參芪復(fù)方浸膏UHPLC指紋圖譜研究

張傳維，畢祿莎，高 泓，謝春光，富曉旭，劉書(shū)瑤，鐘卓伶，徐小平

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

0 引 言

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種代謝性慢性疾病，是排名前三的重大疾病之一，針對(duì)糖尿病治療的研究越來(lái)越受到關(guān)注[1]。不同于化學(xué)藥是單一組分和明確的單一靶點(diǎn)，中藥復(fù)方從機(jī)體系統(tǒng)出發(fā)，具有多靶點(diǎn)協(xié)同作用與毒性分散效應(yīng)的特點(diǎn)[2]，對(duì)2型糖尿病的治療效果更為明顯[3]，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一。參芪復(fù)方浸膏是由成都中醫(yī)藥大學(xué)謝春光教授治療糖尿病多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方，它由人參、黃芪、山藥、丹參、大黃等八味藥材制成，在糖尿病治療中已被證實(shí)具有輔助控制血糖、改善胰島素抵抗、減少糖尿病并發(fā)癥的作用[4-5]。但該復(fù)方涉及藥材眾多，容易受多種因素影響，目前尚未建立相關(guān)質(zhì)量控制的方法。

中藥成分繁雜，質(zhì)量控制方法更為苛刻[6]。同時(shí)中藥質(zhì)量受到藥材產(chǎn)地、品系、季節(jié)、炮制工藝等多種因素的影響，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不完善成為中藥亟待解決的瓶頸，嚴(yán)重制約著中醫(yī)藥研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展[7]。近年來(lái)，指紋圖譜技術(shù)的引入為中藥的質(zhì)量控制提供了新的思路。將中藥成分通過(guò)綜合的、可量化的特征圖展現(xiàn)，并利用中藥相似度評(píng)價(jià)軟件獲得中藥所含成分的相近性，可以充分表達(dá)中藥整體信息，實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方的整體質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。為此，本研究擬采用超高效液相色譜對(duì)參芪復(fù)方浸膏進(jìn)行分離分析，獲得其指紋圖譜，并通過(guò)中藥相似度評(píng)價(jià)軟件完成不同藥材產(chǎn)地對(duì)質(zhì)量影響的考察，為建立全面、可靠的參芪復(fù)方浸膏質(zhì)量控制體系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器

島津LC-2010A超高效液相色譜儀（島津（中國(guó)）分析儀器有限公司）；U3000 UHPLC+Q-Exactive高分辨質(zhì)譜（賽默飛世爾公司）；HC-500A型華晨高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）；MP3002J萬(wàn)分之一電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（成都市予華偉業(yè)儀器有限公司）；XW-80A螺旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；DL-1電子萬(wàn)用電爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；RE-52系列螺旋蒸發(fā)器（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；80-2臺(tái)式低速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；BT 125D十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲酸AR（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；乙腈（HPLC，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（HPLC，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（分析純，成都高新區(qū)石羊化學(xué)制劑廠）；用于浸膏制備和標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制的水為純凈水；用于流動(dòng)相配制的水為超純水。

1.3 材料

復(fù)方由不同產(chǎn)地人參、生地黃、山藥、天花粉、黃芪等8味藥材組成，均來(lái)自成都市藥材市場(chǎng)，藥材產(chǎn)地及批號(hào)見(jiàn)表1。參芪復(fù)方浸膏由實(shí)驗(yàn)室自制，共制備11批（S1-S11）。

表1 藥材產(chǎn)地與批號(hào)

對(duì)照品（R）：人參皂苷 Re9（R1）、人參皂苷Rb1（R2）、人參皂苷 Rg1（R3）、芒柄花黃素（R4）、隱丹參酮（R5）、大黃素（R6）、尿囊素（R7）、類(lèi)葉升麻苷（R8）、大黃酸（R9）、毛蕊異黃酮苷（R10）、丹參酮ⅡA（R11）、原兒茶醛（R12）、馬錢(qián)苷（R13）、大黃酚（R14）、梓醇（R15）、丹酚酸 B（R16）、蘆薈大黃素（R17）、大黃素甲醚（R18）、丹參酮Ⅰ（R19）、丹參素（R20）、莫諾苷（R21）對(duì)照品均來(lái)自于上海摩楷生物科技有限公司。

