萬壽菊秸稈熏蒸對煙株根際土壤原核微生物群落的影響

黎妍妍，李錫宏*，王林，馮吉，張英，尹忠春

1.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢市硚口區(qū)寶豐路6號香溢大酒店4樓430030

2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢市東西湖區(qū)金山大道1355號430040

3.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119號445000

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，目前連作是我國煙草生產(chǎn)中的主要種植制度。煙草連作障礙在我國煙葉種植區(qū)普遍存在，且與根際土壤微生物區(qū)系的惡化密切相關(guān)。長期連作可降低土壤微生物活性，改變土壤微生物多樣性，引起土壤中微生物選擇性富集，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［1-2］，造成植物-土壤-微生物形成的相互依賴的生態(tài)系統(tǒng)失衡；而根際微生態(tài)失衡又會進(jìn)一步引起土壤環(huán)境惡化和病原菌的大量繁殖，使連作障礙加劇。近年來，通過生物熏蒸來緩解連作障礙已成為研究熱點(diǎn)之一。蕓薹屬植物、綠肥等常被用作生物熏蒸材料［3-4］。Lazzeri等［5］、Seigies等［6］和趙衛(wèi)松等［7］將蕓薹屬植物殘體加入土壤中，發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落得到明顯改善，有益微生物的相對豐度增加；沈桂花［8］研究表明，采用黑麥草、油菜和紫云英等進(jìn)行生物熏蒸可提高植煙土壤微生物代謝活性；劉昕昕［9］將高硫芥菜用于熏蒸設(shè)施連作黃瓜土壤，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落多樣性顯著提高。因此，生物熏蒸通過改善根際土壤微生物區(qū)系，可有效克服連作障礙。

在菊科作物中，萬壽菊（Tagetes erecta L.）是一種多用途的作物，具有抗菌性能［10］。煙草生產(chǎn)中，Li等［11］發(fā)現(xiàn)煙草與萬壽菊間作具有改善土壤微生物群落的作用，土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度提高，有益微生物的相對豐度增加，而土壤青枯菌的相對豐度則降低。目前，萬壽菊秸稈也被用作生物熏蒸材料。王曉芳等［12-14］研究表明，采用萬壽菊植物粉末或秸稈熏蒸蘋果園土壤，土壤中細(xì)菌數(shù)量增加、真菌數(shù)量減少，真菌群落多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)均降低，可有效緩解蘋果連作障礙。然而，關(guān)于萬壽菊秸稈熏蒸應(yīng)用于植煙土壤的研究則鮮見報道，對煙株根際土壤微生物群落的影響也不明確。為此，在煙田中設(shè)置施用萬壽菊秸稈粉末、評價萬壽菊秸稈熏蒸對植煙土壤原核微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響試驗，旨在為緩解煙草連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

熏蒸用萬壽菊來自上年在煙田周圍播撒的試驗材料，采集根莖，自然風(fēng)干后，用粉碎機(jī)粉碎，過2 mm孔徑篩，備用。

1.2 試驗地點(diǎn)與概況

2017—2019年，試驗設(shè)置在湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮(zhèn)涼風(fēng)村。試驗地?zé)煵葸B作15年，種植煙草品種為云煙87。

1.3 試驗設(shè)計與指標(biāo)測定

1.3.1 土壤主要原核微生物數(shù)量分析

1.3.1.1 試驗設(shè)計

2017年進(jìn)行萬壽菊秸稈熏蒸用量篩選試驗。設(shè)置5個處理，CK1：不進(jìn)行萬壽菊秸稈熏蒸；T1、T2、T3和T4均為萬壽菊秸稈熏蒸處理，用量分別為750、1 500、2 250和3 000 kg/hm2，于煙田施肥后（4月5日）撒施于各試驗小區(qū)，之后起壟覆膜。每處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)共植煙64株。種植行株距為1.2 m×0.55 m，4月25日移栽。其他按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。

