人參皂苷Rg1抗長波紫外線對人皮膚成纖維細胞損傷模型的作用研究

周桃花 周紅艷 陳芳 尹穎 楊玉

[摘要]目的：觀察人參皂苷Rg1抗長波紫外線（Ultravio1et A，UVA）對人皮膚成纖維細胞（Human dermal fibroblasts，HDF）的損傷作用，為研究開發(fā)光老化防護劑提供依據。方法：分離HDF進行原代培養(yǎng)及凍存;復蘇HDF傳代培養(yǎng)至第6～8代用于樣品活性檢測;采用改良MTT法檢測UVA照射前后給予人參皂苷Rg1 HDF存活率的變化情況，用維生素C作陽性對照。結果：在照射前24h預先給予人參皂苷單體Rg1，在2.5～40μg/ml濃度時細胞存活率較模型組明顯提高，差異有統計學意義（P<0.05）;且5、10μg/ml組的細胞存活率優(yōu)于陽性對照組（P<0.05）。照射后給予人參皂苷單體Rg1，在2.5～40μg/ml濃度時細胞存活率均較模型組明顯提高（P<0.05）。結論：人參皂苷Rg1在2.5～40μg/ml范圍內對HDF的UVA損傷有較好的預防和治療作用。

[關鍵詞]人參皂苷Rg1;人皮膚成纖維細胞;長波紫外線;光老化;預防;治療

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）03-0090-03

An Experimental Study on the Effects of Ginsenoside Rg1 on the Injury Model of Human Dermal Fibroblasts Induced by UVA

ZHOU Tao-hua，ZHOU Hong-yan，CHEN Fang，YIN Ying，YANG Yu

（Department of Pharmacy，Sichuan Provincial Hospital for Women and Children，Affiliated Women and Children's Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610041，Sichuan，China）

Abstract： Objective? T0 observe the anti-damage effect of ginsenoside Rg1 against ultraviolet A （UVA） on human dermal fibroblasts （HDF）， and provide a basis for the research and development of photo aging protection agents. Methods? Isolated HDF for primary culture and cryopreservation. Resuscitated HDF subculture to the 6th to 8th generation for sample activity detection. Utilizing the modified MTT method to detect the survival rate of HDF before and after UVA irradiation when treatment with ginsenoside Rg1， and vitamin C was used as a positive control. Results? The ginsenoside monomer Rg1 was pre-administered 24h before irradiation， the cell survival rate was significantly improved compared with the model group at a concentration of 2.5-40μg/ml， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the cell survival rate of 5， 10μg/ml group was better than vitamin C group（P<0.05）. The ginsenoside Rg1 was given after irradiation， the cell survival rate at the concentration of 2.5-40μg/ml was significantly higher than those of the model group （P<0.05）. Conclusion? Ginsenoside Rg1 has a good preventive and therapeutic effect on the UVA damage ofHDF in the range of 2.5-40μg/ml.

Key words： ginsenoside Rg1; human dermal fibroblasts; ultraviolet A; photoaging; preventive activity; therapeutic effect

皮膚是直接與外界接觸的器官，最易受外界環(huán)境的影響。日光照射可使皮膚出現粗糙﹑松弛﹑皺紋加深加粗﹑不規(guī)則性色素沉著﹑毛細血管擴張﹑角化不良等光老化現象[1-2]，不僅有損于人體外部形象，而且可并發(fā)多種皮膚病，影響人們的生活質量。日光中引起光老化的成分主要是中波紫外線（Ultraviolet B，UVB）和UVA，UVB大部分穿透表皮而被吸收，少部分可到達真皮層，是造成皮膚損傷的主要原因之一，但能被衣服﹑帽子﹑玻璃阻斷。UVA能穿透表皮到達真皮造成皮膚內真皮的主體細胞成纖維細胞損傷。皮膚光老化本質是自由基產生與抗氧化作用的降低[3-4]，故尋找穩(wěn)定的抗氧化劑，成為防治皮膚光老化的重要思路。至今為止，人們已從三七、人參植物中分離出很多種人參皂苷單體[5]，人參皂苷Rg1是三七和人參最主要的活性成分[6]，不僅含量高而且清除氧自由基效果也是人參皂苷之首，具有抑制細胞質過氧化反應;清除自由基的能力;還可以使過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性增加[7-9]。前期研究表明，可以用紫外線照射體外培養(yǎng)的人體皮膚細胞來建立紫外線光老化模型[10-11]。本實驗在成功建立UVA輻射損傷HDF模型上，研究人參皂苷Rg1抗UVA輻射對HDF損傷模型的作用，探討人參皂苷Rg1抗皮膚光損傷的預防和治療作用，為研發(fā)皮膚光老化天然產物防護劑提供依據。