1.4 參芪復(fù)方浸膏的制備

將人參、黃芪、天花粉、山藥、生地黃等粉碎成粗粉，取人參粗粉15 g，精密稱(chēng)定，以30%乙醇150 mL浸漬24 h后，濾過(guò)，分別收集濾液和濾渣。將濾液加熱濃縮成稠膏備用。然后，分別稱(chēng)取黃芪、天花粉、山藥、生地黃等粗粉 15，10，10，10，10，10，6 g與人參浸漬后的濾渣混合，加水750 mL，煎煮兩次，每次 40 min，經(jīng)離心（4 000 r/min）10 min，過(guò)濾，合并濾液。濾液與人參浸膏合并，進(jìn)一步濃縮為稠膏（每毫升浸膏含有1.72 g生藥）。

1.5 供試品溶液的制備

取參芪復(fù)方浸膏1 g，精密稱(chēng)定。置25 mL量瓶中，分別加甲醇和水各10 mL溶解，超聲20 min，用甲醇定容至刻度。取10 mL于4 000 r/min離心20 min，上清液蒸干，殘?jiān)?0%乙腈2 mL復(fù)溶，過(guò)濾后（0.45 μm），即得供試品溶液。

1.6 混合對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加甲醇制備成混合對(duì)照品溶液作為儲(chǔ)備液結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 混合對(duì)照品濃度一覽表 μg/mL

1.7 色譜條件

Opalshell C18色譜柱（100 mm×4.6mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為A相：0.1%甲酸乙腈溶液，B相：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫條件（表3）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL。

表3 HPLC梯度洗脫條件

1.8 質(zhì)譜條件

掃描質(zhì)量范圍 (m/z)：70～1 050；分辨率：70 000；鞘氣流量：35 mL/min；輔助氣流量：15 mL/min；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；輔助氣加熱溫度：350 ℃。

2 結(jié)果和分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 精密度考察

取參芪復(fù)方浸膏1 g，精密稱(chēng)定，置于25 mL容量瓶中，按照1.5所述方法制備供試品溶液，按照1.7色譜條件進(jìn)行分析，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，獲得色譜圖，對(duì)各共有峰的保留時(shí)間、峰面積、拖尾因子和分離度分別計(jì)算其RSD。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD介于0.02%～0.16%，峰面積RSD介于0.34%～2.45%，表現(xiàn)出較好的精密度。

2.1.2 重復(fù)性考察

取參芪復(fù)方浸膏1 g，精密稱(chēng)定，置于25 mL容量瓶中，按1.5方法制備供試品溶液，平行實(shí)驗(yàn)6次，按1.7色譜條件進(jìn)行分析，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，獲得色譜圖，對(duì)各共有峰的保留時(shí)間、峰面積、拖尾因子和分離度分別計(jì)算其RSD。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD介于0.03%～0.16%，峰面積RSD介于1.26%～2.26%，表現(xiàn)出具有較好的重復(fù)性。

2.1.3 穩(wěn)定性考察

取參芪復(fù)方浸膏1 g，精密稱(chēng)定，置于25 mL容量瓶中，按1.5方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，8，l6，24 h時(shí)，按 1.7色譜條件進(jìn)行UHPLC分析，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，獲得色譜圖，對(duì)各共有峰的保留時(shí)間、峰面積、拖尾因子和分離度分別計(jì)算其RSD。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD介于0.02%～0.24%，峰面積RSD介于0.94%～1.77%，說(shuō)明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 特征峰定性分析

2.2.1 LC/MS/MS鑒定

通過(guò)UHPLC+Q-Exactive高分辨質(zhì)譜對(duì)色譜峰的成分進(jìn)行鑒定。采用正離子與負(fù)離子檢測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，獲得總離子流色譜。樣品在負(fù)離子檢測(cè)模式下各組分響應(yīng)情況更好，如圖1所示，部分在負(fù)離子模式下無(wú)響應(yīng)的組分通過(guò)正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)比較對(duì)照品的保留時(shí)間，查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析各峰組分的裂解途徑[8-15]，初步推斷20個(gè)峰所對(duì)應(yīng)化合物的名稱(chēng)和結(jié)構(gòu)。

圖1 負(fù)離子檢測(cè)模式下參芪復(fù)方浸膏供試品色譜總離子流

以保留時(shí)間（tR）為24.53 min的5號(hào)峰組分為例，該組分主要以[M+Na]+準(zhǔn)分子離子形式存在，m/z為413.140 2，裂解為5種碎片，m/z 413的離子丟失一分子水（18Da）形成m/z 395的碎片離子，丟失一分子甲醇（32Da）生成m/z 381離子，丟失一分子水和一分子甲醇（50Da）生成m/z 363的碎片離子，母核發(fā)生裂解，丟失中性碎片C6H8O3生成m/z為285的離子，丟失一分子甲醇與一分子末端葡萄糖殘基生成m/z為219的離子，殘留m/z 185葡萄糖殘基[M+Na]+碎片離子。比較質(zhì)譜圖與有關(guān)文獻(xiàn)記錄可以推斷5號(hào)峰為馬錢(qián)苷（390.38，C17H26O10）。其他共有峰以相同方式進(jìn)行鑒定如表4所示。

