碳納米溶膠對煙草K+通道基因表達及根系K+流速的影響

郭亞迪，孟祥宇，戴華鑫，陳千思，翟振，王愛國，梁太波*，尹啟生

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001

2.河南中煙工業(yè)有限責任公司黃金葉生產(chǎn)制造中心，鄭州經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)第三大街9號450016

碳納米材料（Nano-materials，NMs）可促進植物的生長發(fā)育，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)和生命科學領域［1］，針對碳納米材料促進植物生長發(fā)育的生理基礎和分子機制已有研究［2］。碳納米溶膠（Carbon-nano sol，NC）屬于碳納米材料的一種，利用脈沖式電極法電解石墨制備而成，具有生物相容性好［3］、易制備和成本低等［4］優(yōu)點。研究表明，碳納米材料能促進作物種子的萌發(fā)［5-6］、根系的伸長［7-8］和營養(yǎng)元素的積累［9］，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。碳納米溶膠在提高作物肥料利用率、增強根系活力以及提升作物品質(zhì)方面展現(xiàn)出巨大潛力［10-12］。鉀是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，在植物生長發(fā)育進程中起著重要作用。鉀可以維持細胞的膨壓，調(diào)節(jié)細胞滲透勢及多種酶的活性［13-14］，還可以促進同化產(chǎn)物的輸出，促進蛋白質(zhì)、脂肪的合成，增強植物抗逆性［15］。鉀還被稱為煙草體內(nèi)的“品質(zhì)元素”，與煙葉的燃燒性和吸食品質(zhì)密切相關，在提高煙葉內(nèi)在品質(zhì)方面起著重要作用［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米溶膠能調(diào)控K+通道相關基因的表達，促進根系對鉀素的吸收，提高煙葉鉀素的積累量［18］，但目前有關碳納米溶膠促進K+吸收、轉(zhuǎn)運和積累的生理機制尚不清楚。

非損傷微測技術（Non-invasive Micro-test Technology，NMT）是研究和測定離子或分子流的一種先進科研手段，具有非損傷、時空分辨率高等優(yōu)點，已被廣泛應用于醫(yī)藥學、農(nóng)業(yè)科學等領域［19］，但其在煙草根系對K+的吸收以及K+在煙草根系的流速、流向等研究中的應用鮮見報道。為此，以碳納米溶膠和不同煙草品種為試驗材料，利用NMT研究碳納米溶膠對煙草根系K+流速和流向的影響，結(jié)合K+通道相關基因的表達量，探索K+的吸收、轉(zhuǎn)運和積累機理，旨在為進一步揭示碳納米溶膠促進煙草對鉀素吸收的作用機制和納米碳在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種分別為RG17、鄂煙1號（EY-1）、云煙87（Y87）和中煙100（Z100），種子由中國煙草遺傳育種研究（北方）中心和河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所提供。碳納米溶膠（北京奈艾斯新材料科技有限公司）采用脈沖式電極法電解石墨制備，粒徑10～100 nm。

1.2 煙苗培養(yǎng)

煙苗的培養(yǎng)在中國煙草總公司鄭州煙草研究院溫室中進行。煙草種子經(jīng)消毒后播種于育苗盤，待生長50 d并達到6葉1心時，每個煙草品種選取生長一致的幼苗移栽至培養(yǎng)盒中進行砂培試驗。砂培基質(zhì)為石英砂，提前殺毒滅菌、烘干備用，營養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液。

1.3 試驗設計

砂培條件下，設置對照（CK）和碳納米溶膠處理（NC），對照使用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，處理使用含碳納米溶膠（濃度為10 mg/L）的1/2 Hoagland營養(yǎng)液，每個培養(yǎng)盤放置30個培養(yǎng)盒，每隔3～5 d向培養(yǎng)盤中添加1次營養(yǎng)液，每次用量為3 L，共添加4次，培養(yǎng)20 d。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 鉀素含量的測定

煙苗培養(yǎng)20 d后，每個品種選取3株生長一致的煙苗，將莖葉和根系分開，經(jīng)蒸餾水洗凈、濾紙吸干水分后，105℃殺青15 min，65℃烘干后稱量。稱樣磨粉，采用HNO3-H2O2微波消解體系進行煙株樣品消解［20］，火焰原子吸收分光光度法測定鉀含量（質(zhì)量分數(shù)）［21］。

1.4.2 根系K+流速的測定

煙苗培養(yǎng)20 d后，每個品種選取6株生長一致的煙苗，采用NMT100 Series非損傷微測系統(tǒng)（美國Younger USA LLC公司）進行根系K+流速測定，每株幼苗穩(wěn)定測試300 s。測定K+流速前對測試植株進行3 d的鉀饑餓處理［22］（饑餓液Ⅱ為磷酸銨和硝酸銨替代硝酸鉀和磷酸二氫鉀的1/2 Hoagland營養(yǎng)液）。測試液：0.1 mmol·L-1KNO3，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0。校正液Ⅰ：0.05 mmol·L-1KNO3，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0。校正液Ⅱ∶0.5 mmol·L-1KNO3，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0。測定前將煙草根尖固定在塑料培養(yǎng)皿底部，加入測試液，放在倒置顯微鏡的載物臺上，在視野中找到擬測定的根尖，然后調(diào)節(jié)K+電極至根部分生區(qū)表面（距根尖約450μm），以測定點間距為30μm進行兩點測量，并計算流速。

