丙泊酚介導(dǎo)細(xì)胞自噬及Nrf2信號通路對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

程少飛，陳娟，程晶晶

(邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056008)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)指心肌組織缺血后再次獲得血液灌注時伴隨的心肌損傷，臨床可表現(xiàn)為心律嚴(yán)重失常、心室功能降低、心肌梗死面積擴(kuò)大[1]。隨著我國老齡化加重，冠心病、急性心肌梗死等缺血性心臟病的發(fā)生率呈逐漸增長趨勢。溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)及冠狀動脈旁路移植術(shù)治療可以幫助缺血性心臟病患者恢復(fù)心肌血液供給，但同時也會引起MI/RI損傷[2]。MI/RI損傷嚴(yán)重程度與缺血時間、側(cè)支循環(huán)情況以及再灌注條件存在密切關(guān)系，且常伴有心肌細(xì)胞凋亡和自噬過度。丙泊酚屬于鎮(zhèn)靜藥物，具有起效快、反應(yīng)迅速和不良反應(yīng)較少的特點(diǎn)，有良好的鎮(zhèn)靜、抗氧化功效，并且還能改善MI/RI損傷和腦缺血再灌注損傷[3-5]。細(xì)胞自噬屬于機(jī)體自我代謝更替的防御過程，同時也參與多種疾病發(fā)生或進(jìn)展。近年研究[6]表明，全身麻醉藥物對心肌組織的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear transcription factor E2-related factor 2，Nrf2)信號通路在氧化應(yīng)激調(diào)解中具有重要作用[7]，但有關(guān)丙泊酚與Nrf2信號通路關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究通過建立MI/RI損傷大鼠模型，旨在探討丙泊酚對MI/RI損傷的保護(hù)作用是否與細(xì)胞自噬、Nrf2信號通路有關(guān)，以期能為臨床緩解MI/RI損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g[廣州中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號：SCXK(粵)2019-0047]，于SPF級飼養(yǎng)環(huán)境培育：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，晝/夜時間均為12 h，全天自由飲水、進(jìn)食，購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)均通過動物倫理委員會批準(zhǔn)，遵守3R原則。

丙泊酚(2078-54-8，TargetMol)，CK-Mb試劑盒(QY-BM11392，上海喬羽生物科技有限公司)，Mb試劑盒(0-027530，上海江萊生物科技有限公司)，cTnI試劑盒(BS-E12272R1，廣州徠智生物科技有限公司)，乳酸脫氫酶(Lactate dehydro-genase，LDH)活力檢測試劑盒(XFE1020，上海信帆生物科技有限公司)，超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(K-F4377，上?？祈樕锟萍加邢薰?，丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)試劑盒(QC11820-B，上海欽誠生物科技有限公司)，ECL試劑盒(WB2014，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，DMSO(D2652-100ML，Sigma)，LC3-II/LC3-I抗體(ABC929，廣州東銳科技有限公司)，Beclin1、Nrf2抗體(ATA25356、ATA34138，武漢益普生物科技有限公司)，P62抗體(SPC-219D-A390-E，艾美捷科技有限公司)，HO-1抗體(bs-0827R-1，上海恒斐生物科技有限公司)，SD-001/SN-002 MinuteTM總蛋白提取試劑盒(SD-001/SN-002，英文特生物技術(shù)(北京)有限公司)。Avanti J-15R冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)，Primo Star iLED正置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)，R407小動物呼吸機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，RM2255全自動輪盤式切片機(jī)(LEICA)，SuPerMax 3000AL多功能酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備 60只SD大鼠禁食12 h后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丙泊酚組，每組各20只。模型組和丙泊酚組采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制備大鼠MI/RI模型[8]，缺血心肌表現(xiàn)出發(fā)紺、膨出跡象，有兩個以上ST段抬高，T波高聳、或者QRS波增高增寬與T融合，表明心肌缺血形成。結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，心電圖ST段恢復(fù)或與缺血前水平相似，表明大鼠缺血再灌注模型建立成功。剔除結(jié)扎前心電圖異?；蛑颇＿^程中死亡大鼠， 其余MI/RI模型制備大鼠均制模成功。見圖1。

