新型口服納米膠束跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究Δ

陶小妹，趙 雪，隋航爍，王淑梅，馬英杰#

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京100038； 2.臨床合理用藥評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038； 3.北大醫(yī)療魯中醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，山東 淄博 255400； 4.承德市中心醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，河北 承德 067000)

通過納米載體改善藥物輸送是近年來的研究熱點(diǎn)。了解納米載體與細(xì)胞的相互作用，包括其跨細(xì)胞行為，對于口服納米藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計以及潛在納米材料的安全性研究都是至關(guān)重要的。迄今為止，大多數(shù)研究都集中在納米載體而非口服途徑的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。關(guān)于納米載體口服途徑的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究較少。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)通常用于制備脂質(zhì)體。近年來發(fā)現(xiàn)PEG-DSPE可單獨(dú)制備成膠束，用來遞送小分子抗腫瘤藥和難溶性藥物。聚合物膠束由于具有增溶性、高穩(wěn)定性、良好的生物相容性、高負(fù)載能力、長循環(huán)、選擇性靶向以及可以改變所包載藥物的內(nèi)化途徑和亞細(xì)胞定位特性，因此顯示出了巨大的藥物輸送潛力[1-3]。

MDCK細(xì)胞是馬丁達(dá)比犬的腎近區(qū)小管上皮細(xì)胞，其和Caco-2細(xì)胞是目前用于體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究的兩個最主要的單層細(xì)胞模型[4-5]。本研究選擇MDCK細(xì)胞作為上皮細(xì)胞模型，探討PEG-DSPE膠束的口服跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Nano ZS型激光粒度測定儀(英國Malvern instruments公司)；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；昆山舒美KQ-100DB型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA223S型電子分析天平(德國sartorius公司)；TG-16W型高速離心機(jī)(山東博科公司)；MERS00002型跨膜電阻測定儀(美國Millipre公司)；伯樂680型酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)；TCS SP5型激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 試劑

mPEG2000-DSPE(日本油脂株式會社)；香豆素6(美國Sigma-Aldrich公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Life Technologies 公司)，Hoechst 33258、羅丹明-鬼筆環(huán)肽(美國Molecular Probes公司)，100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素及0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)(北京邁晨生物科技有限公司)；氯丙嗪、蔗糖、阿米洛利、氯丙嗪及甲基-β-環(huán)糊精(美國Sigma-Aldrich公司)，Transwell(12孔，孔徑3 μm，聚碳酸酯膜，美國Corning Costar公司)，BCA蛋白定量試劑盒(普利萊公司)；其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 細(xì)胞

犬腎小管細(xì)胞株MDCK (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心)。培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、1%的青霉素和1%的鏈霉素。培養(yǎng)于37 ℃、相對濕度為95%，CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔日更換細(xì)胞培養(yǎng)液。

2 方法

2.1 PEG-DSPE膠束的制備

采用薄膜水化法制備PEG-DSPE膠束。將PEG-DSPE溶解于乙腈中，在40 ℃的真空旋轉(zhuǎn)條件下蒸發(fā)，以除去乙腈，得到一層薄薄的均勻薄膜。然后將聚合物薄膜在40 ℃的蒸餾水中超聲處理5 min，使其水合。冷卻至室溫(25 ℃)后，獲得澄清的膠束溶液。最后，將溶液通過0.22 μm的膜過濾。

2.2 載有香豆素6的PEG-DSPE膠束(C6-PD)的制備

將香豆素6添加到聚合物乙腈溶液中。其他步驟與制備空白膠束的步驟相同。在負(fù)載有香豆素6的膠束中，香豆素6與聚合物的質(zhì)量比為1∶1 000。

2.3 載有C6-PD膠束的表征

使用激光粒度分布儀在25 ℃下通過動態(tài)光散射分析對C6-PD的大小和Zeta電位進(jìn)行表征。為測定C6-PD的包封率，以10 000 r/min離心10 min，除去未溶解的香豆素6，將膠束溶解在甲醇中，測定包載的香豆素6含量。包封率(%)=(包封于膠束中的香豆素6/膠束制備時加入的香豆素6量)×100%。膠束體外泄露實(shí)驗(yàn)，使用透析袋(截留分子量為14 000 Da)裝載C6-PD后，置于無血清的培養(yǎng)基(pH=7.4)，37 ℃、100 r/min下培養(yǎng)，不同時間點(diǎn)取樣測定。