1.4.3 K+通道基因表達量測定

煙苗培養(yǎng)20 d后，采集煙苗根系和葉片樣品，用錫紙包裹并迅速置于液氮中冷凍，而后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存。從-80℃冰箱取出待測樣品，加液氮研磨后，使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）進行總RNA的提取，具體操作參照試劑盒使用說明進行。使用Nanodrop 2000檢測RNA樣品的質(zhì)量和濃度。按照QuantiTect Reverse Transcription Kit試劑盒（德國QIAGEN公司）操作步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

在NCBI中檢索煙草相關基因序列，根據(jù)K+內(nèi)流通道基因NKT1（AB196790）、NtKC1（AB196791），K+外流通道基因NTORK1（AB196792）的cDNA全長序列設計引物，以ACTIN（AB158612）為內(nèi)參基因。其中，基因NtKC1、NTORK1和ACTIN的引 物序列參照Dai等［23］的 方法，基因NKT1的引物序列參照楊健等［18］的方法，引物序列見表1。使用LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀（德國Roche公司）進行熒光定量PCR反應。PCR反應體系為20μL：cDNA 2μL，引物F 1 μL，引物R 1μL，SYBR Green I（2×conc。）10μL，ddH2O 6μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)，其中基因NKT1和NtKC1的退火溫度為60℃。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)匯總及整理，利用SPASS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計及方差分析，使用GraphPad Prism 8.0作圖。各基因表達量通過LightCycler 480 software release 1.5.0 SP3軟件分析得到Cp值（每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），與ACTIN的Cp值相減得到ΔCT值，2-ΔΔCT即為基因相對于ACTIN的相對表達量［24］。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳納米溶膠對煙株鉀素含量及鉀素積累量的影響

由圖1可見，與對照（CK）相比，碳納米溶膠處理（NC）下4個煙草品種的植株地上部鉀素含量均有不同程度增加，除中煙100的增加量未達顯著水平外，其余3個品種均達顯著水平。RG17、鄂煙1號、云煙87鉀素含量較對照分別增加14.0%、12.5%和30%，以云煙87的增加幅度最大，中煙100的增加幅度最小。說明碳納米溶膠能夠促進煙株對鉀的吸收，增加煙株鉀含量。

從單株鉀素積累量變化來看，在碳納米溶膠處理條件下，除RG17由于生物量增加較小，鉀素積累量未達顯著水平外，其他3個品種積累量均有顯著提升；鄂煙1號、云煙87和中煙100積累量較對照分別增加18.6%、15.6%和46.6%。碳納米溶膠處理下中煙100的鉀素積累量顯著高于對照，而圖1中兩者鉀素含量無顯著差異。初步分析認為，這是由于干物質(zhì)積累增加對其鉀素含量產(chǎn)生了稀釋效應。

2.2 碳納米溶膠處理對煙草根系K+流速的影響

由圖2可見，在對照（CK）條件下，4個品種K+流速總體表現(xiàn)為內(nèi)流趨勢。中煙100的根系K+流速最初為外流，隨著時間延長波動幅度較大，其他3個品種均表現(xiàn)為內(nèi)流且波動幅度較小。經(jīng)碳納米溶膠處理后（NC），中煙100的根系K+流速逐漸變?yōu)閮?nèi)流，其他3個品種的內(nèi)流速率均有不同程度增加。

與對照相比，碳納米溶膠處理下RG17、鄂煙1號、云煙87和中煙100的根系K+流速分別增加38.17、39.71、13.96、8.61 pmol·cm-2·s-1（圖3）。可見，碳納米溶膠處理能促進根系對K+的吸收，但不同品種煙草對碳納米溶膠的響應存在一定差異。

圖3 碳納米溶膠處理下不同品種根系K+流速的差異Fig.3 K+fluxes in roots of different varieties under carbon-nano sol treatment

2.3 碳納米溶膠處理對K+通道基因表達量的影響

2.3.1 K+外流通道基因NTORK1的表達分析

由圖4可見，4個品種的鉀離子外流通道基因NTORK1在葉片中的表達規(guī)律不同，經(jīng)碳納米溶膠處理后，該基因在RG17、鄂煙1號和云煙87中的表達均有不同程度降低，而在中煙100中顯著增加，增幅達126.9%。該基因在4個品種根系中的表達趨勢一致，碳納米溶膠處理的表達量相比對照均顯著降低，RG17、鄂煙1號、云煙87和中煙100的降幅依次達到31.1%、59.9%、25.6%和32.0%。與對照相比，除NC葉片中中煙100的NTORK1表達量高于CK外，NC根系及其余品種的NTORK1在根和葉中的表達趨勢大體相近，均低于CK。碳納米溶膠誘導NTORK1表達量下調(diào)可能是其抑制K+外流，進而增加煙株鉀素含量的重要原因。