1.2.2 缺血再灌注 丙泊酚組心肌缺血前15 min給予靜脈輸注丙泊酚6 mg·kg-1·h-1至再灌注2 h，模型組及假手術(shù)組靜脈輸注生理鹽水3 mL·kg-1·h-1，再灌注2 h。

1.2.3 指標(biāo)檢測 (1)心功能指標(biāo)檢測：再灌注2 h后，采用超聲心動圖檢查各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、左心室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)水平。(2)心功能損傷標(biāo)志物檢測：心功能心電圖監(jiān)測結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只大鼠，取股動脈血5 mL，3 000 rpm離心15 min，取上清液儲存于-80 ℃，采用ELISA法檢測CK-Mb、Mb、cTnI水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。重復(fù)3次。(3)心肌組織HE染色：每組隨機(jī)選取5只大鼠，取心臟組織固定于10%甲醛中性溶液，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)、脫蠟、水化、蘇木精和伊紅染色、脫水、透明、中性樹膠封片后在高倍鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化。(4)心肌組織氧化應(yīng)激因子檢測：取0.4 g心肌組織，加入4 ℃ 1 mL 0.9% NaCl溶液研磨制成組織勻漿，2 000 rpm離心10 min，取上清液存儲于-80 ℃，采用ELISA法檢測LDH、SOD、MDA水平，操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。重復(fù)3次。(5)Western blot檢測：提取心肌組織總蛋白、Bradford調(diào)整蛋白濃度至一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封2 h，加入P62、Nrf2、HO-1、LC3-II/LC3-I、Beclin1、β-actin一抗(1∶500)，然后4 ℃孵育過夜， TBST漂洗40 min，加入經(jīng)HRP標(biāo)記過的二抗(1∶500)繼續(xù)孵育1 h，參照ECL試劑盒說明書進(jìn)行顯影、定影，收集影像。重復(fù)3次。用UVPBio-Imaging Systems掃描蛋白質(zhì)條帶，并用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟功能指標(biāo)水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP水平降低(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組HR、LVSP、LVEF、FS、LVWT水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心臟功能指標(biāo)水平比較

2.2 各組大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組CK-Mb、Mb、cTnI水平升高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組CK-Mb、Mb、cTnI水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比較

2.3 各組大鼠心肌組織HE染色

假手術(shù)組大鼠的心肌組織細(xì)胞排列規(guī)則、均勻、緊密，且心肌纖維未見明顯變性、壞死；模型組大鼠的心肌組織細(xì)胞呈散亂分布，丙泊酚組大鼠的心肌組織損傷情況較模型組明顯改善。見圖2。

2.4 各組大鼠心肌組織MDA、SOD、LDH含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織MDA、SOD、LDH含量比較

2.5 各組大鼠心肌組織自噬、Nrf2信號通路相關(guān)蛋白水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組P62、Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05)，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組P62、Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05)，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白水平降低(P<0.05)。見圖3。