2.4 細(xì)胞內(nèi)香豆素6含量定量檢測方法

香豆素6可以自發(fā)熒光，可用熒光分析法進(jìn)行檢測。建立定量檢測細(xì)胞中香豆素6的熒光分析方法。取空白細(xì)胞裂解液100 μl置于1.5 ml離心管中，加入甲醇配制的系類標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，渦旋1 min后，以14 000 r/min離心10 min，取100 μl上清液用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為467 nm，發(fā)射波長為502 nm，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品前處理類似，取細(xì)胞樣品100 μl置于1.5 ml離心管中，加入甲醇溶液100 μl，渦旋1 min后，以1 400 r/min離心10 min，取上清液100 μl進(jìn)行分析。

2.5 MDCK細(xì)胞對C6-PD膠束的攝取

2.5.1 BCA法定量檢測蛋白含量：使用BCA蛋白定量試劑盒檢測細(xì)胞的蛋白濃度。根據(jù)試劑盒說明配制BCA工作液。用PBS緩沖液逐級稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將BCA工作液與不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，37 ℃水浴加熱30 min，用酶標(biāo)儀在540 nm波長處測定樣品吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算細(xì)胞裂解液樣品的蛋白濃度。

2.5.2 激光共聚焦顯微鏡對C6-PD進(jìn)行定性分析：為驗(yàn)證C6-PD能否被細(xì)胞攝取，本研究采用共聚焦顯微鏡對C6-PD攝取進(jìn)行定性研究。將C6-PD加入合格的MDCK單層細(xì)胞中進(jìn)行孵育，同時計時。以空白DMEM培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為陰性對照。在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光檢測，選擇的激發(fā)波長為香豆素6激發(fā)/發(fā)射波長(Ex/Em=488/502 nm)，觀察香豆素6綠色激發(fā)光的強(qiáng)度。

2.5.3 MDCK細(xì)胞對C6-PD表面吸附作用的定量分析：為定量分析C6-PD在MDCK細(xì)胞單層表面的吸附作用，采用熒光分析法測定熒光標(biāo)記的PEG-DSPE膠束的表面吸附及攝取量的差異。

將MDCK細(xì)胞以1×106/ml培養(yǎng)于12孔板中。待細(xì)胞匯合后，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，再于孔板中加入制備好的C6-PD，在37 ℃條件下孵育10、30、60、90及120 min。孵育時間結(jié)束后，一組使用冰冷的PBS清洗細(xì)胞單層3次，1次3 min，以保證充分洗去細(xì)胞表面所吸附的膠束，之后加入胰酶/EDTA將MDCK細(xì)胞消化并吹打成單細(xì)胞懸液，重新將細(xì)胞離心并使用PBS洗滌細(xì)胞懸液3次，洗去懸浮的單細(xì)胞上吸附的膠束，最后以1 000 r/min離心細(xì)胞懸液5 min獲取細(xì)胞沉淀，除去上清液，加入RIPA細(xì)胞裂解液于4 ℃條件下裂解細(xì)胞30 min以釋放胞內(nèi)膠束。此時裂解液中所含膠束的濃度即為經(jīng)MDCK細(xì)胞攝取入胞的膠束的濃度。

另一組吸去MDCK細(xì)胞單層表面的膠束，不進(jìn)行消化細(xì)胞的步驟，直接加入RIPA裂解細(xì)胞以釋放胞內(nèi)膠束。采用這種方法所得到的膠束的濃度為MDCK細(xì)胞對膠束的攝取量以及細(xì)胞單層表面及細(xì)胞間對C6-PD的吸附量之和。

對于采用上述兩種方法得到的細(xì)胞裂解液，加入甲醇沉淀蛋白，室溫下于黑暗處振搖12 h后以14 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行香豆素6熒光分析。測定香豆素6濃度，同時對每管的細(xì)胞裂解液利用BCA蛋白定量試劑盒分別進(jìn)行蛋白濃度測定。

