孕早期血清miR-125b、miR-124檢測在唐氏綜合征產(chǎn)前篩查中的價值分析

曾芳，何鳳萍，楊祥康

(1.惠州市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 惠州 516211；2.舟山市婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316000)

唐氏綜合征(down syndrome，DS)又稱為21三體綜合征，主要表現(xiàn)為智力低下、特殊面容、生長發(fā)育障礙，可伴發(fā)多系統(tǒng)疾病。據(jù)調(diào)查，新生兒DS發(fā)病率為1/600～1/800[1]。我國每年約有3萬例DS患兒出生，其發(fā)病率位列各種出生缺陷的第三位[2]。孕期針對胎兒DS進(jìn)行篩查和診斷是降低DS患兒出生率，提高優(yōu)生優(yōu)育水平的關(guān)鍵手段，目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的DS篩查方法為傳統(tǒng)的血清學(xué)DS篩查及無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測[3]，其中血清學(xué)產(chǎn)前篩查由于具有安全、簡便、高效的優(yōu)勢而被作為臨床常規(guī)篩查手段。但在產(chǎn)前篩查中，血清學(xué)DS篩查存在的孕早期檢出率低等問題越來越受到關(guān)注，據(jù)統(tǒng)計(jì)，傳統(tǒng)血清學(xué)DS篩查的檢出率仍只能達(dá)到約60%[4]。因此，近年來，超聲檢測胎兒頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency，NT)厚度、高通量測序技術(shù)檢測母體外周血胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cff DNA)等輔助手段被用于提高DS篩查的檢出率，但這些檢測方法仍然無法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的羊水細(xì)胞染色體核型分析[5]。微小RNA(microRNAs，miRNAs/miR)是近年來學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注的表觀遺傳學(xué)血清標(biāo)志物。有研究[6]結(jié)果顯示DS的發(fā)生和發(fā)展與多種miRNAs的異常表達(dá)有關(guān)，但miRNAs能否作為孕早期血清標(biāo)志物用于輔助篩查診斷DS仍存在爭議。基于此，本研究選取了70例經(jīng)傳統(tǒng)血清學(xué)篩查或胎兒NT檢測提示DS高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦作為研究對象，分析孕早期血清miR-125b、miR-124水平在DS產(chǎn)前篩查中的價值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2019年1月在舟山市婦女兒童醫(yī)院接受孕早期(10～14周)二聯(lián)血清學(xué)唐篩檢查及胎兒頸項(xiàng)透明層(NT)檢查，至少一項(xiàng)結(jié)果提示DS胎兒高風(fēng)險(xiǎn)的70例孕婦，經(jīng)羊水穿刺取羊水細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析，35例確診為DS胎兒孕婦作為病例組，35名為正常妊娠孕婦作為對照組。兩組孕婦均簽署知情同意書自愿參與本研究，研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。病例組孕婦經(jīng)本人和家屬同意后終止妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙胎或多胎妊娠孕婦；通過輔助生殖手段受孕者；具有DS家族遺傳史或既往DS患兒分娩史的孕婦；合并惡性腫瘤、重度高血壓、糖尿病及慢性心腦血管病的孕婦。

1.2 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.2.1 基線資料 通過查閱病歷及生育手冊收集兩組孕婦的年齡、孕周、孕次、產(chǎn)次、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、有害物質(zhì)接受史、吸煙史、服用葉酸時間短于3個月比例等基線資料。

1.2.2 血清學(xué)篩查 孕早期留取受檢孕婦空腹外周血3 mL，離心后取血清置于-20 ℃保存，72 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測。采用ACCESS2 型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國Beckman Coulter公司)對血清妊娠相關(guān)血漿蛋白A、人絨毛膜促性腺激素水平進(jìn)行檢測。采用Muldeale軟件根據(jù)血清學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果及孕婦的年齡、體重、孕周、孕產(chǎn)史等變量計(jì)算DS風(fēng)險(xiǎn)值，當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶270時判定為高風(fēng)險(xiǎn)，記為血清學(xué)篩查陽性。

1.2.3 胎兒NT篩查 采用iU22B多普勒超聲儀(美國Philips公司)對胎兒NT厚度進(jìn)行檢測，超聲探頭頻率設(shè)定為2.0～5.0 MHz，檢查時將胎兒的頭部和上胸部的超聲圖像放大，于胎兒頸部皮膚高回聲帶深部尋找NT，其在超聲圖像顯示為低回聲和無回聲，于NT最寬處對其與皮膚的垂直光帶距離進(jìn)行測量。每例胎兒均重復(fù)檢測3次，取其中最大值作為測量值，當(dāng)NT>2.5 mm時判定為DS高風(fēng)險(xiǎn)，記為NT篩查陽性。