表4 準(zhǔn)分子離子、碎片離子信息與成分鑒定

2.2.2 混合對(duì)照品鑒定

按照1.6方法配制混合對(duì)照品溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各組分色譜參數(shù)如表5所示。通過(guò)將參芪復(fù)方浸膏樣品色譜圖與混合對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比對(duì)，混合對(duì)照品色譜圖中20個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)組分與LC/MS/MS鑒定結(jié)果一致，如圖2所示。

表5 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各組分色譜參數(shù)表

圖2 混合對(duì)照品色譜圖

2.3 基于指紋圖譜的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 相似度分析

取不同產(chǎn)地藥材，按照1.4方法制備成批號(hào)為S1-S11的11批參芪復(fù)方浸膏，按照1.5方法制備供試品，通過(guò)高效液相色譜獲得11批色譜圖，將色譜圖導(dǎo)入“國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件”設(shè)置樣品參考譜，采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，以S1為參考圖譜，標(biāo)定21個(gè)峰作為考察相似度的共有峰，并生成對(duì)照?qǐng)D譜R（圖3）。計(jì)算11批參芪復(fù)方浸膏與指紋圖譜共有峰之間的相似度，結(jié)果表明11批參芪復(fù)方浸膏指紋圖譜相似度在0.721～0.972之間，其中S1與S2稍低，S5與 S6相近，S3與 S4相近，S7、S8與S9相似，S10與S11相似。表明不同批次供試品溶液所含化學(xué)成分基本一致，但不同批次間各峰的峰面積有一定差異，表明不同產(chǎn)地的藥材對(duì)參芪浸膏樣品的各成分的含量有一定的影響。

圖3 參芪復(fù)方浸膏的指紋圖譜

2.3.2 聚類(lèi)分析

采用SPSS 22.0對(duì)11批次參芪復(fù)方浸膏指紋圖譜的21個(gè)共有峰相對(duì)面積進(jìn)行聚類(lèi)分析，對(duì)樣品集合通過(guò)數(shù)量化方式進(jìn)行分類(lèi)，從而用數(shù)量化定義樣品之間的相似程度。采用Ward聯(lián)結(jié)法，度量標(biāo)準(zhǔn)為歐氏平方距離，設(shè)置歐氏距離為5，將11批樣品聚為5類(lèi)，如圖4所示。其中S7、S10、S11聚為一類(lèi)，S3與S4聚為一類(lèi)，S1與S2聚為一類(lèi)，S5與S6聚為一類(lèi)，S8與S9聚為一類(lèi)，結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，說(shuō)明藥材產(chǎn)地的不同對(duì)參芪復(fù)方浸膏的質(zhì)量有一定的影響。

圖4 11批參芪復(fù)方浸膏供試品的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

2.3.3 主成分分析

將11批次參芪復(fù)方浸膏樣品的指紋圖譜的21個(gè)共有峰的峰面積作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析，得到各主成分的特征值及貢獻(xiàn)率與主成分得分系數(shù)矩陣。表6結(jié)果顯示前3個(gè)主成分特征值均大于1，其中第一主成分特征值為14.833，方差貢獻(xiàn)率為70.634%，第二主成分特征值為3.315，方差貢獻(xiàn)率為15.787%，第三主成分特征值為1.884，方差貢獻(xiàn)率為8.97%，3個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到95.391%，確定了3個(gè)主成分。主成分得分系數(shù)矩陣如表7所示，結(jié)果顯示峰9在第一主成分上有較高的荷載，峰7、峰18、峰19在第二主成分上有較高荷載，峰1、峰21在第三主成分上有較高荷載。

表6 參芪復(fù)方浸膏樣品前3個(gè)主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表7 主成分得分系數(shù)矩陣

根據(jù)各主成分載荷因子得分除以相應(yīng)特征值的算術(shù)平方根計(jì)算得到各批次的綜合得分（表8）。依據(jù)綜合得分結(jié)果將11批次排序并分類(lèi)。S3與S4得分最高，可以歸為一類(lèi)，S1和S2歸為一類(lèi)，S8與S9得分靠近，S10與S11得分最低歸為一類(lèi)，其余歸為一類(lèi)。由此可見(jiàn)，此結(jié)果與相似度分析及聚類(lèi)分析的分類(lèi)結(jié)果基本一致，說(shuō)明不同產(chǎn)地的藥材成分有較大的差別。