1.3.1.2 根際土壤樣品的取樣

2017年于煙苗移栽后50 d和100 d時，在T1、T2、T3、T4和CK1處理每小區(qū)中5個區(qū)域分別選擇1株煙株，按文獻(xiàn)［15］的方法采集根際土壤樣品，混合形成1個土樣，共計30個土樣，用于土壤細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)。

1.3.1.3 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量的測定

采用平板計數(shù)法統(tǒng)計T1、T2、T3、T4和CK1處理每克土中所含細(xì)菌和放線菌的個數(shù)［16］。細(xì)菌和放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.3.2.1 試驗設(shè)計

基于2017年研究結(jié)果，選取最佳處理，于2018—2019年連續(xù)兩年（田間試驗設(shè)置相同）開展試驗。設(shè)置2個處理，3次重復(fù)，共6個小區(qū)。CK2：不進(jìn)行萬壽菊秸稈熏蒸；TE：萬壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸，于煙田施肥后（4月5日）撒施于各試驗小區(qū)，之后起壟覆膜。種植行株距為1.2 m×0.55 m，每小區(qū)種植烤煙100株，4月28日移栽。其他按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。

1.3.2.2 根際土壤樣品的取樣

2019年于煙苗移栽后50 d和100 d時，在TE和CK2處理每小區(qū)中5個區(qū)域分別選擇生長基本一致的1株煙株并采集其根際土壤樣品，混合后形成1個土樣。按照取樣時期分別記作TE-50、CK2-50、TE-100和CK2-100，共計12個土樣，采集后的土樣保存于-80℃冰箱，用于土壤16S擴(kuò)增子的測序。

1.3.2.3 土壤原核微生物群落分析

（1）DNA提取及PCR擴(kuò)增。用FastDNA Spin Kit試劑盒（美國MP Biomedicals公司）提取TE和CK2處理土壤總DNA。以樣品DNA為模板，用引物515F和806R［515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′］對16S rDNA V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)［15］的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物檢測合格后進(jìn)行文庫構(gòu)建，在Illumina Hiseq PE250測序平臺上由諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序。

（2）操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類與物種注釋。對所有樣品的Effective Tags進(jìn)行聚類，將相似度≥97%的有效序列歸為1個OTU。利用QIIME軟件計算土壤微生物群落的多樣性指數(shù)（Shannon多樣性指數(shù)和Sobs、Chao1豐富度指數(shù)）。對每個OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，并用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，獲得每個OUT的分類水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析土壤主要原核微生物數(shù)量在不同處理間的差異（P＜0.05），采用T檢驗（T-test）分析土壤原核微生物群落多樣性指數(shù)、物種相對豐度等在TE和CK2處理間的差異（P＜0.05）。根據(jù)樣品在屬水平上的物種注釋及豐度信息，根據(jù)文獻(xiàn)［15］的方法對TE和CK2的前35位菌屬的相對豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后采用HemI軟件對標(biāo)準(zhǔn)化值繪制Heatmap圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量分析

煙株根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量測定結(jié)果見表1。表1顯示，細(xì)菌和放線菌數(shù)量在各處理間存在顯著差異。煙苗移栽后50 d時，萬壽菊秸稈熏蒸的處理土壤中細(xì)菌數(shù)量較CK1增加9.80%～98.04%，其中T2、T3和T4處理顯著高于CK1；放線菌數(shù)量較CK1增加5.11%～53.98%，其中T1和T2處理顯著高于CK1。煙苗移栽100 d時，萬壽菊秸稈熏蒸的處理土壤中細(xì)菌數(shù)量較CK1增加10.94%～94.27%，T1、T2、T3和T4處理均顯著高于CK1；放線菌數(shù)量較CK1增加2.06%～32.99%，其中T2、T3和T4處理顯著高于CK1。表明萬壽菊秸稈熏蒸能增加土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量，但添加量750 kg/hm2（T1）、2 250 kg/hm2（T3）和3 000 kg/hm2（T4）的效果稍劣于1 500 kg/hm2（T3）的處理。因此，本試驗中進(jìn)一步分析了萬壽菊秸稈添加量1 500 kg/hm2的熏蒸效果。

表1 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量的比較①Tab.1 Amount of bacteria and actinomycetes in soil