1.2.4 血清miR-125b、miR-124相對表達(dá)量 孕早期留取受檢孕婦空腹外周血2 mL，離心后取血清置于-18 ℃待測。采用Trizol reagent RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)對血清樣本總RNA進(jìn)行提取，采用7 500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)應(yīng)用實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法對血清miR-125b、miR-124相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，以U6為內(nèi)參，RNA催化合成采用cDNA：PrimerScriptTMRT試劑盒，RNA擴(kuò)增采用SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒，待測RNA和內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物序列見表1，反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)5 μL、PCR Forward Primer 0.4 μL、Uni-miR qPCR Primer 0.4 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、cDNA模板 1μL、dH2O 3 μL，共10 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共反應(yīng)40個循環(huán)。采用熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，采用Opticon Monitor軟件計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)，采用2-△△Ct法計(jì)算待測RNA的相對表達(dá)量，計(jì)算公式為：△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct檢測樣品-△Ct基準(zhǔn)樣品。

表1 miR-125b、miR-124及內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦基線資料的比較

兩組孕婦年齡、孕周、孕次、產(chǎn)次、BMI比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，病例組孕婦有害物質(zhì)接觸史、吸煙史及服用葉酸時間短于3個月比例高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 兩組孕婦血清學(xué)和胎兒NT篩查結(jié)果及血清miR-125b、miR-124相對表達(dá)量的比較

病例組孕婦的血清學(xué)篩查陽性率及血清miR-124相對表達(dá)量高于對照組孕婦，血清miR-125b表達(dá)量低于對照組孕婦，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組孕婦胎兒NT篩查陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組孕婦基線資料的比較

表3 兩組孕婦血清學(xué)和胎兒NT篩查結(jié)果及血清miR-125b、miR-124相對表達(dá)量的比較

2.3 血清學(xué)篩查、胎兒NT檢測及血清miR-125b、miR-124水平在DS診斷中的價值分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，孕早期血清學(xué)篩查及血清miR-125b、miR-124水平診斷DS的AUC均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以血清miR-124a水平的AUC最高，為0.906，在Cut-off值下靈敏度和特異度分別為0.657、0.971，而孕早期胎兒NT檢測診斷DS的AUC無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖1。

表4 孕早期血清學(xué)篩查、胎兒NT檢測及血清miR-125b、miR-124水平檢測診斷DS的ROC曲線分析

3 討論

根據(jù)相關(guān)研究[7]報(bào)道，血清學(xué)篩查在孕早期對DS的檢出率相對較低，而在孕中期可達(dá)到超過75%。有一些學(xué)者提出了采用孕早中期階段性序貫血清學(xué)DS篩查來提高診斷靈敏度，減少漏篩病例[8]。也有研究[9]顯示，雖然DS早中孕期聯(lián)合血清篩查方案優(yōu)于單獨(dú)早孕期血清篩查方案，但其診斷效率的差異并無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且對于開放性神經(jīng)管缺陷等其它先天畸形的篩查效果不佳。因此，在近年來的研究中，學(xué)者們一般主張將血清學(xué)篩查與超聲胎兒NT檢測聯(lián)合作為孕早期的DS篩查手段[10]，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，這兩種方法不能互相取代，聯(lián)合應(yīng)用可在一定程度上提升診斷的準(zhǔn)確性[11]，故臨床上也將這兩種篩查方法之一提示高風(fēng)險(xiǎn)作為有創(chuàng)性診斷羊水穿刺的指征。本研究結(jié)果顯示，正常孕婦在孕早期胎兒NT檢測的陽性率與DS胎兒孕婦的差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，假陰性率較高是導(dǎo)致該方法診斷DS效率較低的主要因素。分析其原因，可能是孕早期DS胎兒超聲軟指標(biāo)表現(xiàn)比較多樣，胎兒的超聲表現(xiàn)一般以NT增厚、鼻骨發(fā)育不良、鼻骨缺如、頸后皮膚(NF)增厚為主，少數(shù)胎兒可伴有第5指中節(jié)指骨發(fā)育不良、股骨肱骨短、腎盂分離、心室點(diǎn)狀強(qiáng)回聲、草鞋足等遺傳學(xué)超聲特征,這些復(fù)雜的超聲特征易造成臨床誤診[12]；同時，相關(guān)研究[13]結(jié)果顯示，在未經(jīng)強(qiáng)化培訓(xùn)和學(xué)習(xí)的情況下，不同超聲科醫(yī)師對胎兒NT的檢測數(shù)據(jù)偏倚較大，其原因可能與測量時的胎兒體位及測量游標(biāo)位置不穩(wěn)定有關(guān)。因此，雖然血清學(xué)篩查和胎兒NT檢測能夠?qū)S篩查中發(fā)揮積極的作用，但對于輔助診斷DS的作用明顯不足，特別是可導(dǎo)致不必要的有創(chuàng)檢測及一定程度的假陽性率。

