鹽度變化對虹鱒和硬頭鱒抗氧化酶活性的影響?

楊靜雯， 楊小剛， 黃 銘， 周演根??， 高勤峰,2， 董雙林,2

(1．教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003； 2．青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)是同一品種，屬冷水型魚[1-2]，其中硬頭鱒是降海洄游型，在淡水中生長到合適規(guī)格后洄游入海[3-4]；虹鱒為陸封型，通常在淡水中養(yǎng)殖，但可進行海水馴養(yǎng)[5]。已有研究表明虹鱒在適宜海水鹽度中，其抗病力和生長狀況均有所提高[6]。近年來，中國科技工作者采用陸海接力模式在黃海冷水團養(yǎng)殖虹鱒和硬頭鱒，即先在淡水中培育魚種，待長到一定規(guī)格后再進行鹽度馴化并移入海水中養(yǎng)殖[7]，故最適鹽度馴化方式養(yǎng)殖虹鱒和硬頭鱒，更有利于其在進入海水后存活和生長。

鹽度是水環(huán)境中重要的理化因子，對魚類的滲透壓及生存生長有著重要影響[8]。魚類對鹽度的適應(yīng)取決于其鰓、腎和腸的滲透調(diào)節(jié)功能[9]。當(dāng)環(huán)境鹽度改變時，會引起魚體產(chǎn)生多種生理應(yīng)激反應(yīng)，相應(yīng)地魚體活性氧(ROS)的產(chǎn)生也會增多[10]。未被及時清除的ROS會對魚體產(chǎn)生損害，引起酶失活、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷等不利影響[11-12]，并且還會攻擊魚體的免疫防疫機制，進一步破壞魚體的正常生長和存活。丙二醛(MDA)作為活性氧攻擊生物膜產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其濃度高低可作為活性氧引起毒性大小的指標[13]。魚類擁有抗氧化酶系統(tǒng)，其中抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)[14]，此系統(tǒng)對清除過量的活性氧自由基、緩解自身損害和提高免疫細胞的防御能力有重要作用[15]。在非適宜鹽度環(huán)境下，抗氧化酶系統(tǒng)是魚體抵抗環(huán)境脅迫重要的免疫防御系統(tǒng)[16]。

有關(guān)鹽度對虹鱒及硬頭鱒的消化酶[17]、滲透生理[7]和死亡率[18]等生長指標的影響已有報道，但鹽度變化對虹鱒和硬頭鱒抗氧化酶活性影響的研究鮮有報道，為探究鹽度馴化方式對虹鱒和硬頭鱒免疫防御的影響，本研究比較分析了不同鹽度變化下虹鱒和硬頭鱒肝臟抗氧化酶的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗用虹鱒和硬頭鱒均采自山東省日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司鮭鱒魚繁育基地，孵化自丹麥進口三倍體受精卵，平均體重虹鱒為(99.44±0.26) g(下文簡寫為99 g虹鱒)、硬頭鱒為(99.01±0.61) g(下文簡寫為99 g硬頭鱒)和(394.50±1.16) g(下文簡寫為395 g硬頭鱒)，將其淡水暫養(yǎng)2周，養(yǎng)殖容器為圓形玻璃纖維水槽(180 L，R=0.32 m，H=0.60 m)。實驗期間，每天8:00和16:00分別投喂人工配合飼料1次。每天換水1次，每次換水約100%，暫養(yǎng)和實驗過程均為飽食投喂。

1.2 實驗設(shè)計

暫養(yǎng)結(jié)束后，選用相同規(guī)格、活潑健壯的虹鱒和硬頭鱒開展實驗。每個實驗都設(shè)置了相同的4個鹽度馴化方式，T0組：淡水對照組，T30組：從淡水直接過渡至鹽度30，T2組和T6組：從淡水直接過渡至鹽度14，鹽度增加速度分別為2/d(T2)和6/d(T6)，以使其適應(yīng)鹽度變化。每個鹽度馴化方式設(shè)3個平行，其中99 g虹鱒和99 g硬頭鱒實驗每個平行放養(yǎng)24尾魚，395 g硬頭鱒實驗每個平行放養(yǎng)8尾魚。