2.2 根際土壤原核微生物群落多樣性分析

對萬壽菊秸稈熏蒸（1 500 kg/hm2，TE）和不熏蒸（CK2）的土壤原核微生物群落（圖1）比較發(fā)現(xiàn)，煙苗移栽后50 d時，TE-50和CK2-50樣品分別得到5 648個和5 233個OTUs，其中兩者間共有的OTUs數(shù)量為4 141個；煙苗移栽后100 d時，TE-100和CK2-100樣品分別得到5 626個和5 520個OTUs，其中兩者間共有的OTUs數(shù)量為4 330個。表明萬壽菊秸稈熏蒸（TE）后土壤原核微生物群落OTUs數(shù)量明顯增多。

由表2可以看出，煙苗移栽后50 d時，TE-50土壤Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)均顯著高于CK2-50，較CK2-50分別增加11.81%、6.09%和11.27%。煙苗移栽后100 d時，TE-100土壤Sobs、Shannon和Chao 1指 數(shù) 較CK2-100分 別 增 加3.18%、0.21%和3.28%。表明萬壽菊秸稈熏蒸可提高土壤原核微生物群落的多樣性和豐富度。

圖1 各組樣本OTUs分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTUs distribution for each soil sample

表2 土壤原核微生物群落多樣性和豐富度分析①Tab.2 Diversity and richness indexes of prokaryotic microbial community in soil

2.3 土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 土壤原核微生物在門水平上的組成

在門水平上，對相對豐度排名前10位的土壤原核微生物進(jìn)行了分析，結(jié)果見表3。不同時期檢測出TE和CK2土壤樣品中優(yōu)勢菌門的相對豐度從高到低依次為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。煙苗移栽50 d時，TE-50土壤中芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對豐度顯著高于CK2，其他9個菌門在兩處理間差異不顯著。煙苗移栽后100 d時，TE-100土壤中變形菌門（Proteobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對豐度均顯著高于CK2，其他8個菌門在兩處理間差異不顯著。

表3 門水平上土壤原核微生物的相對豐度分析Tab.3 Relative abundances of main soil prokaryotic microbes at phylum level （%）

2.3.2 土壤原核微生物在屬水平上的組成

在屬水平上，土壤中相對豐度＞1%的土壤原核微生物分析結(jié)果見表4。表4表明，煙苗移栽后50 d時，TE-50和CK2-50土壤中分別有8個和5個菌屬的相對豐度高于1%；TE-50中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）的相對豐度顯著低于CK2-50，而鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）［17］和H16的相對豐度顯著高于CK2-50。煙苗移栽后100 d時，TE-100和CK2-100處理土壤中分別有11個和6個菌屬的相對豐度高于1%；TE-100處理中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia-Paraburkholderia）和Candidatus Solibacter的相對豐度顯著高于CK2-100，而Candidatus Nitrosotalea的相對豐度顯著低于CK2-100。

對35個菌屬相對豐度的相似性進(jìn)行HEMI聚類分析，結(jié)果見圖3。圖3表明，煙苗移栽后50 d時，TE-50中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、變桿菌屬（Variibacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、假雙頭斧形菌屬（Pseudolabrys）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）、未確定屬

的硝化螺旋菌科（unidentified Nitrospiraceae）［18］、Ramlibacter、赭黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）、溶桿菌屬（Lysobacter）、H16和Gaiella的相對豐度較高；CK2-50中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、堆囊菌屬（Sorangium）、戴氏菌屬（Dyella）、不動桿菌屬（Acidibacter）、未確定屬的酸桿菌科［unidentified Acidobacteriaceae（Subgroup 1）］［19］、Granulicella和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的相對豐度較高。煙苗移栽100 d時，TE-100中RB41、根微菌屬（Rhizomicrobium）、Bryobacter、Candidatus Solibacter、Reyranella、伯霍爾德桿菌屬（Burkholderia-Paraburkholderia）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、黃色土源菌屬（Flavisolibacter）和酸桿菌屬（Acidobacterium）的相對豐度較高；CK2-100中Candidatus Nitrosotalea、unidentified OPB35 soil group、豐佑菌屬（Opitutus）和Aquicella的相對豐度較高。