表8 主成分綜合得分結(jié)果

3 討 論

中藥的成分復(fù)雜，質(zhì)量控制難度較大。指紋圖譜為中藥提供了一個(gè)質(zhì)量控制指標(biāo)，因其具有特征性強(qiáng)、整體性和模糊性的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于中藥制劑的綜合評(píng)價(jià)和綜合控制。本研究針對(duì)參芪復(fù)方浸膏，考察了UHPLC的柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫梯度、洗脫溶劑、提取方法等對(duì)樣品復(fù)雜組分分離的影響，建立了UHPLC指紋圖譜分析方法，利用本品的指紋圖譜對(duì)其本品浸膏及其藥材進(jìn)行質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)控制。所建方法高效、靈敏，較好地展現(xiàn)了本品浸膏及其藥材的組分分布和溯源，指紋圖譜中的相關(guān)峰峰面積精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD均小于2.45%，相對(duì)保留時(shí)間的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于0.24%，反映出本法具有較好的穩(wěn)定性和可控性。

中藥的質(zhì)量和療效常受到多種成分的共同影響，所含化學(xué)成分眾多且復(fù)雜，因此成分鑒定難度較大。而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將液相色譜優(yōu)異的分離性能與質(zhì)譜高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)相結(jié)合，可以建立快速、高效的中藥成分分析方法。本研究中參芪復(fù)方浸膏由8種藥材煎煮而成，含有大量復(fù)雜化合物，但低分辨率質(zhì)譜無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)未知復(fù)雜化合物的結(jié)構(gòu)解析，因此采用UHPLC聯(lián)用Q-Exactive高分辨質(zhì)譜對(duì)參芪復(fù)方浸膏供試品溶液進(jìn)行分析，通過(guò)混合對(duì)照品HPLC色譜圖與參芪復(fù)方浸膏供試品色譜峰保留時(shí)間的對(duì)比分析，以及通過(guò)查閱文獻(xiàn)，分析裂解途徑，推斷組分的結(jié)構(gòu)與名稱(chēng)，確定了二十個(gè)在參芪復(fù)方浸膏中展現(xiàn)較好、峰形較為對(duì)稱(chēng)、分離度良好的有效藥用成分，為后期將其作為質(zhì)控指標(biāo)的確定奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)參芪復(fù)方浸膏指紋圖譜的研究，可以考察不同藥材原產(chǎn)地與參芪復(fù)方浸膏質(zhì)量的影響。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析軟件SPSS對(duì)11批參芪復(fù)方浸膏指紋圖譜相似度分析、聚類(lèi)分析及主成分分析，3種評(píng)價(jià)方法所獲結(jié)果基本一致，將主要批次共聚為了5類(lèi)，說(shuō)明了不同產(chǎn)地藥材對(duì)參芪復(fù)方浸膏的質(zhì)量有一定的影響，有可能導(dǎo)致臨床療效的差異，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)地與藥材有效成分質(zhì)量的相關(guān)性。

基于指紋圖譜綜合性、整體性的特點(diǎn)，建立全面、多指標(biāo)的中藥質(zhì)量控制方法，在未來(lái)可以實(shí)現(xiàn)處方工藝生產(chǎn)的全程監(jiān)控，從而保證不同批次間中藥質(zhì)量的穩(wěn)定，對(duì)于推進(jìn)中藥的臨床應(yīng)用，促進(jìn)其進(jìn)一步發(fā)展具有重要的意義。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文利用超高效液相色譜（UHPLC）對(duì)參芪復(fù)方浸膏進(jìn)行質(zhì)量控制研究。建立了參芪復(fù)方指紋圖譜，并結(jié)合LC-MS/MS所獲得的碎片離子信息，成功鑒定20個(gè)共有峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)?；谥讣y圖譜，對(duì)11批參芪復(fù)方浸膏進(jìn)行了相似度分析、聚類(lèi)分析、主成分分析，考察了藥材不同產(chǎn)地對(duì)參芪復(fù)方浸膏質(zhì)量的影響。該指紋圖譜方法被驗(yàn)證對(duì)參芪復(fù)方浸膏的質(zhì)量控制具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬性與良好的穩(wěn)定性，能較為全面、客觀的反應(yīng)參芪復(fù)方浸膏的質(zhì)量，也可用于對(duì)不同批次參芪復(fù)方浸膏的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)，為提高和完善參芪復(fù)方浸膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考和依據(jù)。該研究為進(jìn)一步確定參芪復(fù)方浸膏質(zhì)量控制的定量標(biāo)志物，探尋外部因素對(duì)藥材有效成分質(zhì)量的影響提供了基礎(chǔ)，通過(guò)全面的測(cè)定方法對(duì)藥材的生產(chǎn)加工過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，從而保證中藥復(fù)方的質(zhì)量穩(wěn)定可靠。