中國成年吸煙者吸煙行為調(diào)查和煙氣有害成分暴露評估

趙俊偉，趙閣，華辰鳳，尚平平，李翔，王昇，張曉曦，謝復(fù)煒*，欒榮生，劉惠民

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001

2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，成都市人民南路三段16號610041

吸煙有害健康。雖然基于吸煙機測試的卷煙煙氣釋放量的結(jié)果提示，低焦油卷煙可能會降低吸煙者的有害物質(zhì)暴露［1］，然而由于吸煙機抽吸方式與吸煙者實際吸煙行為存在一定差異，因此該結(jié)果并不被衛(wèi)生部門所認(rèn)可［2］。暴露生物標(biāo)志物（Biomarkers of exposure，BoE）可反映吸煙者有害物質(zhì)實際暴露量，已被用于煙草制品風(fēng)險評估［3-6］，并被用于研究低焦油卷煙是否能夠降低煙氣有害成分暴露量。用于評估的有害成分主要包括煙堿、煙草特有亞硝胺（TSNAs）、多環(huán)芳烴（PAHs）、揮發(fā)性有機物、揮發(fā)性羰基物、丙烯酰胺和氰化氫（HCN）等［6-9］。Mendes等［6］的研究結(jié)果表明，煙堿、TSNAs、芘、丙烯醛、1,3-丁二烯等有害成分的暴露生物標(biāo)志物，在低焦油組人群尿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。Shepperd等［10］的研究結(jié)果顯示，吸煙者轉(zhuǎn)抽低焦油卷煙，丙烯醛暴露量顯著降低。Hagedorn等［11］研究發(fā)現(xiàn)，與抽吸4或10 mg/支盒標(biāo)焦油量的卷煙相比，抽吸1 mg/支的吸煙者尿液中的多個PAHs生物標(biāo)志物，例如，1-羥基萘、2-羥基萘、1-羥基芘和2-羥基芴的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。這些研究結(jié)果表明，吸煙者抽吸低焦油卷煙，能夠降低有害成分暴露量。然而，Hecht等［7］的研究表明，卷煙焦油量與生物標(biāo)志物暴露量之間沒有明顯相關(guān)性。還有其他研究表明，吸煙者抽吸低焦油卷煙時，除增加每口的抽吸深度外，還會通過增加抽吸口數(shù)和頻度來進行完全或部分補償吸煙［12-13］。Scherer等［5］的研究顯示，卷煙焦油量對吸煙者實際吸煙量的影響很小，甚至沒有影響。Benowitz等［14］的研究表明，所謂的“淡味”卷煙不可能降低吸煙者的健康風(fēng)險。這些研究結(jié)論存在矛盾，可能是由于不同研究中生物標(biāo)志物分析方法、涉及的卷煙設(shè)計、選擇的吸煙者群體以及不同人群文化和生活方式等因素存在差異造成的。