養(yǎng)殖容器與暫養(yǎng)容器相同。實驗用水由經(jīng)過沉淀的自然海水(鹽度為30)和淡水(鹽度為0)調(diào)配而成。實驗期間溫度(16.0±0.5) ℃，溶氧維持在6.0 mg·L-1以上，pH為8.0±0.2，氨氮水平<0.5 mg·L-1，光照周期L∶D=12∶12。為保證水體中溶氧充足，每個水槽采用2個氣石，并用氣泵24 h充氣，3個實驗都持續(xù)40 d。

1.3 樣品的采集與處理

99 g虹鱒和99 g硬頭鱒分別在升至鹽度30后的0.5、1、4、8、15和40 d取樣，各組隨機取3尾魚。395 g硬頭鱒不同處理組僅在40 d時取樣，各組隨機取5尾魚。取樣前停食24 h后，使用麻醉劑MS-222(40 mg·L-1)對魚進行麻醉后進行靜脈采血。血液4 ℃冰箱放置3 h自然分層后，4 000 r/min離心10 min后抽取上層血清，用于血清抗氧化酶及丙二醛(MDA)含量的測定。

1.4 指標測定

超氧化物歧化酶(SOD)用WST-1法測定，在450 nm處比色測定吸光度值計算其活性，活性單位定義為：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個活性單位。過氧化氫酶(CAT)用可見光法測定，在405 nm處測定H2O2減少的量，活性單位定義為：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個活性單位。谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性通過測定在412 nm波長下谷胱甘肽(GSH)的消耗量計算得出，活性單位定義：每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活性單位。丙二醛(MDA)的含量采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定?？偟鞍缀坎捎每捡R斯亮藍蛋白測定試劑盒進行測定，以牛血清蛋白為標準，計算出總蛋白含量。酶活力、丙二醛及組織總蛋白含量的測定均按南京建成試劑盒進行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA)進行分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Tukey比較組間差異[19]，以P<0.05作為差異顯著水平。數(shù)據(jù)采用雙因素方差(Two-way ANOVA)，以確定不同鹽度馴化方式和時間之間是否存在顯著差異和相互作用。

2 實驗結(jié)果

2.1 鹽度馴化對虹鱒抗氧化酶和MDA含量的影響

如表1所示，99 g虹鱒血清中SOD活性受鹽度馴化方式、時間及其交互作用的影響作用顯著(P<0.05)。隨著鹽度變化SOD活性如下見圖1A。比較不同處理組的SOD活性發(fā)現(xiàn)，T0組(對照組)99 g虹鱒SOD活性基本保持穩(wěn)定，T2組99 g虹鱒SOD活性，除第4天外，其余時間與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，T6組99 g虹鱒SOD活性呈現(xiàn)先上升，在4 d時達到頂峰，隨后下降，在實驗結(jié)束時顯著高于T0組。T30組99 g虹鱒SOD活性先上升，在4 d達到頂峰后下降，并在8 d后趨于穩(wěn)定，在鹽度馴化開始與結(jié)束時，T30組SOD活性均顯著高于T0組(P<0.05)。

比較不同處理組的GSH-Px活性發(fā)現(xiàn)，99 g虹鱒血清中GSH-Px活性受鹽度馴化方式、時間及其交互作用的影響顯著(P<0.05，見表1)。隨著時間延長，各組虹鱒GSH-Px活性見圖1B。T2組99 g虹鱒GSH-Px活性在第1 天顯著增高(P<0.05)并且達到最高值，之后活性降低并在15 d后穩(wěn)定。T6組和T30組99 g虹鱒GSH-Px活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均在4 d時達到最大值，隨之下降在15 d后趨于穩(wěn)定。在整個鹽度馴化實驗期間，T30組99 g虹鱒GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05)。

通過不同處理組的MDA含量發(fā)現(xiàn)，99 g虹鱒血清中MDA含量受鹽度馴化方式、時間及其交互作用的影響顯著(P<0.05，見表1)。不同鹽度馴化方式下虹鱒血清MDA含量見圖1C。T0組99 g虹鱒MDA含量在40 d內(nèi)無顯著變化。T2組99 g虹鱒MDA含量4 d內(nèi)升高，在4 d后顯著降低，在8 d后與T0組無顯著差異(P>0.05)。T6組和T30組99 g虹鱒MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在4 d時達到頂峰且顯著高于其余各組(P<0.05),并在8 d后趨于穩(wěn)定。在鹽度馴化實驗結(jié)束時，T30組99 g虹鱒MDA含量顯著高于其余各組(P<0.05)。