1? 材料和方法

1.1 材料：人皮膚成纖維細胞（Human dermal fibroblasts，HDF）來自健康男性包皮環(huán)切術時的包皮兩塊，每塊約2cm×2cm。

1.2 樣品、試劑與儀器：人參皂苷Rg1標準品購自中國藥品生物制品檢定所，含量97.7%，淺棕色粉末，室溫下水溶性良好，無沉淀﹑殘渣析出﹑溶液呈淺棕色。維生素C、H-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基四氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）等。CO2培養(yǎng)箱、長波紫外線燈管、UVA雙通道紫外輻照計（北京師范大學光電儀器廠制造）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品及陽性藥物配制：用生理鹽水配制成0.8mg/ml的人參皂苷Rg1儲存液，用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌后，維生素C用PBS緩沖液將維生素C粉劑配制成0.6mg/ml的儲存液，用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌后，分別裝于1ml離心管內并在-20℃保存。加藥前用PBS緩沖液將儲存液稀釋為受試濃度，每次加藥前臨時配制。

1.3.2 細胞培養(yǎng)：取健康男性包皮環(huán)切術時的包皮，參照文獻[12]分離培養(yǎng)HDF，培養(yǎng)至第3代凍存，根據實驗進程需求對HDF解凍復蘇，培養(yǎng)細胞至第6～8代用于實驗。

1.3.3 UVA損傷HDF體外模型的建立：將培養(yǎng)好的HDF棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液漂洗兩次后，加入適量PBS緩沖液后進行UVA照射，UVA照射強度為5mW/cm2，照射時間40min，照射劑量為12J/cm2。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.3.4 人參皂苷Rg1抗UVA對HDF損傷作用：實驗每組均設6個平行孔，每塊板設3個調零孔（只加DMEM基礎培養(yǎng)基），用于酶標儀檢測調零。正常對照組：加入DMEM基礎培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后超凈臺放置40min;模型組：加入DMEM基礎培養(yǎng)基;給藥組：給藥方式為提前給藥，加入梯度濃度依次為2.5、5、10、20、40μg/ml人參皂苷Rg1;陽性對照組（維生素C）：提前給藥，加入濃度為6μg/ml的維生素C，然后將模型組、給藥組、陽性對照組置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行UVA照射，照射方式同模型組。照射完畢，將以上各組DMEM培養(yǎng)基更換后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。同理用相同的方法把給藥組和維生素C組的先給藥后照射變?yōu)檎丈浜罅⒓唇o藥，其他條件不變進行試驗。

1.3.5 改良MTT法檢測細胞活率：加入MTT（5mg/ml）10微升/孔;繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入三聯液100微升/孔;繼續(xù)在37℃培養(yǎng)12h，用酶標儀在570nm﹑630nm雙波長下測定每個孔的OD值（實驗重復三次）。

1.3.6 細胞相對存活率按下式計算：OD值=實測吸光度-空白吸光度;相對存活率（%）=樣品孔OD值或模型孔OD值/正常對照孔OD值

1.3.7 統計學分析：所有計量資料數據先行方差齊性檢驗后，采用多樣本均數單因素方差分析（ANOVA）法，應用SPSS 12.0統計軟件分析數據結果。

2? 結果

2.1 大體觀察：UVA模型組HDF的數量明顯比正常對照組減少，細胞體積變大、細胞內顆粒增多、出現慢性光損傷表型。維生素C組HDF數量比模型組增多，加人參皂苷Rg1后照射組和照射后加人參皂苷Rg1組HDF數量最多（見圖1）。