2.6 C6-PD的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

口服跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)主要指腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。分子可以通過兩種途徑在腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，即細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。

細(xì)胞旁途徑指通過打開胃腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接來進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞旁間隙占黏膜表面積的比例<1%，并且緊密連接的孔徑<10 ?。因此，口服跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)還是以跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)為主。在跨細(xì)胞途徑中，上皮細(xì)胞對納米顆粒的攝取有吸附、融合、膜間轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)吞等方式，其中，內(nèi)吞被認(rèn)為是納米粒子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的主要機(jī)制[6-8]。通常納米載體首先被膜侵入，并形成內(nèi)體。然后，內(nèi)體將納米載體遞送至各種細(xì)胞器內(nèi)，例如溶酶體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或再循環(huán)至細(xì)胞外環(huán)境或跨細(xì)胞遞送(轉(zhuǎn)胞吞作用)[9-11]。

2.6.1 不同內(nèi)吞抑制劑的作用：內(nèi)吞被認(rèn)為是納米粒子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的主要機(jī)制，包括巨胞飲作用、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、非網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。通過加入不同內(nèi)吞抑制劑可以分析C6-PD的具體內(nèi)吞機(jī)制[12-15]。內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)中所用藥物抑制劑的作用和濃度見表1。

表1 內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)中所用藥物抑制劑的作用和濃度Tab 1 Effect and concentration of drug inhibitor used in the endocytosis experiment

(1)定量分析。37 ℃下，將內(nèi)吞抑制劑與MDCK細(xì)胞共同孵育30 min，然后添加C6-PD后再孵育1 h。用熒光分析法測定細(xì)胞裂解液中所含膠束的濃度。

(2)定性分析。37 ℃下，將內(nèi)吞抑制劑與MDCK細(xì)胞共同孵育30 min，然后添加C6-PD后再孵育1 h。孵育時間結(jié)束后，細(xì)胞用3.7%的多聚甲醛固定后，分別用Hoechst33258和羅丹明-鬼筆環(huán)肽與細(xì)胞孵育，以標(biāo)記細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)和微絲(紅色熒光)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況。

2.6.2 溫度對跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：低溫會抑制能量代謝過程。為考察C6-PD的細(xì)胞攝取是否為能量依賴的過程，將MDCK細(xì)胞分為兩組，一組在37 ℃條件下孵育1 h，另一組在4 ℃條件下孵育1 h。定量檢測兩種溫度下MDCK細(xì)胞對C6-PD的攝取量的差異。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果與討論

3.1 載有C6-PD的表征

通過動態(tài)光散射分析確定的無血清培養(yǎng)基中C6-PD的典型粒徑見圖1。3次測定后的平均粒徑為(21.7±1.7)nm，Zeta電位幾乎是中性的，包封率為(92.4±1.43)%，見表2。12 h內(nèi)，香豆素6泄漏總量<5%，見圖2。也就是說，在接觸細(xì)胞之前，幾乎沒有香豆素6泄漏，這表明香豆素6的行為可以代表PEG-DSPE膠束的行為。

圖1 C6-PD的粒徑分布圖Fig 1 Particle size distribution of C6-PD

表2 C6-PD的表征Tab 2 Characterization of

圖2 pH 7.4條件下C6-PD的釋放曲線(n=3)Fig 2 Leakage of C6-PD under pH 7.4 condition (n=3)

3.2 MDCK細(xì)胞對C6-PD膠束的攝取

3.2.1 細(xì)胞內(nèi)香豆素6含量及蛋白濃度定量檢測方法：以香豆素6的質(zhì)量濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)(x)，以香豆素6的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(y)，以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.136 4x-0.029 9，R2=0.999 6，檢測范圍為1～1 000 ng/ml。以蛋白濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)(x)，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.000 4x+0.102 1，R2=0.999 0，檢測范圍為8～320 μg/ml?？捎糜诤罄m(xù)對細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量分析。