目前，中國吸煙者大規(guī)模吸煙行為和生物標(biāo)志物的人群研究鮮有報道。其中，GAN等［15］的研究中，招募了543名抽吸不同焦油量卷煙的吸煙者，考察了煙堿和一些致癌物的暴露量，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸煙者尿液中可替寧、反-3′-羥基可替寧和多環(huán)芳烴暴露量與卷煙焦油量沒有相關(guān)性。然而，該研究檢測的生物標(biāo)志物數(shù)量有限，且僅分析了部分人群樣本，同時也沒有考慮人口學(xué)特征和吸煙行為等因素的影響。因此，采用吸煙行為問卷調(diào)查和30多種暴露生物標(biāo)志物（煙堿、TSNAs、PAHs、揮發(fā)性有機物、揮發(fā)性醛類等）研究了435名中國成年吸煙者的吸煙行為和生物標(biāo)志物暴露量，旨在客觀評價不同焦油量吸煙者的吸煙行為及其影響因素，為低焦油卷煙的風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙堿（NIC）、可替寧（COT）、可替寧糖苷（COT-G）、降煙堿（NNIC）、降可替寧（NCOT）、煙堿氮氧化物（NNO）、可替寧氮氧化物（CNO）、反-3′-羥基可替寧（OHCOT）、反-3′-羥基可替寧糖苷（OHCOT-G）、NIC-d3、COT-d3、OHCOT-d3、NIC-G-d3、COT-G-d3、OHCOT-G-d3、NNIC-d3、NCOT-d3、CNO-d3、NNO-d3、NNN、NAB、NAT、NNAL、NNN-d4、NAB-d4、NAT-d4、NNAL-d3、1-羥基萘（1-OHNap）、2-羥基萘（2-OHNap）、1-羥基芘（1-OHPyr）、3-羥基芴（3-OHFlu）、1-羥基菲（1-OHPhe）、2-羥基菲（2-OHPhe）、3-羥基菲（3-OHPhe）、4-羥基菲（4-OHPhe）、9-羥基菲（9-OHPhe）、2-羥基芴（2-OHFlu）、1-OHPyr-d9、3-OHPhe-d9、2-OHFlu-d9、1-OHNap-d8、2-氨基噻唑啉-4-羧酸（ATCA）、13C-14N2-ATCA、苯巰基尿酸（SPMA）、SPMA-d5、丁烯二醇巰基尿酸（DHBMA）、丁烯醇巰基尿酸（MHMBA）、DHBMA-d7、MHBMA-d6、3-羥基丙基巰基尿酸（3-HPMA）、3-HPMA-d3、3-羥基甲基丙基巰基尿酸（3-HMPMA）、3-HMPMA-d3、N-乙?；?S-（2-羧乙基）半胱氨酸（CEMA）、CEMA-d3、N-乙?；?S-（2-羥乙基）半胱氨酸（HEMA）、HEMA-d3、N-乙?；?S-（2-氨基甲?；┌腚装彼幔ˋAMA）、AAMA-d4、N-乙酰基-S-（2-氨基甲?；?2-羥乙基）半胱氨酸（GAMA）、GAMA-d3等標(biāo)樣均購自加拿大TRC試劑公司；甲醇、乙腈（色譜純，美國Baker公司）；β-葡糖苷酸/芳基硫酸酯酶（美國Sigma公司）；甲酸、甲酸銨、醋酸銨（色譜純，美國Tedia公司）。

API4000高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；CP2245分析天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；Milli-Q50超純水儀（美國Millipore公司）；N-EVAPTM 112氮吹儀（美國Organomation公司）；THS-10精密型超級恒溫槽（寧波天恒儀器廠）；Zorbax Hilic plus色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm，美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計

本研究中采用橫斷面研究方法［6］。在四川成都招募435名志愿者，根據(jù)志愿者實際抽吸卷煙的盒標(biāo)焦油量進行分組，其中高焦油組（焦油量9～11 mg/支）207名，中焦油組（焦油量7～8 mg/支）70名，低焦油組（焦油量1～6 mg/支）51名及非吸煙組107名。采用調(diào)查問卷的方式，調(diào)查志愿者的人口學(xué)特征、吸煙行為和煙堿依賴等信息，并收集其24 h內(nèi)的尿液。整個研究過程中采用多種措施進行質(zhì)量控制，包括征求專家意見設(shè)計調(diào)查問卷；對調(diào)查人員進行集中培訓(xùn)以確保調(diào)查方式的一致性；調(diào)查數(shù)據(jù)由訓(xùn)練有素的人員進行雙重數(shù)據(jù)錄入，即同一份問卷由兩名人員錄入，在數(shù)據(jù)庫中比對錄入的數(shù)據(jù)結(jié)果，若一致則直接錄入數(shù)據(jù)庫，不一致則轉(zhuǎn)至質(zhì)檢人員進行核對后再導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，避免1人錄入問卷數(shù)據(jù)可能存在的錯誤，確保數(shù)據(jù)錄入質(zhì)量。本研究通過了四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，志愿者均簽署了知情同意書。

