鴉膽子苦醇對三陰性乳腺癌細胞凋亡的影響

劉 丹，胥 旸，邢曉靜

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽110167；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院血液乳腺內(nèi)科，遼寧 沈陽110042)

乳腺癌是發(fā)病率較高的一種惡性疾病，對健康有著極大的危害[1]。三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是指檢查結(jié)果中孕激素受體(Progesterone receptor，PR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ER)以及人類表皮生長因子受體-2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)表達均為陰性的一種特殊類型的乳腺癌[2]。三陰性乳腺癌患者在治療過程當中缺少靶點，內(nèi)分泌及靶向治療導(dǎo)致患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率及死亡率很高促使人們探索有效的抗腫瘤藥物[3]。近年來，中草藥的抗腫瘤、抗癌癥作用，越來越受人們的關(guān)注，鴉膽子苦醇(Brusatol，BRU)是中草藥苦木科植物鴉膽子分離出的苦木內(nèi)酯類成分之一喹諾酮[4]，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒及抗寄生蟲等多種藥理活性[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子可抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且能促進其凋亡，對乳腺癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]、胰腺癌[10]和結(jié)直腸癌[11]等多種癌細胞具有增殖抑制作用，本研究目的主要探討鴉膽子苦醇對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖抑制進而誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑：三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株由遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供，鴉膽子苦醇(BRU)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號：F0818AS CAS:14907-98-3)，DMEM培養(yǎng)液購于HYCLONE有限公司，胎牛血清(FBS)購于CLARK公司 ，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma有限公司，胰蛋白酶購自GIBCO有限公司，PBS購于GENVEW有限公司，CCK-8試劑盒購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司，Annexin V-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自北京義翹神州科技有限公司，細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物有限公司。

1.1.2 儀 器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司 德國)，超凈工作臺(安泰空氣技術(shù)有限公司)，熒光顯微鏡(Leica公司)，全波長酶標儀(Bio-RAD公司)，高速離心機(Eppendorf公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶解藥物：BRU用二甲基亞砜(DMSO)避光溶解，配制初始濃度為5 mmol/L，分裝以待后用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及傳代：三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于配制的含12% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下每天觀察細胞生長情況，根據(jù)情況2～3 d換液1次，當細胞生長到對數(shù)生長時即可進行傳代培養(yǎng)，棄去舊培養(yǎng)液，加入PBS約1～2 ml清洗細胞再棄去PBS，加入1～2 ml胰蛋白酶(含EDTA)，在細胞培養(yǎng)箱中消化3 min左右，至細胞變圓脫離底部，立即取出培養(yǎng)皿，向其中直接加入6 ml左右新培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打皿底使之形成單個細胞分散的細胞懸液，收集細胞懸液到離心管中，800 r/min離心5 min后棄去上清，在離心管沉淀中加入新培養(yǎng)液10 ml左右反復(fù)吹打，直到細胞沉淀完全形成單個細胞分散的細胞懸液，將懸液一傳四的移入培養(yǎng)皿內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，然后繼續(xù)孵育，放于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.3 用CCK-8法檢測鴉膽子苦醇對細胞增殖抑制的影響：三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞以對數(shù)生長，密度調(diào)整為1×105個/ml，制備細胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100 μl，置于37 ℃飽和溫度，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，待細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液，實驗組中分別加入10 μl不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)的含藥培養(yǎng)液，空白對照組加入10 μl DMSO，每個濃度梯度設(shè)5個復(fù)孔，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用全波長酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD值)，按照公式：抑制百分率=[(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%，根據(jù)5個復(fù)孔的平均OD值來計算各藥物濃度組細胞的抑制百分比，實驗重復(fù)3次取平均值，計算IC50。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：取處于對數(shù)生長的MDA-MB-231細胞，調(diào)整密度為3×105個/ml的細胞懸液，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，待細胞生長達到70%左右時，據(jù)細胞增殖抑制實驗得出的BRU的 IC50，實驗組分別加入濃度為5、10、20、40 μmol/L的含BRU的培養(yǎng)液，空白對照組加入新培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后消化收集細胞于離心管中，用4℃預(yù)冷的PBS清洗細胞2次，800 r/min 5 min離心后去上清，用1×Binding Buffer重懸細胞至細胞密度為0.1×107～1×107個/ml，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至一個流式管中，每管100 μl，在每管細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl 7-AAD，輕輕混勻，設(shè)置單染，雙染以及對照，在室溫(25 ℃)避光孵育15 min，加入400 μl 1×Binding Buffer終止反應(yīng)，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡率，F(xiàn)low jov10軟件分析，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期：取對數(shù)生長的MDA-MB-231細胞，調(diào)整為密度3×105個/ml的細胞懸液，接種于6孔的細胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，待細胞生長達到70%左右，實驗組分別加入濃度為5、10、20、40 μmol/L的含BRU的培養(yǎng)液，空白對照組加入新培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，胰酶(無EDTA)消化細胞收集于離心管中，1000 r/min 5min離心后去上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，2000 r/min 5 min離心后去上清，在細胞中加入提前準備好的體積分數(shù)為70%冷乙醇500 μl固定(2 h至過夜)，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液，1000 r/min 5 min離心后去上清，加入提前配制好的500 μl PI/RNase A染色工作液，室溫避光30～60 min，流式細胞儀去上機檢測，實驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 鴉膽子苦醇對MDA-MB-231細胞生長的抑制率 鴉膽子苦醇對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用顯著，且具有時間和劑量的依賴性，24、48和72 h的生長抑制率分別為:19.58%～60.73%、26.11%～81.35%和29.19%～84.48%。且IC50值分別為23.71、13.49、10.27 μmol/L，各組間鴉膽子苦醇對MDA-MB-231細胞的抑制率比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，鴉膽子苦醇對MDA-MB-231 細胞的生長抑制率隨藥物濃度的增加而增高，呈劑量-效應(yīng)正相關(guān)，并且隨著給藥時間的延長對細胞的抑制作用也相應(yīng)提高，呈時間-效應(yīng)正相關(guān)。見表1。