2.2 加人參皂苷Rg1后照射組的HDF存活率：給藥方式為提前給藥，加入不同濃度的人參皂苷Rg1繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行UVA照射，MTT法檢測細胞存活情況，從表1中可以看出，照射后模型組HDF的存活率從100.0%下降到46.17%，差異具有統計學意義（P<0.01）;陽性對照組細胞存活率為75.58%，較模型組增加29.41%，差異有統計學意義（P<0.05）。提前24h加入Rg1濃度2.5、5、10、20、40μg/ml，細胞存活率與模型組比較分別提高了45.25%、70.79%、63.61%、45.64%、53.50%，差異具有統計學意義（P<0.05）。Rg1在2.5μg/ml就顯示出保護作用，在5μg/ml時保護作用達到高峰，繼續(xù)提高濃度至10～40μg/ml時保護作用不再增加。其中5、10μg/ml的細胞存活率與陽性對照比較分別提高了41.38%、34.20%，差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3 照射后加人參皂苷Rg1組的HDF存活率：給藥方式為照射后立即給藥，UVA照射完畢后立即加入不同濃度的Rg1繼續(xù)培養(yǎng)24h后用MTT法檢測細胞存活情況，從表2中可以看出，照射后模型組HDF的存活率從100.00%下降到12.37%，差異有統計學意義（P<0.05）。陽性對照組能使細胞存活率得到一定程度的改善，存活率較模型組增加76.93%（P<0.05）。照射后立即加入人參皂苷Rg1 2.5、5、10、20、40μg/ml，細胞存活率與模型組比較分別提高了76.15%、106.13%.、103.09%、95.48%、82.95%，差異具有統計學意義（P<0.05）。Rg1在2.5μg/ml就顯示出保護作用，在5μg/ml時保護作用達到高峰，繼續(xù)提高濃度至10～40μg/ml時保護作用不再增加。以上結果說明人參皂苷Rg1在2.5～40μg/ml范圍內對HDF的UVA損傷有較好的預防和治療作用。

3? 討論

本研究根據前期摸索出HDF的細胞密度、照射強度建立HDF光老化模型用于人參皂苷Rg1樣品的篩選，用一定劑量的UVA照射HDF后，細胞數量減少、體積變大，細胞內顆粒增多（見圖1），細胞存活率下降（見表1～2），與文獻[10，13]報道結果一致，從每一次照射結果來看，均達到了一定強度的細胞損傷，加入維生素C后，細胞存活率提高，說明成功建立了UVA輻射損傷HDF的模型。為了證明模型的有效性，本研究選用了作用確切，作用機制與受試樣品相近，臨床常用的維生素C作為陽性對照，采用高純度的Rg1樣品進行研究可排除樣本中雜質的干擾，能更加準確地反映待測樣品的活性。在研究中還發(fā)現在2.5～10μg/ml范圍內受試樣品均已顯現出一定的預防和治療作用，繼續(xù)提高濃度至10～40μg/ml時保護作用不再增加，因此在后續(xù)實驗中可以降低濃度進行測試。從理論上說抗光老化產品的預防作用應該優(yōu)于治療作用，但在本試驗中，還難以做出這一結論，今后還要另外設計試驗體系來對樣品的預防和治療作用進行比較。

近年來，國內外對天然藥物防治皮膚光損傷開展了研究，并取得了一定進展。李丹暉[14]研究人參皂苷對皮膚細胞紫外線損傷的保護作用中發(fā)現人參皂苷Rg1對UVB致人皮膚成纖維細胞的損傷具有一定保護作用，其機制可能與他的抗氧化作用和促進細胞增殖作用有關。劉勇[15]等研究了人參皂苷Rg1保護UVB所致皮膚成纖維細胞急性損傷，發(fā)現人參皂苷Rg1通過增強細胞的抗氧化能力和降低基質金屬蛋白酶-1及-3的生成，從而發(fā)揮保護細胞的作用。本研究發(fā)現，UVA照射形成的HDF損傷模型中，加入人參皂苷Rg1細胞存活率增加，說明人參皂苷Rg1在2.5～40μg/ml濃度范圍內對HDF的UVA輻射損傷模型有較好的預防和治療作用。這種作用的機理是否與促細胞增殖有關呢？仍需更進一步深入探討研究。