1.2.2 研究對象

招募符合納入標(biāo)準(zhǔn)的志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)（需同時滿足）：①年齡18～65周歲；②過去6個月每日吸煙量至少5支；③無心血管、呼吸或神經(jīng)系統(tǒng)疾病史；④過去一年內(nèi)未接受過任何精神疾病治療；⑤近一周內(nèi)未服用任何藥物；⑥能遵守研究規(guī)定，并提供尿液樣本。

1.2.3 問卷調(diào)查

問卷調(diào)查獲取志愿者的基線資料［7］和吸煙行為數(shù)據(jù)。問卷內(nèi)容包括：①人口學(xué)特征，包括年齡、性別、身高、體質(zhì)量、職業(yè)、收入和文化程度等；②煙堿依賴Fagerstr?m量表（FTND）［16］，用于評價煙堿依賴程度；③吸煙行為數(shù)據(jù)，包括吸煙支數(shù)、吸入深度、抽吸間隔等。

1.2.4 生物標(biāo)志物分析

表1為32種有代表性的有害成分暴露生物標(biāo)志物信息。采用尿肌酐校正測試結(jié)果。使用氘代內(nèi)標(biāo)，所有生物標(biāo)記物均通過HPLC-MS/MS和API 4000或5500質(zhì)譜檢測器進行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式分析。煙堿、TSNAs為正離子檢測模式；PAHs、揮發(fā)性羰基物、揮發(fā)性有機物、HCN和丙烯酰胺為負(fù)離子檢測模式。生物標(biāo)志物分析方法如下。

表1 煙氣有害成分生物標(biāo)志物Tab.1 Biomarkers of toxicants in cigarette smoke

總煙堿代謝物（NE）：使用實驗室前期開發(fā)的方法［17］測定煙堿及其9種主要代謝物。以所有代謝物的摩爾濃度總和［以煙堿總代謝物（NEq）表示］為煙堿總暴露量。

TSNAs的生物標(biāo)志物：根據(jù)Kavvadias等［18］的方法，采用ESI-HPLC-MS/MS法測定。樣品用β-葡萄糖醛酸苷酶酶解，然后通過MIP-TSNAs SPE方法進行凈化［18］。4種分析物的定量限（LOQ）范圍為2.0～5.0 pg/mL。

PAHs的生物標(biāo)志物：羥基化的PAHs被用作其生物標(biāo)志物，本研究中采用Chetiyanukornkul等［19］報道的SPE-HPLC-MS/MS方法進行測定。用β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶將樣品酶解，并用硅藻土柱凈化。10種檢測指標(biāo)的LOQ范圍為2～22 pg/mL。

巰基尿酸類化合物：揮發(fā)性有機物、丙烯醛、巴豆醛、丙烯酰胺和HCN的生物標(biāo)志物直接稀釋后，采用HPLC-MS/MS法同時進行分析。檢測指標(biāo) 包 括3-HPMA、3-HMPMA、SPMA、CEMA、HEMA、DHBMA、MHMBA、AAMA、GAMA和ATCA。以上檢測指標(biāo)的LOQ范圍為0.2～2.1 ng/mL。

1.2.5 指標(biāo)定義

吸煙者：持續(xù)抽吸卷煙6個月及以上，且每日吸煙量5支及以上的吸煙者。卷煙焦油量是指煙盒標(biāo)注的焦油量（吸煙機在ISO抽吸模式下的焦油量）。高煙堿依賴性是指Fagerstr?m煙堿依賴性（FTND）評分≥5。體質(zhì)指數(shù)（Body mass index，BMI）等于體質(zhì)量（kg）除以身高的平方（m2）。偏瘦：BMI＜18.5 kg/m2；正 常：23.9 kg/m2≥BMI≥18.5 kg/m2；偏胖：27.9 kg/m2≥BMI≥24.0 kg/m2；肥胖：BMI≥28.0 kg/m2。