表1 馴化方式和時間對99 g虹鱒抗氧化酶影響的雙因素P值

2.2 鹽度馴化對不同規(guī)格硬頭鱒抗氧化酶和MDA含量的影響

2.2.1 鹽度馴化對99 g硬頭鱒抗氧化酶和MDA含量的影響 如表2所示，99 g硬頭鱒血清中SOD活性受鹽度馴化方式、時間及其交互作用的影響顯著(P<0.05，見表2)。不同鹽度馴化方式下硬頭鱒血清SOD活性見圖2A。比較不同處理組SOD活性發(fā)現(xiàn)，與99 g虹鱒一樣，整個實驗期內(nèi)T0組(對照組)99 g硬頭鱒SOD活性無顯著變化，在40 d時T6、T30組顯著高于T0組(P<0.05)。T2組99 g硬頭鱒SOD活性在第1天達到最大值，此后保持在較高水平，在第8天顯著下降，在40 d時與對照組SOD活性無顯著差異(P>0.05)。T6和T30組99 g硬頭鱒SOD活性先增高后下降，在第4天升高到峰值，而后下降，在8 d后趨于穩(wěn)定，鹽度馴化結(jié)束時，T6組和T30組99 g硬頭鱒SOD活性顯著高于T2組(P<0.05)。

鹽度馴化方式、時間及其交互作用對99 g硬頭鱒血清中GSH-Px活性的影響顯著(P<0.05，見表2)。不同鹽度馴化方式下硬頭鱒血清GSH-Px活性見圖2B。T0組99 g硬頭鱒GPH-PX活性在40 d內(nèi)保持穩(wěn)定。隨著時間延長，T2組99 g硬頭鱒GSH-Px活性在4 d時顯著升高，之后降低，在8 d后保持穩(wěn)定且與T0組差異不顯著(P>0.05)。T6和T30組99 g硬頭鱒GSH-Px活性在第1天顯著升高，在4 d時達到頂峰且顯著高于其余各組(P<0.05)，之后下降，于15 d后趨于穩(wěn)定。

(不同小寫字母表示同一時間點不同鹽度處理組間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一鹽度處理組下不同時間差異顯著(P<0.05)，下同。Different lower-case letters represent significant difference among different salinity acclimatization treatments at the same time (P<0.05), while different capital letters denote the significant difference among different time points at the same salinity acclimatization treatments (P<0.05), the same below.)

鹽度馴化方式、時間及其交互作用對99 g硬頭鱒血清中MDA含量的影響顯著(P<0.05，見表2)。不同鹽度馴化方式下硬頭鱒血清MDA含量見圖2C。T0組99 g硬頭鱒MDA含量水平在40 d內(nèi)一直處于穩(wěn)定狀態(tài)，T2組99 g硬頭鱒MDA含量先上升后下降，在第4天時達到頂峰，顯著高于其余時間點，之后持續(xù)下降并在15 d后趨于穩(wěn)定，在第40天時，T2組99 g硬頭鱒MDA含量顯著高于T0組(P<0.05)。T6和T30組99 g硬頭鱒MDA含量在0.5 d顯著高于T0組(P<0.05)，之后兩組MDA含量在第4天達到頂峰，顯著高于其他時間點(P<0.05)，第8天后保持穩(wěn)定。在鹽度馴化實驗結(jié)束時，T6和T30組硬頭鱒MDA含量顯著高于T2和T0組(P<0.05)。

表2 馴化方式和時間對99 g硬頭鱒抗氧化酶影響的雙因素P值

2.2.2 鹽度馴化對 395 g硬頭鱒抗氧化酶和MDA的活性的影響 不同鹽度馴化方式下395 g硬頭鱒血清中抗氧化酶活性見圖3。實驗結(jié)束時，T6和T30組395 g硬頭鱒SOD活性顯著高于T0和T2組(P<0.05)，T2組SOD活性與T0組SOD活性無顯著差異。T6組和T30組395 g硬頭鱒CAT活性顯著高于T0組和T2組(P<0.05)，T2組CAT活性與T0組無顯著差異。T2組395 g硬頭鱒GSH-Px活性顯著低于對照組，T6和T30組GSH-Px活性顯著高于T0組(P<0.05)，T30組活性最高，且顯著高于其余各組。T2組395 g硬頭鱒MDA含量與對照組無顯著差異，而T6和T30組395 g硬頭鱒MDA含量顯著高于T0組T2組(P<0.05)。