3.2.2 激光共聚焦顯微鏡對C6-PD進(jìn)行定性分析：當(dāng)C6-PD加入到MDCK單層細(xì)胞上后，可以在激光共聚焦顯微鏡下觀察到膠束立刻被攝取，在120 s時細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度幾乎達(dá)到飽和，見圖3。采用兩種方法處理MDCK細(xì)胞后所得到的熒光強(qiáng)度百分比,見圖4。由圖4可見，在0～120 min范圍內(nèi)，由細(xì)胞單層、細(xì)胞間連接吸附的膠束和內(nèi)吞膠束總量均高于同時間點(diǎn)下MDCK細(xì)胞對膠束的內(nèi)吞量。表明細(xì)胞表面確實(shí)對C6-PD存在吸附效應(yīng)。同時也可以看到，在加入C6-PD 10 min時，便有大量的膠束聚集在細(xì)胞表面，隨著孵育時間的延長，部分表面的膠束被內(nèi)吞入胞，在90 min和120 min時，表面吸附的膠束量與內(nèi)吞的膠束量趨于動態(tài)平衡，說明吸附量會隨著孵育時間的延長逐漸達(dá)到飽和。

A.10 s；B.60 s；C.120 sA.10 s；B.60 s；C.120 s圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察MDCK細(xì)胞對C6-PD的攝取(標(biāo)尺=25 μm)Fig 3 Uptake of C6-PD by MDCK cells by laser confocal microscopy (Bar=25 μm)

3.2.3 MDCK細(xì)胞對C6-PD表面吸附作用的定量分析：結(jié)果見圖4。

圖4 MDCK單層細(xì)胞對C6-PD攝取的定量分析(n=3)Fig 4 Quantitative analysis of C6-PD uptake by MDCK monolayer cells(n=3)

3.3 C6-PD的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

3.3.1 不同內(nèi)吞抑制劑的作用：細(xì)胞膜上富含鞘磷脂和膽固醇的區(qū)域稱為脂筏結(jié)構(gòu)，脂筏結(jié)構(gòu)包含小窩，而制霉菌素可以抑制小窩蛋白的形成，甲基-β-環(huán)糊精可以有效螯合細(xì)胞膜上的膽固醇，進(jìn)而抑制小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞。鹽酸氯丙嗪和高滲蔗糖可以抑制細(xì)胞膜上網(wǎng)格蛋白的組裝，進(jìn)而抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞。鹽酸阿米洛利可以抑制巨胞飲作用。

轉(zhuǎn)胞吞作用的過程包括膜的內(nèi)陷、囊泡出芽以及囊泡向細(xì)胞的相對側(cè)移動，其攝取取決于所涉及的內(nèi)吞作用類型，即巨胞飲作用、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以及小窩和網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用。如表1所列，使用了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑(氯丙嗪和高滲蔗糖)、巨胞飲作用抑制劑(阿米洛利)和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑(甲基-β-環(huán)糊精和制霉菌素)。37 ℃下MDCK細(xì)胞在不同內(nèi)吞抑制劑作用1 h下對C6-PD的攝取見圖5。圖5中的數(shù)據(jù)提示，對C6-PD細(xì)胞內(nèi)吞作用最有效的抑制劑是甲基-β-環(huán)糊精(降低88.1%，P<0.01)，其次是高滲蔗糖(降低44.1%，P<0.01)、制霉菌素(降低27.9%，P<0.01)和氯丙嗪(降低29.4%，P<0.01)。與對照組相比，阿米洛利的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在甲基-β-環(huán)糊精處理后，C6-PD幾乎沒有被內(nèi)化到細(xì)胞中，而是剩余完整性的細(xì)胞骨架，見圖6。

與對照組比較，*P<0.01vs. the control group, *P<0.01圖5 37 ℃下MDCK細(xì)胞在不同內(nèi)吞抑制劑作用1 h下對C6-PD的攝取(n=3)Fig 5 Uptake of C6-PDs by MDCK cells in the presence of different inhibitors at 37 ℃ for 1 h (n=3)

圖6 37 ℃下，用或不用MβCD處理1 h后，共聚焦顯微鏡下MDCK細(xì)胞對C6-PD的攝取圖像(標(biāo)尺=25 μm)Fig 6 Confocal images of MDCK cells treated with or without MβCD at 37 ℃ for 1 h (Bar=25 μm)