1.2.6 統(tǒng)計分析

采用EpiData17.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用描述性統(tǒng)計方法對志愿者的基線資料進行分析，采用χ2檢驗分析性別、教育程度、職業(yè)、婚姻狀況等定性資料的組間差異，采用t檢驗、單因素方差分析（One-way analysis of variance）對年齡、吸煙量、BMI等定量資料進行組間差異分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對高、中、低焦油組以及非吸煙組的生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)進行差異分析，采用Dunnett-t檢驗進行組間兩兩比較。對于數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布的吸煙者組和非吸煙者組的生物標(biāo)志物的差異性分析，采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗方法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息

志愿者的基本信息見表2。共調(diào)查435名志愿者，平均年齡42.1歲，以男性為主（94.9%，413/435）。受教育程度以初中及以下為主（38.9%，169/435），其次為大專/本科（29.4 %，128/435）。婚姻狀況以已婚為主，占82.8%（360/435）。月收入以高于或等于4 000元/月為主（30.8%，134/435），其次為月收入2 000～2 999元 者（27.1%，118/435）。志愿者的年齡、性別、教育程度、職業(yè)和收入在不同焦油組間存在顯著差異（P＜0.05），而婚姻狀況和BMI均無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 志愿者基本信息①Tab.2 Characteristics of the subjects

2.2 吸煙者吸煙行為分析

不同焦油量吸煙者的吸煙行為數(shù)據(jù)見表3。不同焦油量吸煙者間的平均吸煙支數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。不同焦油量吸煙者中，5名吸煙者未應(yīng)答抽吸間隔，2名未應(yīng)答吸入深度和剩余煙蒂長度。抽吸間隔以10～19 s為主（37.5%，121/323）；吸入深度以肺部為主（60.1%，196/326），其次為喉部（27.6%，196/326）；剩余煙蒂長度以5～9 mm為主（38.3%，125/326），其 次 為＜5 mm（38.0%，124/326）。志愿者的平均吸煙支數(shù)、抽吸間隔、吸入深度、剩余煙蒂長度和煙堿依賴程度在不同焦油組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 不同焦油量吸煙者的吸煙行為①Tab.3 Self-reported smoking habit of smokers smoking cigarettes with different tar yields

2.3 吸煙者和非吸煙者尿樣中生物標(biāo)志物比較

吸煙者和非吸煙者尿樣中暴露生物標(biāo)志物比較結(jié)果見表4。大部分吸煙者尿樣中的生物標(biāo)志物濃度高于非吸煙者（P＜0.05）。32種生物標(biāo)志物比值（比值=吸煙者尿樣中生物標(biāo)志物的平均值/非吸煙者尿樣中生物標(biāo)志物的平均值）中，降序排列后的前5位是NIC（117.7）、NNO（55.8）、OHCOT（54.8）、NCOT（53.3）和煙堿總代謝產(chǎn)物（52.0）。吸煙者與非吸煙者間的MHBMA、3-OHPhe和ATCA無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 不同焦油量吸煙者尿樣中生物標(biāo)志物差異分析

不同焦油量吸煙者尿樣中暴露生物標(biāo)志物直方圖見圖1。其中，中焦油組與高焦油組相比，少數(shù)生物標(biāo)志物，例如，NIC-G及NNAL的總量顯著低于高焦油組，其他生物標(biāo)志物與高焦油組沒有顯著差異。

低焦油組與高焦油組相比，尿樣中的煙堿生物標(biāo)志物［總煙堿代謝物（P=0.009）、NIC（P=0.017）、COT-G（P=0.049）、OHCOT（P=0.028）、NNIC（P=0.002）］顯著降低；對于多環(huán)芳烴類化合物，2-OHNap（P=0.008）顯著低于高焦油組。其他化合物，例如，1-OHPyr（P=0.657）、3-OHPhe（P=0.605）等則無顯著性差異。對于羰基化合物，HMPMA（P＜0.001）、HPMA（P=0.001）顯著低于高焦油組。對于揮發(fā)性有機物，低焦油吸煙者尿液中HEMA（P=0.003）、DHBMA（P=0.005）顯著低于高焦油組。低焦油組的一些生物指標(biāo)甚至與非吸煙者組之間沒有顯著差異，例如，HEMA（P=0.133）和DHBMA（P=0.557）。

