項(xiàng)。由表3 可知，各因素對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響順序?yàn)闀r(shí)間＞pH＞料液比＞溫度。該模型的R2值是0.979 2，表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，說明該模型建立的回歸方程能夠較好地預(yù)測(cè)藜麥蛋白質(zhì)提取工藝。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 自變量與響應(yīng)值之間的二維等高線和三維曲面圖如圖5 所示。

在2 個(gè)變量變化，另一個(gè)變量保持在中間水平不變的情況下，考察交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響，評(píng)價(jià)自變量對(duì)藜麥蛋白提取率影響的交互作用。在3D 圖中，圖形的坡度表明響應(yīng)指標(biāo)對(duì)響應(yīng)因素的敏感度。由圖5 中可看出，隨料液比和pH 的增大，蛋白提取率先增大后降低，說明試驗(yàn)范圍內(nèi)存在藜麥蛋白質(zhì)提取的最佳條件，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠摋l件，都會(huì)影響蛋白提取率。同樣對(duì)于料液比、提取溫度、pH、提取時(shí)間各因素兩兩交互影響條件中均存在最佳提取條件。說明試驗(yàn)所選擇因素水平范圍中存在最優(yōu)蛋白提取條件組合，使得藜麥蛋白的提取效果達(dá)到最優(yōu)。

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面軟件分析結(jié)果，獲得藜麥蛋白提取率最高時(shí)的各因素最佳反應(yīng)條件為溫度為45℃，料液比為1∶25 g/ml，pH 為10.5，時(shí)間為2.5 h，在此條件下，藜麥蛋白提取率為76.50%，為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可信度，在此最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得蛋白提取率為76.69%，76.87%，76.95%，平均值為（76.84±0.11）%，該實(shí)測(cè)值與理論值的誤差小于±1%，由此可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的藜麥蛋白提取率的情況。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法建立了藜麥蛋白提取的二次方程，顯著性分析得到影響藜麥蛋白提取率的因素依次為時(shí)間＞pH＞料液比＞溫度；確定了藜麥蛋白的最佳提取條件：溫度為45℃，液料比為1∶25 g/ml，pH為10.5，提取時(shí)間為2.5 h，且此條件下蛋白質(zhì)最大提取率為（76.84±0.11）%，與理論值較為接近，表明響應(yīng)面預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型對(duì)其工藝優(yōu)化具有可行性。然而關(guān)于藜麥蛋白的營(yíng)養(yǎng)安全和加工工藝特性還有待深入研究。藜麥作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白，研究其提取工藝可為藜麥蛋白質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，還可以通過酶法改性擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，充分挖掘其潛在的商業(yè)價(jià)值，以滿足消費(fèi)需求。

圖5 各因素交互作用對(duì)藜麥蛋白質(zhì)提取率的影響