BMP-7聯(lián)合TGF-β3在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化中的作用

左后東

(醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，四川 南充 637000)

軟骨損傷是一種多病因、多機制導(dǎo)致的慢性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)疼痛、變形及功能障礙為主要表現(xiàn)，治療不及時或治療效果不理想，最終會發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究[1]表明，關(guān)節(jié)軟骨損傷是關(guān)節(jié)退變及骨性關(guān)節(jié)炎的始動環(huán)節(jié)。多種因素可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，如年齡、肥胖、生活環(huán)境、不合理或過量運動等。值得注意的是，由于缺乏血管和神經(jīng)，關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷則很難自行修復(fù)。目前軟骨損傷治療方法包括關(guān)節(jié)置換、軟骨移植等[2]，但這些治療方法遠期效果不甚理想，甚至?xí)又鼗颊叩耐纯唷Ｒ虼藢崿F(xiàn)安全、可持續(xù)軟骨修復(fù)的同時又能保持良好軟骨功能特性就顯得意義重大，這也是目前臨床和患者的迫切需求。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向多種細胞分化的潛能，其中包括軟骨細胞轉(zhuǎn)化[3]。研究[4-5]表明，骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)在軟骨發(fā)生、成熟、再生、結(jié)構(gòu)完整性、軟骨內(nèi)平衡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究擬通過BMP和TGF-β家族成員中的BMP-7和TGF-β3聯(lián)合作用，探索其在體外誘導(dǎo)干細胞分化為軟骨細胞和組織的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

比格犬干細胞(Cat.No.CAXMX-01001，蘇州賽業(yè)生物科技公司)，完全培養(yǎng)基(Cat.No.CAXMX-90011，蘇州賽業(yè)生物科技公司)，BMP-7(Cat.No.HEOPP-02102，蘇州賽業(yè)生物)，TGF-β3(ab217402，abcam，UK)，兔抗II型膠原蛋白抗體(15943-1-AP，Proteintech)，CL594標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(SA00006-4，Proteintech)和比格犬軟骨細胞(Cat No：DOG-iCell-s003，上海賽柏康)。

1.2 方法

1.2.1 干細胞的分化培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2和飽和濕度的條件下用購買比格犬干細胞提供的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)比格犬干細胞。每2～3 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細胞融合度達到80%左右進行傳代。收集第四代干細胞，計數(shù)干細胞(約4×104個)并移到15 mL離心管。250 g(1 200 rpm)離心4 min，之后棄上清液，用0.5 mL完全培養(yǎng)基清洗沉淀細胞團2次。提前準(zhǔn)備分化培養(yǎng)基，在完全培養(yǎng)基中按照比例分別加入10 ng/mL∶10 ng/mL、25 ng/mL∶25 ng/mL、50 ng/mL∶50 ng/mL、100 ng/mL∶100 ng/mL的BMP-7和TGF-β3制成低、中、高濃度的分化培養(yǎng)基，分別記為低濃度組、中低濃度組、中濃度組和高濃度組；未加入BMP-7和TGF-β3的培養(yǎng)基作為對照組。用0.5 mL新配置的分化培養(yǎng)基懸浮起沉淀細胞團，隨后150 g(800 rpm)離心5 min，松開一圈離心管蓋，放入37 ℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，輕輕彈動離心管底部，使細胞團重懸到培養(yǎng)基中，每2～3 d更換分化培養(yǎng)基。分別于7、14、21、28、35、42 d觀察細胞團分化及成團情況。隨后拍照、4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片后檢測。

1.2.2 HE染色 將組織切片置于63 ℃烤箱中烤片2 h，二甲苯脫蠟10 min×2次，梯度酒精(100%、95%、80%、70%)依次浸泡2 min，蒸餾水洗1 min，蘇木精染色1 min，自來水洗1 min，1%鹽酸酒精分化10 s，自來水洗1 min，1%氨水返藍30 s，自來水洗1 min，伊紅染色50 s，自來水洗1 min，梯度酒精(70%、80%、95%、100%)依次浸泡1 min，吹干，中性樹膠封片。

1.2.3 阿利辛藍色染色 誘導(dǎo)后的細胞切片經(jīng)二甲苯脫蠟10 min×2次后，再經(jīng)梯度酒精(100%、95%、80%、70%)依次浸泡2 min，蒸餾水洗1 min，吸去蒸餾水，滴加阿利辛藍染液室溫染色30 min。之后用蒸餾水清洗3次，鏡下觀察，內(nèi)酸性粘多糖會被染成藍色。

1.2.4 免疫熒光反應(yīng) 誘導(dǎo)后的細胞切片脫水和脫蠟后，用PBS清洗3次，每次5 min。隨后用10%FBS，0.25%Trition X-100 的PBS封閉2 h，棄封閉液后用1/100一抗(兔抗II型膠原蛋白抗體)孵育，4 ℃，過夜。棄一抗并用PBS清洗5 min。再加入1/500二抗 (CL594標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)，室溫避光孵育2 h。采用購買比格犬軟骨細胞提供的培養(yǎng)基和方法培養(yǎng)比格犬軟骨細胞，在24孔板底部放置蓋玻片，每孔種植2×104個細胞，隨后在37 ℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，制作成細胞爬片。細胞爬片按上述方法進行免疫熒光染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞生長及聚集情況