低焦油組與非吸煙者組相比，大部分生物標(biāo)志物顯著高于非吸煙者組（P＜0.05）。然而，AAMA（P=0.087）、GAMA（P=0.517）和ATCA（P=0.176）兩組之間無顯著差異。

3 討論

本研究中開展了不同焦油量中國吸煙人群的吸煙行為和有害成分暴露評估，是迄今為止較為全面、系統(tǒng)的橫斷面研究。對調(diào)查人群完成了包括人口統(tǒng)計學(xué)和吸煙行為的問卷調(diào)查。生物標(biāo)志物暴露評估涉及的卷煙煙氣有害成分包括煙堿、TSNAs、PAHs、揮發(fā)性羰基物、丙烯酰胺、揮發(fā)性有機物和HCN。

表4 吸煙者和非吸煙者尿樣中暴露生物標(biāo)志物比較Tab.4 Comparison of exposure biomarkers in urine from smokers and nonsmokers

人口信息統(tǒng)計分析表明，不同焦油量卷煙的使用情況與吸煙者的年齡、性別、受教育程度、職業(yè)、收入、飲酒量之間可能存在相關(guān)性，這與文獻［12,20-21］中的研究結(jié)果一致。受教育程度較低人群可能大多數(shù)從事非技術(shù)性工作，并可能存在大量或過量飲酒情況，這些群體傾向于選擇焦油量較高的卷煙。而受教育程度相對較高的年輕吸煙者和有戒煙史的人群傾向于選擇焦油量較低的卷煙。

人群吸煙行為研究結(jié)果顯示，抽吸不同焦油量卷煙的吸煙者的吸煙支數(shù)、抽吸間隔、煙蒂長度和煙堿依賴性之間無顯著性差異。這一結(jié)論與Dixon等［22］的結(jié)果一致，卷煙焦油量不會影響吸煙者的抽吸行為。但也有研究表明，吸煙者在消費較低焦油量的卷煙時，會部分或完全出現(xiàn)補償行為［9,12,23-24］。研究結(jié)果存在差異的原因可能有兩個：一是由于不同人種的煙堿代謝不同，中國吸煙者的吸煙行為可能與西方國家存在差異［25］；二是本次研究是基于問卷調(diào)查，與實際測試獲得的結(jié)果可能存在差異［26-27］。本研究結(jié)果表明，不同的焦油量并不會顯著影響吸煙者的吸煙行為。

圖1 不同焦油量吸煙者尿樣中煙堿、TSNAs、PAHs、揮發(fā)性羰基化合物、揮發(fā)性有機物和AM的生物標(biāo)志物直方圖Fig.1 Box plots of biomarkers of nicotine,TSNAs,PAHs,volatile carbonyl compounds,VOCs,and AM in the urine of smokers

吸煙者組和非吸煙者組尿樣中的生物標(biāo)志物測試結(jié)果顯示，MHBMA、3-OHPhe或ATCA在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。PAHs、HCN和揮發(fā)性有機物在環(huán)境中廣泛分布，可能通過職業(yè)暴露、吸煙和飲食進入體內(nèi)［28］，導(dǎo)致非吸煙者組尿樣中也可檢測到這些生物標(biāo)志物，吸煙可能不是這些有害成分的主要來源，因此吸煙者組和非吸煙者組尿樣中這些有害成分的生物標(biāo)志物不存在顯著性差異。吸煙者組尿樣中的生物標(biāo)志物包括NIC、NNO、OHCOT和NCOT等，煙堿總代謝物、NNAL的平均總量水平是非吸煙者組的10倍以上，表明吸煙是煙堿和TSNAs暴露的主要原因［3,5,10,29-31］。TSNAs為煙草特有成分，非吸煙者尿液中部分檢測到的TSNAs可能是通過被動吸煙暴露造成的，部分研究也有相關(guān)報道［6,29］。