雖然DS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已形成了染色體配對重組異常、紡錘體組裝檢查點(diǎn)異常、端粒長度減少、黏連蛋白異常、卵母細(xì)胞鑲嵌選擇模型、維持DNA穩(wěn)定性相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性等多種病理機(jī)制觀點(diǎn)[14]。基于這些觀點(diǎn)，母血中游離miRNAs作為一種新的非侵入性表觀遺傳學(xué)早期標(biāo)志物被引入DS產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，其中，針對miR-125b、miR-99a、let-7c、miR-155、miR-802等5種人類21號染色體21q21.1-21.3位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄miRNAs的研究最多，這5種miRNAs參與了DS的可變表型，但DS胎兒全基因組miRNA表達(dá)的變化尚待確定[15]。miR-125b是一種廣受關(guān)注的DS 標(biāo)志物，具有調(diào)節(jié)B細(xì)胞反應(yīng)的作用，在DS患者人群中，miR-125b在其扁桃體記憶B細(xì)胞和血漿細(xì)胞中的表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)[16]；在DS胎兒的胎盤組織中，miR-125b表達(dá)量也會出現(xiàn)上調(diào)，能夠?qū)μケP發(fā)育相關(guān)基因發(fā)揮調(diào)控作用，從而參與DS的胎盤受損及相關(guān)妊娠病理過程[17]。進(jìn)一步的研究[18]結(jié)果顯示，DS患者外周血miR-125b的高表達(dá)可能與其神經(jīng)病理病變及先天性心臟病、白血病、低實(shí)體瘤等合并癥的發(fā)生率有關(guān)。然而，針對DS胎兒及其母體孕期血清miR-125b水平的研究結(jié)果則與上述結(jié)果存著明顯的分歧：例如，有研究[19]報(bào)道稱，孕婦中的細(xì)胞外miR-125b水平高于非孕婦，但其相對表達(dá)量在整倍體胎兒和DS胎兒之間無顯著的差異；同一研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表的報(bào)道[20-21]甚至得出了完全相悖的研究結(jié)論。研究結(jié)果可見，DS胎兒母體在孕早期出現(xiàn)了外周血miR-125b表達(dá)的下調(diào)，這種現(xiàn)象在先天性心臟病胎兒母體[22]和子癇前期孕婦[23]中也可觀察到。相關(guān)基礎(chǔ)研究[24-26]也證實(shí)，較高的miR-125b水平可對心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，DS胎兒母體孕早期血清miR-125b相對表達(dá)量下降，對于診斷DS具有一定的輔助作用。因此，孕早期母體血清miR-125b表達(dá)下調(diào)可能是DS胎兒母體孕期的重要病理機(jī)制之一，可能參與了孕期DS胎兒的器官損害過程，其確切機(jī)制尚需要相關(guān)研究予以進(jìn)一步討論。

近年來關(guān)于miR-124與DS的研究并不多見，但Choi等[27]研究提示，miR-124在海馬神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，DS患者腦部關(guān)鍵區(qū)域中的miR-124表達(dá)異常可能促進(jìn)了其認(rèn)知缺陷的發(fā)生；其他研究[28-30]還報(bào)道了miR-124的過表達(dá)可提升胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖與侵襲能力、抑制干細(xì)胞成骨分化能力、影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化。因此，孕早期母體血清miR-124的過表達(dá)可能提示著胎兒DS病變的神經(jīng)病理過程，從而反映DS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，DS胎兒母體孕早期血清miR-124相對表達(dá)量上升，血清miR-125b、miR-124水平診斷DS的特異度較高，可用于彌補(bǔ)血清學(xué)篩查和胎兒NT檢測在DS篩查診斷中的特異性不足問題，這為采用孕期母體血清miRNAs檢測方法篩查診斷DS提供了有益的臨床思路。

綜上，DS胎兒母體在孕早期可出現(xiàn)血清miR-125b表達(dá)下調(diào)和血清miR-124表達(dá)上調(diào)，這兩種標(biāo)志物在篩查診斷DS中具有較高的特異度，臨床醫(yī)師可考慮將其與傳統(tǒng)篩查方案進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，以提高孕早期DS篩查的準(zhǔn)確性。