2.3.2 K+內(nèi)流通道基因NKT1的表達分析

由圖5可見，各品種K+內(nèi)流通道基因NKT1對碳納米溶膠處理的響應不同。葉片中，除RG17外其他3個品種的表達量均增加。碳納米溶膠處理下中煙100的表達量顯著增加，其表達量是對照的4.64倍。在根系中，RG17和中煙100在碳納米溶膠處理后，該基因的表達量降低；鄂煙1號和云煙87顯著增加，增幅分別達到210.6%和130.9%?？梢姡?jīng)碳納米溶膠處理后，基因NKT1的表達隨著煙草品種和器官的不同而存在一定差異。

2.3.3 K+內(nèi)流通道基因NtKC1的表達分析

由圖6可見，K+內(nèi)流通道基因NtKC1在葉片和根系中的表達情況相反，說明碳納米溶膠誘導的K+通道基因的表達在煙草不同器官中有所差異。在葉片中，經(jīng)碳納米溶膠處理后，除云煙87表達量無變化外，其他3個品種均呈上升趨勢，鄂煙1號和中煙100的表達量分別是對照的2.12倍和3.80倍。在根系中，與對照相比，經(jīng)碳納米溶膠處理后，K+通道基因在4個煙草品種中的表達量均降低，且均達到顯著水平。其中，以RG17降幅最大（69.6%），鄂煙1號的降幅最?。?0.8%），云煙87和中煙100的降幅分別為36.0%和66.8%。

圖4 碳納米溶膠處理下不同品種葉片（A）和根系（B）NTORK1的表達Fig.4 Expression of NTORK1 in leaves（A）and roots（B）of different varieties under carbon-nano sol treatment

圖5 碳納米溶膠處理下不同品種葉片（A）和根系（B）NKT1的表達Fig.5 Expression of NKT1 in leaves（A）and roots（B）of different varieties under carbon-nano sol treatment

圖6 碳納米溶膠處理下不同品種葉片（A）和根系（B）NtKC1的表達Fig.6 Expression of NtKC1 in leaves（A）and roots（B）of different varieties under carbon-nano sol treatment

3 討論

研究表明，碳納米材料能促進植物對大量元素［25-27］（N、P、K等）、中量元素［27］（Ca）和微量元素［28-29］（Cu、Zn、Fe、Mn等）的吸收，從而促進植物的生長發(fā)育。本研究中，施用碳納米溶膠后，各煙草品種體內(nèi)鉀素的積累量均呈顯著上升趨勢，這與趙振杰等［25］、Joshi等［26］和Tiwari等［27］在煙草、玉米和水稻上的研究結(jié)果一致?？梢?，碳納米溶膠在促進煙草鉀素積累和提高鉀含量方面具有突出優(yōu)勢，可成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提質(zhì)、減肥的有力工具。

非損傷微測技術（NMT）能準確檢測植物根系對某種離子的吸收情況，表征進出植物細胞離子流的變化程度，為明確離子的吸收和流向提供直觀、準確的數(shù)據(jù)［30-31］。本研究中，NMT測定結(jié)果表明，施用碳納米溶膠后各品種的根系K+內(nèi)流速率顯著增加。通過測定K+通道基因的表達量發(fā)現(xiàn)，碳納米溶膠處理下多數(shù)品種K+內(nèi)流通道基因NKT1的表達量增加，該結(jié)果與楊健等［18］在煙草中的研究結(jié)果一致，此外，K+外流通道基因NTORK1的表達受到抑制，這與NMT所測定的K+動力學特征相符?？梢?，通過NMT測定的K+流速和流向，結(jié)合K+通道相關基因的表達，可為闡明碳納米溶膠促進煙草對K+吸收的生理機制提供有力證據(jù)。

不同品種和不同基因型的煙草對鉀素的吸收和利用率具有差異性，相關基因?qū)ν饨鐥l件的響應也存在顯著差異［32-33］。在本研究中，碳納米溶膠處理后K+通道基因NTORK1、NKT1和NtKC1的表達模式以及K+流速在不同煙草品種間存在一定的差異，可能是由于不同品種鉀素吸收相關基因?qū)ν饨鐥l件響應的差異造成的，具體原因有待進一步研究。

4 結(jié)論

①碳納米溶膠能促進煙草K+內(nèi)流通道基因NKT1和NtKC1的表達，抑制K+外流通道基因NTORK1的表達，促使K+在根系的內(nèi)流速率增加以及煙株鉀素含量和積累量增加。②碳納米溶膠誘導鉀吸收相關基因表達和促進K+流速的效果因品種的不同而有所差異，不同基因?qū)μ技{米溶膠的響應同樣也存在差異。