3 討論

鹽度變化會對魚體產(chǎn)生脅迫，在高滲海水中，滲透壓力會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生多種生理反應(yīng)，為減少損傷，魚體會消耗能量進行滲透壓調(diào)節(jié)[20-21]，此種能量的消耗不僅打破了離子平衡，還與超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)[22]，大量活性氧的產(chǎn)生會引起魚體抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，從而為活性氧的消除提供前體物質(zhì)。當(dāng)鹽度發(fā)生變化時，血清中抗氧化酶會發(fā)生適應(yīng)性變化[23]。

圖2 不同鹽度馴化方式下99 g硬頭鱒的SOD、GSH-Px和MDA含量

本研究中，三種鹽度馴化方式都可改變虹鱒和硬頭鱒的抗氧化酶活性水平。T2、T6和T30組99 g虹鱒和99 g硬頭鱒SOD、GSH-Px活性在前4 d明顯升高并達到最大值。這暗示最初鹽度改變的壓力會導(dǎo)致海洋生物活性氧危害，活性氧分子活性極強，從而引起機體抗氧化酶活性升高與其對抗[9, 24]。孫鵬等[25]對條石鯛(Oplegnathusfasciatus)在不同鹽度實驗也出現(xiàn)了初期抗氧化酶活性顯著升高的現(xiàn)象。類似地，Yin等[26]對(5.80±0.30)g幼魚銀鯧(Pampusargenteus)在4種鹽度下(25、20、15和10)處理96 h后發(fā)現(xiàn)，SOD活性達到最大值，不同的是，鹽度馴化后的銀鯧GSH-Px活性卻呈現(xiàn)出了下降的趨勢，與本實驗99 g虹鱒和99 g硬頭鱒在前4 d GSH-Px活性上升存在差異，這可能是由于不同魚類酶的活性存在差異，但作為對活性氧最敏感的SOD在兩類魚中表現(xiàn)出了相似性。因此，一定范圍生物鹽度變化，會使魚類短期內(nèi)抗氧化酶活性升高。

(不同大寫字母表示同一時間點不同鹽度處理組間差異顯著(P<0.05)。Different capital letters represent the significant difference among different salinity acclimatization treatments at the same time (P<0.05))

隨著鹽度馴化時間延長，本實驗4～8 d內(nèi)T30、T6及T2組99 g虹鱒和99 g硬頭鱒SOD和GSH-Px活性都有不同程度下降。SOD、CAT和GSH-Px活性升高可有效降低活性氧對機體的危害，但在此4～8 d卻出現(xiàn)抗氧化酶下降的趨勢，這表明該時間段99 g虹鱒和99 g硬頭鱒充分調(diào)動機體防御機制應(yīng)對鹽度變化產(chǎn)生的活性氧?？寡趸赴l(fā)揮消除ROS的重要作用，使機體產(chǎn)生的活性氧含量降低，相應(yīng)地抗氧化酶活性水平隨之下降。Zhao等[27]對施氏鱘(Acipenserschrenchii)進行鹽度馴化研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著馴養(yǎng)時間延長抗氧化酶會有不同程度的恢復(fù)，這可能與魚體調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān)。由此可見，在進行鹽度馴化過程中，魚體也在積極緩解脅迫帶來的危害，利用機體更多能量來維持新陳代謝的穩(wěn)定，從而使體內(nèi)酶活力恢復(fù)至正常水平。

本研究中T2組99 g虹鱒和硬頭鱒抗氧化酶在前8 d升高或降低幅度顯著，8 d后趨于穩(wěn)定，基本達到對照組水平，但硬頭鱒SOD活性高于對照組。這可能是硬頭鱒本身有降海習(xí)性，進入海水環(huán)境后其生理、行為會有一定轉(zhuǎn)變，從而會出現(xiàn)相應(yīng)酶分泌能力增強的現(xiàn)象，此種特性更有利于其在進入海水后生長發(fā)育。已有研究報道，鮭鱒魚馴化期1周，可適應(yīng)海水鹽度，移入海域養(yǎng)殖[28]。Xiong等[29]對394.50 g硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)采取不同鹽度馴化方式時發(fā)現(xiàn)，以升鹽速度2/d進行鹽度馴化為最佳過渡方式。本實驗與上述研究得出的結(jié)果基本一致，對于100 g左右的虹鱒和硬頭鱒采用T2方式進行前期馴化，在其進入海水1周左右，抗氧化酶活力基本恢復(fù)到正常水平，這說明兩類魚在此階段可逐漸適應(yīng)鹽度30水環(huán)境。