表4 屬水平上土壤原核微生物的相對豐度分析Tab.4 Relative abundances of major soil prokaryotic microbes at genus level （%）

圖3 屬水平上原核微生物物種豐度聚類熱圖Fig.3 Heatmap of relative abundances of soil prokaryotic microbes at genus level

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)，不同用量萬壽菊秸稈熏蒸后植煙土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量均有所增加，這與其應(yīng)用于連作蘋果土壤上的研究結(jié)果一致［14］。在4種用量中，萬壽菊秸稈1 500 kg/hm2的添加量在增加土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量中的作用最為顯著，低添加量（750 kg/hm2）的熏蒸效果不理想可能是由于添加量不足所造成的；高添加量（2 250 kg/hm2和3 000 kg/hm2）則可能會由于植物材料過多而沒有充分腐解，導(dǎo)致土壤透氣性不良、土壤顆粒黏結(jié)［14］，進(jìn)而刺激病原菌的生長［20］。

土壤微生物多樣性是表征土壤穩(wěn)定性與質(zhì)量的重要指標(biāo)。微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)越高，群落結(jié)構(gòu)越趨于穩(wěn)定［21］。煙草連作5年后，土壤微生物群落的多樣性顯著降低，逐漸趨于單一化［22］。本研究結(jié)果表明，萬壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸提高了土壤原核微生物群落尤其是煙苗移栽后50 d時的土壤原核微生物群落Sobs、Shannon和Chao1指數(shù)，這與水稻秸稈還田、油菜綠肥翻壓等提高煙草根際微生物群落多樣性的作用相似［23］，有利于避免微生物種群趨于單一化，提高土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

萬壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸可顯著提高土壤中芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對豐度，有利于更好地抑制土傳病原菌的定殖，促進(jìn)植物的健康生長［15，24-25］。屬水平上的土壤原核微生物群落構(gòu)成在萬壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸后也發(fā)生了變化，煙苗移栽后50 d時土壤中拮抗 菌（Sphingomonas、Pseudomonas、Gemmatimonas、unidentified Gemmatimonadaceae、Lysobacter）以及降解菌（Ramlibacter）的相對豐度明顯提高，這些原核微生物有利于抑制土傳病原菌對煙草生長的危害［26-30］，降解土壤中多環(huán)芳烴物質(zhì)，減輕化感自毒物質(zhì)對根系的損傷［31］；煙苗移栽后100 d時土壤中拮抗菌（Burkholderia）、功能菌（Candidatus Solibacter、Bryobacter和Rhizomicrobium）、根際促生菌（Flavisolibacter）相對豐度也較高，這些原核微生物有利于抑制土傳病原菌，同時可分解土壤有機(jī)質(zhì)、促進(jìn)土壤碳循環(huán)，為煙株生長提供足夠的營養(yǎng)，促進(jìn)煙株根系發(fā)育［32-34］。萬壽菊秸稈熏蒸提高根際土壤中這些有益菌相對豐度的原因可能是萬壽菊秸稈中含有豐富的纖維素和木質(zhì)素［35］，可為土壤微生物的活動提供豐富的碳源和氮源，促進(jìn)微生物的生長和繁殖，從而改善土壤微生物結(jié)構(gòu)［36］。

本研究中將萬壽菊秸稈粉碎，分析并證實了萬壽菊秸稈熏蒸在改善植煙土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)中的作用，而有關(guān)萬壽菊秸稈的其他利用方式是否也具有同樣的作用效果還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

萬壽菊秸稈熏蒸（750～3 000 kg/hm2）可增加煙株根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量，以1 500 kg/hm2的用量效果最明顯。萬壽菊秸稈熏蒸（1 500 kg/hm2）可提高根際土壤原核微生物群落Shannon多樣性指數(shù)和Sobs、Chao1豐富度指數(shù)，增加拮抗菌、降解菌、功能菌和根際促生菌的相對豐度，在改善連作煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中具有積極作用，同時具有緩解煙草連作障礙的潛在作用。