3 討論

介入治療術(shù)法是快速恢復(fù)缺血性心臟血供的重要方式之一，我國采取經(jīng)皮冠狀動脈介入治療已超過40萬人[9]，該治療方式雖然可以減低復(fù)缺血性心臟病患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，但治療時也伴有MI/RI損傷，嚴(yán)重時還可產(chǎn)生不可逆損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，MI/RI損傷大鼠的HR、LVSP、LVEF、FS及LVWT水平降低，血清CK-Mb、Mb、cTnI水平升高；心肌病理結(jié)果顯示，心肌組織細(xì)胞呈散亂分布，而在MI/RI制備期間給予丙泊酚處理可以明顯緩解上述MI/RI損傷情況。MI/RI損傷可使氧自由基增多、鈣離子含量升高，線粒體能代謝出現(xiàn)障礙，增加心肌損傷的嚴(yán)重程度[11-12]。CK-Mb、Mb、cTnI是檢測心肌損傷的標(biāo)志物，肌鈣蛋白是分布于心肌細(xì)胞內(nèi)纖維上的一種調(diào)節(jié)蛋白，cTnI是肌鈣蛋白的三大亞單位之一，大部分以結(jié)合形式分布于肌原纖維上，少量以游離的形式存在于細(xì)胞胞漿，當(dāng)心肌細(xì)胞膜受損時，cTnI可通過心肌細(xì)胞膜進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)[13]。已有研究[14-15]表明，丙泊酚對老年犬MI/RI損傷時的心肌具有保護(hù)作用以及心肌再灌注損傷，與本研究結(jié)果相似，表明丙泊酚對大鼠MI/RI損傷具有改善作用。

MI/RI損傷不僅會引起心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變，還會引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，MI/RI損傷大鼠的心肌組織中的SOD活性降低，MDA水平、LDH活性升高，而丙泊酚干預(yù)可以降低MDA水平及LDH活性，提高SOD活性。正常生理狀態(tài)下的心肌細(xì)胞中含有少量的氧自由基可被自由基清除系統(tǒng)清除，不會對心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷。缺血缺氧時，機(jī)體自由基產(chǎn)生和清除系統(tǒng)動態(tài)平衡失調(diào)，自由基生成能力提高，自由基清除能力降低，恢復(fù)血供后可誘導(dǎo)自由基含量增多，提高氧化應(yīng)激反應(yīng)。MDA是具有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，LDH是能夠反應(yīng)細(xì)胞膜損傷程度的糖原溶解酶。SOD活性降低時，細(xì)胞膜中不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)容易被自由基破壞，促進(jìn)脂質(zhì)降解產(chǎn)生MDA，改變細(xì)胞通透性，誘導(dǎo)線粒體功能障礙[17]。本研究結(jié)果說明丙泊酚對MI/RI損傷大鼠心肌損傷的改善作用，可能與降低心肌組織的過度氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，MI/RI損傷大鼠的心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白水平降低，而丙泊酚干預(yù)可以在一定程度上提高Nrf2、HO-1蛋白水平。Nrf2信號通路在機(jī)體抵抗外界氧化、化學(xué)等刺激的防御中具有重要作用，在機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中占據(jù)重要地位，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激調(diào)控的核心樞紐。當(dāng)機(jī)體收到外界有害刺激時，可刺激Nrf2活化并進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合并啟動ARE下游抗氧化蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。HO-1是Nrf2信號通路中的關(guān)鍵靶蛋白，在抗氧化應(yīng)激過程中具有正向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果說明丙泊酚降低MI/RI損傷大鼠心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與調(diào)節(jié)Nrf2信號通路活化有關(guān)。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，MI/RI損傷大鼠心肌組織中P62蛋白水平降低，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白升高，而丙泊酚干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢，P62是與蛋白質(zhì)泛素化密切相關(guān)的一種泛素結(jié)合蛋白，可參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬過程[18]。自噬可以促進(jìn)LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3-II，LC3-II水平與自噬體數(shù)量呈正比。Beclin1是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白之一，可通過與相關(guān)蛋白結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。已有研究[19-20]表明，丙泊酚可以減輕因氧糖剝奪產(chǎn)生過度自噬的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和肝臟缺血再灌注損傷，與本研究結(jié)果一致，說明丙泊酚對MI/RI大鼠心功能保護(hù)作用可能與降低心肌組織過度自噬有關(guān)。

綜上所述，丙泊酚可以改善大鼠MI/RI損傷和心肌組織過度自噬，還能降低心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與調(diào)節(jié)Nrf2信號通路有關(guān)，其具體作用機(jī)制還需要深入研究。