甲基-β-環(huán)糊精對C6-PD吸收的抑制作用很快發(fā)生，并且在1 h內(nèi)抑制了超過85%的內(nèi)吞作用。膽固醇屬于非極性疏水化合物，甲基-β-環(huán)糊精的疏水性空腔與膽固醇的分子結(jié)構(gòu)相適宜，因此,甲基-β-環(huán)糊精可以與膽固醇螯合在一起。為了排除甲基-β-環(huán)糊精的任何藥物特異性作用，使用了另一種抑制劑制霉菌素，該抑制劑可以與膽固醇結(jié)合并通過直接插入膜將膽固醇螯合為復(fù)合物來破壞脂質(zhì)筏。文獻(xiàn)報道，通過對膽固醇的螯合作用可以有效阻止小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[16]。甲基-β-環(huán)糊精和制霉菌素的顯著抑制作用表明內(nèi)吞過程是具有高度膽固醇依賴性的。膽固醇被鰲合后可能引起細(xì)胞膜雙層生物物理特性(例如膜張力、彎曲剛度或厚度)的變化而抑制內(nèi)吞作用[17]。因此，本研究實(shí)際上證明了MDCK細(xì)胞對C6-PD的內(nèi)吞作用是膽固醇依賴性和小窩蛋白介導(dǎo)的過程。

氯丙嗪是一種陽離子兩親分子，可通過破壞網(wǎng)格蛋白和細(xì)胞表面的復(fù)合物來特異性阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。高滲蔗糖因干擾網(wǎng)格蛋白晶格在脂膜上的分散而被廣泛用于抑制網(wǎng)格蛋白囊泡的形成[18]。高滲蔗糖通過使質(zhì)膜內(nèi)小葉處的網(wǎng)格蛋白晶格解離來抑制網(wǎng)格蛋白包被的小孔的形成。因此，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑也參與C6-PD的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

另一方面，阿米洛利通過改變鈉離子的濃度來抑制巨胞飲作用[19]。巨噬細(xì)胞表面普遍存在皺褶結(jié)構(gòu)，鈉離子的濃度對細(xì)胞膜皺褶的形成很重要。用阿米洛利進(jìn)行的研究結(jié)果表明，巨胞飲作用機(jī)制在實(shí)驗(yàn)條件下作用不大。這與通常粒徑>150 nm的顆?？赡芫哂羞@種內(nèi)吞途徑的報道相符[20-21]。

使用內(nèi)吞抑制劑進(jìn)行的研究結(jié)果表明，C6-PD的胞吞作用可能是通過多種機(jī)制介導(dǎo)的。

3.3.2 溫度對跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：為考察C6-PD的細(xì)胞攝取是否為能量依賴的過程，用熒光分析法對不同溫度下的C6-PD的細(xì)胞攝取進(jìn)行定量研究。低溫(4 ℃)會抑制所有ATP依賴的細(xì)胞過程。如果細(xì)胞中的ATP消耗殆盡，那么其依賴能量的內(nèi)吞作用就會受到抑制。將溫度從37 ℃降低到4 ℃會顯著降低MDCK細(xì)胞對C6-PD在不同時間下的攝取百分比，見圖7。這表明跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程在很大程度上依賴于溫度或能量，進(jìn)一步說明跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的過程可能是主動轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖7 不同溫度下MDCK細(xì)胞對C6-PD的攝取(n=3)Fig 7 Uptake of C6-PD by MDCK cells at different temperatures (n=3)

4 結(jié)論

在本研究中，制備并表征了包含熒光探針香豆素6的典型膠束系統(tǒng)，并探討了其在MDCK細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)。PEG-DSPE膠束具有較快的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力可能與DSPE作為一種磷脂，對細(xì)胞膜具有較高的親和力相關(guān)。通過不同內(nèi)吞抑制劑和溫度的研究，可以證明小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白都參與了MDCK細(xì)胞對PEG-DSPE膠束的內(nèi)吞作用，并且跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程是需要能量的主動轉(zhuǎn)運(yùn)過程。本研究中的發(fā)現(xiàn)為口服藥物遞送的兩親性納米生物材料的設(shè)計提供了良好的基礎(chǔ)。