不同焦油量吸煙者的尿樣生物標(biāo)志物分析結(jié)果顯示，與高焦油組比較，中焦油組吸煙者尿樣中的總NNAL和NAT顯著低于高焦油量組，研究結(jié)果與之前的報道一致［5,29］，其他化合物則無顯著性差異；低焦油組吸煙者的多種生物標(biāo)志物顯著降低。煙堿總代謝物、NIC、NNIC、OHCOT、COT-G和NIC-G顯著低于高焦油組，與文獻［6］的報道一致；對于TSNAs生物標(biāo)志物，盡管低焦油組平均值較低，但與高焦油組無明顯差異。對于PAHs生物標(biāo)志物，低焦油組尿液中2-OHNap的濃度明顯低于高焦油組，與之前的研究一致［11］。1-OHNap則無顯著差異。1-OHNap［5,32］和2-OHNap［11,33］常用作芘暴露的生物標(biāo)志物，兩種化合物顯著性差異結(jié)果可能是由敏感度差異引起的，2-OHNap比1-OHNap更敏感；HPMA和HMPMA是丙烯醛和巴豆醛的代謝產(chǎn)物［33］。本研究結(jié)果表明，低焦油組尿樣中HPMA、HMPMA和CEMA均顯著低于高焦油組；對于揮發(fā)性有機物，低焦油組的DHBMA和HEMA水 平顯著降 低，而MHBMA的水平無顯著差異。DHBMA和MHBMA均為1,3-丁二烯暴露生物標(biāo)志物。在本研究中，與MHBMA相比，DHBMA作為1,3-丁二烯暴露生物標(biāo)志物可能更為敏感；對于丙烯酰胺，低焦油組的GAMA水平也顯著降低，AAMA無顯著性差異?？傮w上，與高焦油組相比，低焦油組1,3-丁二烯、環(huán)氧乙烷、丙烯腈和丙烯酰胺暴露顯著降低。

低焦油組的2-OHNap、1-OHPyr、3-OHPhe、MHBMA、HEMA、DHBMA、AAMA、GAMA和ATCA與非吸煙者組相當(dāng)，這是由于環(huán)境中同樣存在多環(huán)芳烴、揮發(fā)性成分、丙烯酰胺和HCN，低焦油卷煙暴露與非吸煙者環(huán)境暴露相當(dāng)［8］。低焦油組其他大多數(shù)生物標(biāo)志物高于非吸煙組。

與干預(yù)研究相比，本研究中采用橫斷面研究方法，通過問卷調(diào)查獲取相關(guān)信息，獲得的吸煙者抽吸高焦油卷煙或低焦油卷煙的論證強度較弱，獲得的吸煙行為信息未考慮潛在的回憶偏倚，且未使用儀器準(zhǔn)確測試。因此，將來會結(jié)合自我報告和實際吸煙行為測試，獲得準(zhǔn)確的抽吸參數(shù)；通過檢測抽吸后的濾嘴評估焦油和煙堿的釋放量，以獲得實際測量數(shù)據(jù)。抽吸低焦油卷煙的吸煙者體內(nèi)有害成分暴露量低，是否會影響機體生物效應(yīng)尚不明晰，需要進一步開展效應(yīng)生物標(biāo)志物與有害成分暴露的相關(guān)性研究。

4 結(jié)論

中國不同焦油量吸煙人群吸煙行為和有害成分暴露評估研究結(jié)果表明：①卷煙抽吸者的吸煙行為受年齡、性別、文化程度、職業(yè)及收入等因素影響。②卷煙焦油量不是影響吸煙者抽吸支數(shù)、抽吸間隔、吸入深度和濾嘴保留長度等吸煙行為的主要因素。③抽吸低焦油卷煙吸煙者尿液中部分有害成分（煙堿、TSNAs、1,3-丁二烯、苯、丙烯醛、巴豆醛等）暴露量較低。