皮膚光老化一直是當今護膚品界研究的熱門課題。植物系護膚品的成分穩(wěn)定、可以改善肌膚活力與彈性，而且能夠最大程度避免化學刺激等遺留問題，然而可應用于抗皮膚光老化的中藥及其提取物少之又少，人參皂苷Rg1在人參、三七等多種物質里廣泛存在，通過工藝改良后提取得到率高。隨著我國生活水平逐年提高，越來越多的女性更傾向于純植物護膚品使用，可以通過深入研究，開發(fā)出功效更為突出的皮膚光老化純天然產物化妝品，有廣闊的發(fā)展空間與市場前景。

我國高原和低緯度地區(qū)太陽紫外光輻射較強，人們在生產生活中深受紫外光毒害致皮膚光老化現象非常普遍，該地區(qū)皮膚病患者相對增多，相當部分患者從皮膚潰爛到異常增殖癌病轉化趨勢明顯。隨著對紫外線導致皮膚損傷的深入研究表明人參皂苷Rg1對皮膚成纖維細胞光老化有預防和治療作用，增加了皮膚病預防和臨床治療藥物開發(fā)途徑。

[參考文獻]

[1]焦丹丹，唐亞楠，高騰.多酚類化合物在皮膚光損傷防護方面的研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（8）：158-162.

[2]何永靜，劉垠，王繼華，等.TGF-β1對UVA照射人皮膚成纖維細胞MMP-1和MMP-3 mRNA表達的影響[J].中國美容醫(yī)學，2010，19（1）：53-55.

[3]劉少英，孟祥璟，張祥奎，等.皮膚光老化機制及抗光老化藥物[J].生理科學進展，2018，49（4）：265-269.

[4]Choi JW，Lee J，Park YI.7，8-Dihydroxyflavone attenuates TNF-α-induced skin aging in Hs68 human dermal fibroblast cells via down-regulation of the MAPKs/ Akt signaling pathways[J].Biomed Pharmacother，2017，95（6）：1580-1587.

[5]何書平.HPLC法測定三七中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量[J].健康之友，2020，31（1）：141-142.

[6]陳紅艷，陳安，盧芳國，等.三七總皂苷的藥理研究進展[J].湖南中醫(yī)雜志，2019，35（1）：154-157.

[7]劉夢娜，李征永，邵亞蘭，等.人參皂苷抗皮膚光老化作用的新進展[J].南昌大學學報（醫(yī)學版），2018，58（1）：91-95.

[8]戚秀中，張?zhí)镆?，蘇永華，等.具有抗紫外線皮膚損傷作用的常用中藥[J].中國美容醫(yī)學，2010，19（11）：1728-1730.

[9]楊娜，周柏松，王亞茹，等.人參皂苷Rg1生物活性研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（4）：1463-1465.

[10]劉金娟，楊宏發(fā)，李勇堅，等.紫外線對人皮膚成纖維細胞老化損傷的影響[J].中國免疫學雜志，2019，35（9）：1053-1058.

[11]吳斯敏，楊慧齡.紫外線引起皮膚光老化機制及防治的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2018，24（2）：341-346.

[12]Zheng Y，Xu Q，Peng Y，et al. Expression profiles 0f long noncoding RNA in UVA-induced human skin fibroblasts[J].Skin Pharmacol Physiol，2017，30（6）：315-323.doi：10.1159/000477972.

[13]夏悅，賴維，劉玉芳，等.反復長波紫外線照射對人皮膚成纖維細胞DNA的損傷機制探討[J].中華皮膚科雜志，2019，52（9）：631-635.

[14]李丹暉.人參皂苷對皮膚細胞紫外線損傷的保護作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2009.

[15]劉勇，徐浩翔，惠云，等.人參皂苷Rg1保護UVB所致皮膚成纖維細胞急性損傷[J].中國麻風皮膚病雜志，2015，31（3）：136-139.

[收稿日期]2020-03-06

本文引用格式：周桃花，周紅艷，陳芳，等.人參皂苷Rg1抗長波紫外線對人皮膚成纖維細胞損傷模型的作用研究[J].中國美容醫(yī)學，2021，30（3）：90-93.