表1 鴉膽子苦醇對MDA-MB-231細胞生長的抑制率

2.2 鴉膽子苦醇對MDA-MB-231細胞凋亡的影響 鴉膽子苦醇作用MDA-MB-231細胞48 h后，結(jié)果顯示(圖1):鴉膽子苦醇對MDA-MB-231細胞有明顯的凋亡促進作用，隨著濃度的提高，細胞凋亡率也相應(yīng)增加，5、10、20、40 μmol/L的BRU處理MDA-MB-231細胞48 h后，藥物各濃度組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。表明鴉膽子苦醇可濃度依賴性的誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡。

圖1 不同濃度鴉膽子苦醇誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡

2.3 鴉膽子苦醇對MDA-MB-231細胞周期的影響 用濃度為5、10、20、40 μmol/L的鴉膽子苦醇作用MDA-MB-231細胞48h后，結(jié)果顯示，濃度越高，細胞G0/G1期的比例越高，S及G2/M期的比例則下降，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。說明BRU可阻滯MDA-MB-231細胞的增殖，使細胞生長阻滯于G0/G1期，并進而誘導(dǎo)細胞凋亡(圖2)。

圖2 不同濃度鴉膽子苦醇處理MDA-MB-231細胞后各周期比例

3 討 論

近年來，隨著乳腺癌的發(fā)病率越來越高，已成為多發(fā)病以及常見病,尤其三陰性乳腺癌是乳腺癌治療中最棘手的一種，死亡率最高、且最容易復(fù)發(fā)，中醫(yī)認為該病是多種因素交互錯雜而生成的疾病，中醫(yī)藥在乳腺癌的治療中的地位也日益提升，中藥的有效成分對乳腺癌的基礎(chǔ)性研究也越來越多[12]，鴉膽子為中草藥苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實，其性寒味苦，歸大腸和肝經(jīng)，是中國的傳統(tǒng)中藥，被收錄于《中國藥典》，鴉膽子具有清熱解毒、殺蟲、截瘧、止痢等眾多功效，可用于治療熱毒血痢、瘧疾、雞眼、疣等?，F(xiàn)代藥理活性研究表明，鴉膽子具有抗炎癥、抗瘧疾、抗病毒、抗腫瘤以及降血糖等多方面的作用，其中抗癌作用及機制現(xiàn)已有眾多研究[13]，鴉膽子含有多種的化學(xué)成分，其中含量相對較高的成分則為苦木內(nèi)酯類，并且具有較強的抗腫瘤，抗炎等多種生物活性[14]，鴉膽子苦醇則是苦木內(nèi)酯的主要代表性化合物[15]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可以快速而短暫的抑制結(jié)腸腫瘤細胞Nrf-2信號通路，降低胞內(nèi)Nadph的水平，抑制DNA的合成，可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[16]。王敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可下調(diào)Nrf-2，降低Notch1及下游蛋白的表達，從而抑制了A549、H460細胞的增殖，并促使細胞凋亡。崔玲娣等[18]研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可抑制Nrf-2表達，并誘導(dǎo)ERS，較低劑量的鴉膽子苦醇可顯著促進MCF-7細胞凋亡。本研究主要探究鴉膽子苦醇作用于三陰性乳腺癌細胞的作用，研究結(jié)果顯示鴉膽子苦醇對三陰性乳腺癌細胞體外也有明顯的生長抑制作用。其抑制作用隨給藥濃度的增加或作用時間的延長而增強，呈現(xiàn)明顯的濃度和時間的依賴關(guān)系。已知從一個細胞周期階段到下一個細胞周期階段，包括分裂間期以及分裂期，分裂期即是M期，分裂間期包括G0/G1/S/G2期，若某一期出現(xiàn)異常，則細胞的分化，增殖將出現(xiàn)問題[19]。研究發(fā)現(xiàn)細胞G1期是周期啟動的一個重要調(diào)控點，當細胞G1期出現(xiàn)異常則無法進入S期進行細胞周期[20]，實驗結(jié)果顯示，鴉膽子苦醇濃度越高，細胞G0/G1期的比例越高，S/G2/M期比例則減少，鴉膽子苦醇可以將三陰性乳腺癌細胞阻滯在G0/G1期，并且誘導(dǎo)其凋亡，細胞的凋亡率隨著藥物濃度的增加也顯著增高，三陰性乳腺癌細胞的凋亡研究成為臨床學(xué)者研究的一個熱點，細胞的凋亡主要有內(nèi)在途徑和外在途徑，與細胞生命活動有密切關(guān)系的線粒體，對細胞凋亡的調(diào)控也起到重要的作用，Bcl-2蛋白家族通過控制線粒體通透性來調(diào)節(jié)細胞凋亡，應(yīng)進一步探究細胞的凋亡及其凋亡機制，為臨床提供新的治療方法。綜上所述，鴉膽子苦醇對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞體外的生長有顯著抑制作用，不僅能阻滯MDA-MB-231細胞的增殖并且能誘導(dǎo)細胞的凋亡，其是潛在的臨床治療三陰性乳腺癌的藥物，后續(xù)將進一步研究鴉膽子苦醇促進三陰性乳腺癌細胞凋亡的具體機制。