細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2在腎癌中的表達(dá)及臨床意義

李峰，趙濤，邵繼春

(核工業(yè)四一六醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610051)

腎癌屬于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)每年新增腎癌患者約27萬例腎癌，死亡人數(shù)接近11.6萬，目前發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，可能與生活環(huán)境、飲食習(xí)慣的改變及診斷技術(shù)的改進(jìn)有關(guān)[1]。臨床研究證實(shí)，腎癌患者對(duì)放療、化療不敏感，手術(shù)是治療早期腎癌的首選方式[2]，但仍有很大一部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后較差。隨著研究的不斷深入，多種基因的異常表達(dá)已被證實(shí)參與惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成員，是通過上游MAPK 1/2磷酸化而激活的蛋白激酶/蘇氨酸激酶，該信號(hào)通路是由各種細(xì)胞外刺激和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)的，并最終作用于多種生理和病理途徑[3]。近期，Hoerner等[4]指出，磷酸化的ERK1/2(p- ERK1/2)的作為一種關(guān)鍵的癌癥信號(hào)蛋白，與腎癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)；Lee等[5]也證實(shí)ERK1/2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)。本研究通過檢測(cè)78例腎癌患者癌組織及癌旁組織中ERK1/2及p-ERK1/2的表達(dá)情況，結(jié)合患者臨床資料分析其臨床意義，探討其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為探尋腎癌致病分子機(jī)制及治療方向積累數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2019年1月于核工業(yè)四一六醫(yī)院行手術(shù)切除的78例腎癌患者為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)腎癌臨床治療指南：2015版》中腎癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]經(jīng)術(shù)后病理切片確認(rèn)；(2)首次行手術(shù)切除治療；(3)術(shù)前均未接受放療、化療；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者。78例腎癌患者中，男性50例，女性28例；年齡42～80歲，平均(61.35±18.28)歲；臨床分期Ⅰ-Ⅱ 期患者46例，Ⅲ-Ⅳ 期患者32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者20例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者16例；病理Fuhrman 分級(jí)為G1者33例，G2+G3者45例。78例腎癌患者經(jīng)門診或電話隨訪12～60個(gè)月，隨訪截止日期為2020年1月31日。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人ERK1/2單克隆抗體、小鼠抗人p-ERK1/2單克隆抗體(貨號(hào)：AM2189b)購自美國(guó)ABGENT公司，兔抗小鼠二抗(貨號(hào)：PAB9358)購自上海群己生物科技有限公司，DAB 顯色試劑盒(貨號(hào)：AR1022)購自武漢博士德生物工程有限公司。ERK1/2及p-ERK1/2陽性對(duì)照為已知染色陽性的腎癌組織切片，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.2 免疫組化法(三步法)測(cè)定ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá) 將手術(shù)切除的腎癌及距離病灶超過3 cm的癌旁組織，采用10%的甲醛溶液固定，制成石蠟標(biāo)本，將標(biāo)本制備成厚度為4 μm的組織切片；采用二甲苯進(jìn)行脫蠟，15 min×3 次；采用濃度為90%、85%、75%、70%的乙醇依次浸片，每次5 min；為避免內(nèi)源性過氧化物酶造成影響，采用3%的H2O2/甲醇溶液浸泡10 min；采用0.125%的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)胰蛋白酶抗修復(fù)液進(jìn)行30 min的修復(fù)；采用胎牛血清封閉30 min，加入一抗小鼠抗人ERK1/2/ p-ERK1/2單克隆抗體(1∶150)于4 ℃條件下孵育過夜；于次日加入標(biāo)記生物素的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫條件下孵育30 min，加入二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)顯色液，采用自來水充分沖洗后，采用蘇木素染色、脫水、透明、中性樹膠封固。

1.2.3 結(jié)果判定 采用雙盲閱片法，由病理科醫(yī)師于光鏡下對(duì)陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行觀察，ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達(dá)均為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，參照Beeskey分級(jí)方法，每個(gè)視野選取100個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)≥10% 為陽性，以無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎癌組織與癌旁組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)情況比較

腎癌組織中，ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 腎癌組織與癌旁組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)情況比較[n(%)]

2.2 不同病理特征腎癌患者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)情況比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑患者癌組織ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；臨床分期為Ⅲ-Ⅳ 期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理Fuhrman 分級(jí)為G2+G3者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達(dá)率分別高于臨床分期Ⅰ-Ⅱ 期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理Fuhrman 分級(jí)為G1者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同分期腎癌患者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)情況比較[n(%)]

2.3 癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)情況與腎癌患者生存情況的相關(guān)分析

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，相較于ERK1/2、p-ERK1/2陰性表達(dá)者，腎癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2陽性表達(dá)的患者生存情況較差(χ2=20.207，P<0.001；χ2=17.132，P<0.001)。見圖2。

3 討論

腎臟惡性腫瘤占惡性腫瘤的2%[7]，是世界上第13位最常見的惡性腫瘤，腎癌的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家較高，歐洲和北美的發(fā)病率普遍高于印度、非洲和中國(guó)[8]。腎癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素，隨著表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入， MAPK/ERK信號(hào)通路在一定程度上決定了細(xì)胞分裂、分化及凋亡，與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，ERK1/2是該通路上較多的蛋白激酶，也是MAPK/ERK信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，正常情況下，位于胞漿內(nèi)的ERK1/2 處于靜止?fàn)顟B(tài)，磷酸化后的ERK1/2被激活后成為p-ERK1/2，可快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終改變細(xì)胞代謝與功能，參與形成惡性腫瘤細(xì)胞特定的惡性生物學(xué)過程[9-10]。本研究中，78例患者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達(dá)率均高于癌旁組織(P<0.05)，提示其與腎癌的發(fā)生密切相關(guān)。劉玉等[11]發(fā)現(xiàn)ERK1/2在食管鱗癌石蠟標(biāo)本癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織；Sinha等[12]發(fā)現(xiàn)人透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞內(nèi)ERK1/2激活，兩者均與本文研究結(jié)論基本一致。

通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理Fuhrman 分級(jí)為G2+G3者的癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達(dá)率更高。仝偉兵等[13]發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2陽性表達(dá)與患者臨床分期、腫瘤分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)；王艷軍等[14]表明，ERk1/2蛋白表達(dá)水平增加可能參與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌進(jìn)展；程楊等[15]證實(shí)ERK1/2激活后，宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。本研究中Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，腎癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2陽性表達(dá)的患者生存情況較差。Zhao等[16]指出，p-ERK1/2的表達(dá)被抑制后，腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲活性隨之受到抑制；Gao等[17]指出，p-ERK1/2高表達(dá)的肝癌患者的總生存期及無復(fù)發(fā)生存期均較差；Zhao等[18]發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后相關(guān)；Fan等[19]指出，在首次確診的多發(fā)性骨髓瘤患者中，p-ERK1/2的高表達(dá)與總生存期及無復(fù)發(fā)生存期縮短顯著相關(guān)；Lee等[5]發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2的高表達(dá)與無進(jìn)展生存期縮短相關(guān)，不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)較高，以上均與本研究結(jié)論一致。但是，本研究樣本量較少，研究結(jié)論仍需大樣本多中心試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，ERK1/2能否作為腎癌的治療靶點(diǎn)，仍需進(jìn)一步分析。

綜上所述，腎癌組織中存在ERK1/2及p-ERK1/2的高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理Fuhrman 分級(jí)及生存期相關(guān)。