顯微鏡下所有干細胞生長情況良好，形態(tài)正常(圖1)。對照組及不同濃度分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細胞在第7天均未見細胞明顯變化，在第14天，中濃度和高濃度組干細胞聚集成團，而對照組、低濃度組和中低濃度組干細胞分散在培養(yǎng)基中，未見聚集成團，在第21、28、35、42天，中濃度和高濃度組聚集成團的結(jié)構(gòu)大小未見明顯變化，呈乳白色膠狀，結(jié)構(gòu)更為緊密，且富有彈性，三組重復(fù)實驗的結(jié)果顯示高濃度組聚集成團結(jié)構(gòu)的平均直徑為(1.2±0.1)mm，大于中濃度組的(0.6±0.2)mm，而對照組、低濃度組和中低濃度組干細胞仍呈分散狀態(tài)，未見成團(圖2)。

2.2 HE染色結(jié)果

比較3種細胞的HE染色結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細胞的細胞尺寸更小，并且細胞的間隙變得更加緊密，說明細胞朝著形成致密組織的方向發(fā)生分化。而干細胞和軟骨細胞，表現(xiàn)出離體培養(yǎng)細胞的特征，即單個細胞呈長條狀，細胞之間聯(lián)系松散。見圖3。

2.3 阿利辛藍染色結(jié)果

阿利辛藍染色證明了誘導(dǎo)細胞的團狀結(jié)構(gòu)表達豐富的酸性粘多糖(圖4)。阿利辛藍染料能將細胞表達的酸性粘多糖染成藍色。酸性粘多糖一般黏附在細胞膜上或者分泌于細胞間質(zhì)，參與組織內(nèi)微環(huán)境的構(gòu)建。干細胞通常不表達酸性粘多糖，而軟骨細胞的表達量較高。干細胞結(jié)果為陰性，軟骨細胞和誘導(dǎo)細胞為陽性，且誘導(dǎo)細胞的藍色更深一些?？赡苁且驗檐浌羌毎置诘郊毎g隙的酸性粘多糖，在染色的過程中可能會被清洗掉。

2.4 免疫熒光染色反應(yīng)

免疫熒光反應(yīng)證實聚集成團的誘導(dǎo)細胞表達豐富II型膠原蛋白(圖5)。II型膠原蛋白的免疫熒光，干細胞亮度很弱，說明II型膠原蛋白表達很低；誘導(dǎo)細胞很亮，說明表達很高；軟骨細胞熒光亮度居中。推測干細胞誘導(dǎo)分化成的組織具有軟骨細胞表達II型膠原蛋白的特征。imageJ軟件對各組細胞的CL594通道進行定量結(jié)果顯示，誘導(dǎo)細胞的值為(23.211±0.816)，干細胞的值為(1.126±0.03)，軟骨細胞的值為(9.669±0.278)，各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

軟骨主要是由軟骨細胞和大量細胞外基質(zhì)構(gòu)成，其中細胞外基質(zhì)包括水和富含蛋白聚糖和膠原纖維，其中以Ⅱ型膠原蛋白纖維為主。軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白纖維交聯(lián)排列成網(wǎng)，粘多糖和水鑲嵌其中，構(gòu)成了軟骨的基本骨架。軟骨損傷在日常生活中較為常見，多種原因可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，如年齡、肥胖及不合理運動等。關(guān)節(jié)軟骨損傷進一步會導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變和關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[1]。而軟骨自身由于缺乏神經(jīng)和血管，一旦損傷很難自行修復(fù)。

近年來，新興的軟骨組織工程研究為軟骨的修復(fù)和再生帶來了希望。許多研究[6-8]表明，骨髓間充質(zhì)干細胞具有多分化潛能，可以向軟骨細胞分化并可形成軟骨組織；并且干細胞在某些因素作用和誘導(dǎo)下能有效的促進軟骨的再生和修復(fù)，如來自軟骨基質(zhì)的水凝膠[9]，卡托原蛋白(Kartogenin)和TGF-β3[10]等。研究表明，TGF-β信號通路可能在干細胞分化[11-12]及軟骨發(fā)生、形成、結(jié)構(gòu)完整性、軟骨內(nèi)平衡及軟骨修復(fù)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]，這些都為軟骨修復(fù)提供了極大理論和技術(shù)支持。TGF-β信號通路是高分化、多功能性和高效性的信號網(wǎng)絡(luò)。TGF-β超大家族包括 TGF-βs、骨形態(tài)生成蛋白( BMPs)、生長分化因子(GDFs)、Nodal、活化素(Activin)和抑制素 (Inhibin)等成員，大致可分為TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS兩個亞家族。目前研究表明，后者信號通路在軟骨發(fā)生、生成及骨形成方面發(fā)揮重要作用[4，11，14]，而關(guān)于前者通路，目前研究較多的是TGF-βs因子的作用。TGF-βs 因子單獨或者與其他配體或多聚體共同作用后，能誘導(dǎo)和促進干細胞向軟骨細胞轉(zhuǎn)化，促進軟骨細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞基質(zhì)的合成及維持軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對軟骨損傷修復(fù)起到正調(diào)節(jié)作用[15-16]。在TGF-β亞家族中，BMP/GDF/MIS信號通路參與誘導(dǎo)軟骨與骨的發(fā)育形成，其中骨形態(tài)生成蛋白可以增加正常和損傷軟骨細胞基質(zhì)的代謝，而細胞基質(zhì)代謝的增強會替代受損軟骨細胞基質(zhì)分子，從而使得BMP能夠在增強受損軟骨內(nèi)在修復(fù)能力方面發(fā)揮重要作用[14]。BMP還能夠促進間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化及軟骨細胞的成熟和再生[17]。這種促進作用的關(guān)鍵在于其能夠促進蛋白多糖及Ⅱ型膠原的合成[18-19]，而這正是軟骨最主要的組成成分和軟骨的基本骨架。