本實驗T6和T30組99 g虹鱒和99 g硬頭鱒MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但實驗結(jié)束后2組MDA含量仍高于對照組；395 g硬頭鱒MDA含量也出現(xiàn)了相似結(jié)果。這表明在T6組和T30組兩種鹽度馴化下，鹽度變化過快超出了兩類魚自身調(diào)節(jié)所能承受的最大限度，從而使虹鱒和硬頭鱒長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)且不斷產(chǎn)生自由基，抗氧化酶為清除活性氧危害始終處于較高水平狀態(tài)。鹽度變化會導(dǎo)致魚體內(nèi)活性氧攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸，造成脂質(zhì)過氧化，引起MDA含量的快速升高[30]。隨著鹽度馴化時間的延長，魚體適應(yīng)鹽度能力有所增強，及時消除部分過量的活性氧，MDA含量逐漸降低。但魚體在高鹽度脅迫下，長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致T30組MDA含量不能降低到正常水平。相似地，Martinez-Alvarez[31]報道納氏鱘(Acipensernaccarii)在鹽度35環(huán)境中，MDA含量維持在一個較高水平，血漿中抗氧化酶無法有效抑制活性氧的危害。Xu等[32]對海馬(hippocampuskuda)研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度35脅迫下，海馬幼體MDA含量處于較高的狀態(tài)。而本實驗T30組99 g虹鱒和硬頭鱒MDA含量也長時間處于較高水平，此種狀態(tài)打破了最初自由基的動態(tài)平衡，將會對魚體造成一定的損傷。這表明虹鱒和硬頭鱒可能無法適應(yīng)T30與T6組馴化方式。

本實驗中，T2組395 g硬頭鱒MDA含量與對照組無顯著差異，T2組99 g硬頭鱒實驗中MDA含量雖從第8 天逐漸下降，但實驗結(jié)束時未達到對照組水平。推測T2組395 g硬頭鱒經(jīng)過一段時間鹽度馴化，魚體逐漸適應(yīng)其變化，但99 g硬頭鱒仍無法徹底維持體內(nèi)MDA含量的穩(wěn)定，可能與小規(guī)格硬頭鱒抗氧化酶調(diào)節(jié)機制尚不完善有關(guān)。小規(guī)格虹鱒和硬頭鱒雖可通過T2馴化方式逐漸適應(yīng)海水，但其體內(nèi)MDA含量與對照組相比較高，也表明此規(guī)格可能并不是入海最佳規(guī)格。就本實驗的研究結(jié)果而言，入海規(guī)格和其自身適應(yīng)能力呈正相關(guān)性關(guān)系，因此，與99 g硬頭鱒相比，395 g硬頭鱒可能用更短時間即可順利過渡至海水，維持體內(nèi)抗氧化酶的穩(wěn)定。這與Xiong等[29]報道約400 g硬頭鱒達到最佳入海規(guī)格的結(jié)論相符。

4 結(jié)語

本實驗T30組和T6組馴化方式中，99 g虹鱒、99和395 g硬頭鱒抗氧化酶活性紊亂，這表明實驗魚可能無法適應(yīng)該組海水馴化方式。T2組99 g虹鱒、99 g硬頭鱒在實驗前4 d體內(nèi)抗氧化酶水平較高，隨著馴化時間延長，魚體可慢慢適應(yīng)并做出調(diào)節(jié)至良好狀態(tài)，這表明實驗魚可逐漸適應(yīng)T2組馴化方式，但并非最佳入海規(guī)格。此外，鹽度馴化后大規(guī)格(395 g)硬頭鱒體內(nèi)抗氧化酶穩(wěn)定性優(yōu)于小規(guī)格(99g 硬頭鱒)，這表明395 g硬頭鱒對鹽度馴化適應(yīng)能力強于99 g硬頭鱒。