干細胞在經(jīng)過含TGF-β3的培養(yǎng)基培養(yǎng)后能展現(xiàn)出具有更好性能的基質(zhì)產(chǎn)物和優(yōu)于正常軟骨細胞的的修復(fù)能力，這可能與Ⅱ型膠原沉積明顯增多有關(guān)[20-21]。TGF-β3的量和培養(yǎng)時間也決定了修復(fù)軟骨的優(yōu)良軟骨功能及生物學(xué)特性，濃度越高培養(yǎng)時間越長，則得到的軟骨性能更優(yōu)[16]。重要的是通過TGF-β3作用再生出的軟骨內(nèi)聚糖含量與正常軟骨相當(dāng)，這也預(yù)示著TGF-β3可能通過調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)軟骨內(nèi)聚糖 生成參與軟骨修復(fù)，同時Huang等[22]的研究也支持這一觀點，他們發(fā)現(xiàn)TGF-β3能極大的促進軟骨形成。此外，Chung等[23]發(fā)現(xiàn)，TGF-β3能進一步增強II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖基因的上調(diào)和表達，使得誘導(dǎo)的軟骨具有更優(yōu)越的生物學(xué)性能。而在后者的通路中，研究比較多的是BMP蛋白，其中包括BMP-2、BMP-3、BMP-7 等。研究[24-25]表明，BMP-7參與并促進軟骨的修復(fù)。Kuo等[25]采用微骨折法與 BMP-7 向聯(lián)合干預(yù)方式得到了基質(zhì)更豐富、細胞分布更好的修復(fù)軟骨組織。此種修復(fù)組織具有正常比例活力細胞、軟骨下骨及軟骨礦化層，同時該組織的表面特性又得到了極大的優(yōu)化，因為微骨折能大大增加修復(fù)組織的量，而BMP-7又能極大提高修復(fù)軟骨組織的質(zhì)，這也正是BMP-7 和微骨折法相互協(xié)同作用的結(jié)果，說明BMP-7在軟骨修復(fù)中具有很大的潛能。同時Kim等[26]還發(fā)現(xiàn)，BMP-7還能與軟化的骨基質(zhì)結(jié)合可刺激犬臨界大小的骨缺損中新的骨骼和血管形成，因為BMP-7不僅促進成骨還能促進產(chǎn)生血管營養(yǎng)因子。因此，干細胞能在BMP-7和TGF-β3作用下分化為軟骨組織，并可作為TGF-β信號通路中調(diào)節(jié)干細胞 轉(zhuǎn)化及軟骨細胞生成、軟骨修復(fù)的潛在靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)BMP-7和TGF-β3能成功誘導(dǎo)干細胞向軟骨細胞分化并形成軟骨組織，并通過HE染色、阿利辛藍染色和免疫熒光證實了由骨髓干細胞分化形成的軟骨樣結(jié)構(gòu)內(nèi)具有豐富的聚糖和II型膠原蛋白，這與Rackwitz 等[15]研究結(jié)果相一致。同時說明BMP和TGF-βs聯(lián)合作用可以更有效地誘導(dǎo)軟骨形成，因此BMP和TGF-βs組合可能是體外誘導(dǎo)軟骨形成的重要關(guān)鍵，與Indrawattana等[27]研究結(jié)果相一致。

本研究還存在一些不足：(1) BMP-7和TGF-β3的濃度最大為100 ng/mL，未設(shè)置更高的標(biāo)準(zhǔn)；(2)由于誘導(dǎo)分化出的軟骨組織太小，未提取出足夠的RNA，因此沒有qRT-PCR進一步驗證；(3)缺少體內(nèi)實驗驗證。針對上述不足，課題組將在后續(xù)的研究中繼續(xù)完善。

總之，BMP-7和TGF-β3聯(lián)合作用能有效的誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞并形成軟骨組織，且濃度BMP-7和TGF-β3越高，產(chǎn)生的誘導(dǎo)效果和軟骨組織越好。