甘草瀉心湯聯(lián)合血竭抗大鼠潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)的效果及對(duì)IL-6、TNF-α的影響 *

李 敏，劉 肖，徐小波，李天然

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肛腸科， 四川 南充637000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種難治性消化道疾病，以黏液膿血便、腹瀉、腹痛、里急后重及不同程度的腸外并發(fā)癥為主要臨床表現(xiàn)[1-2]，具有病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特點(diǎn)。UC的患病率逐年上升，每千人中有1～2人患病[3]，已成為全球性的疾病[4]。UC是導(dǎo)致相關(guān)性結(jié)直腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[5]。由于長(zhǎng)期慢性炎癥及潰瘍的刺激，UC患者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常人群的5倍[6]。UC的發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境及上皮屏障缺陷等因素有關(guān)[7]，細(xì)胞因子在UC的免疫反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)中起重要作用。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是參與UC炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，能促進(jìn)白細(xì)胞活化，使腸道黏膜炎癥反應(yīng)持續(xù)[8-9]。目前，UC難以被徹底治愈，維持治療和防止UC復(fù)發(fā)是醫(yī)生和患者面臨的問(wèn)題。氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑是治療UC的主要化學(xué)藥物，但長(zhǎng)期用藥不良反應(yīng)多，治療費(fèi)用高，部分患者療效不理想[10]。研究表明，甘草瀉心湯能明顯緩解UC患者臨床癥狀，降低患者血清炎癥細(xì)胞因子水平，促進(jìn)腸道屏障功能修復(fù)[11-12]。 中藥血竭灌胃能明顯減輕UC模型大鼠結(jié)腸黏膜的病理?yè)p害，降低大鼠血清炎癥因子TNF-α的表達(dá)[13]。本研究進(jìn)一步探討甘草瀉心湯聯(lián)合血竭對(duì)硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的UC模型大鼠的療效、抗復(fù)發(fā)作用，以及對(duì)血清IL-6和TNF-α的影響，為甘草瀉心湯聯(lián)合血竭防治UC的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

無(wú)特定病原體(specified pathoger free,SPF)級(jí)(Sprague-Dauley,SD)大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(川)2018-18，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(川)2018-076。

1.2 藥品、試劑與儀器

甘草瀉心湯組成：炙甘草12 g，黃連3 g，黃芩9 g，半夏9 g，干姜9 g，大棗6 g，人參9 g。藥材由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科提供，按原方比例將飲片以常規(guī)煎煮法煎液，濃縮為含生藥2.4 g/mL溶液備用。龍血竭膠囊，云南云河藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)150408，0.3g/粒。取膠囊內(nèi)粉末，用濃縮甲基纖維素鈉與甘草瀉心湯藥液配制成含血竭0.15 g/mL生藥的混懸液備用。柳氮磺吡啶片(salazosulfapyridine,SASP)，上海信誼天平藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)09161007，0.25g/片。將SASP研成粉末，用濃縮甲基纖維素鈉與生理鹽水配制成每毫升含0.17 g生藥的混懸液備用。硫酸葡聚糖鈉(DSS)40 000，上海西寶生物科技有限公司產(chǎn)品，編號(hào)OS1701A；大鼠TNF-α ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品，編號(hào)ml002859-J；大鼠IL-6試劑盒， 上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品,編號(hào)ml102828-J。BMJ-Ⅲ型石蠟包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，均為常州市中威電子儀器有限公司產(chǎn)品；RM2125RTS切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品；D3024R型低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品；GZX-GF-MBS-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與給藥

將SD大鼠100只按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組10只和造模組90只，造模組大鼠按照文獻(xiàn)[14]方法，采用3 g/L DSS自由飲用7 d制作大鼠UC模型。將造模成功的90只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、甘草瀉心湯+血竭組、柳氮磺胺吡啶組各30只。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[15]中動(dòng)物給藥量，甘草瀉心湯+血竭組每天給予甘草瀉心湯 6 mg/g、血竭375 μg/g混懸液灌胃，柳氮磺吡啶組每天給予柳氮磺吡啶450 μg/g混懸液灌胃，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組每天給予等體積生理鹽水2.5 mL/只灌胃，1 d 1次，連續(xù)灌胃7d 。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

末次灌胃結(jié)束后24 h,隨機(jī)抽取空白對(duì)照組大鼠5只處死，并處死模型對(duì)照組和藥物組每組10只大鼠，取血及結(jié)腸組織。按照參考文獻(xiàn)[16-18]對(duì)大鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)、結(jié)腸黏膜損傷(colon mucosa damage index,CMDI)及病理組織學(xué)(histopathological,HS)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1～3。此外，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α水平。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

剩余大鼠如前法繼續(xù)灌胃14 d，然后除空白對(duì)照組外，余各組在第3周灌胃的同時(shí)再次給予3 g/L DSS 溶液自由飲用7 d，以復(fù)制成UC復(fù)發(fā)型模型。二次造模結(jié)束后，立即處死所有大鼠，如前法再次對(duì)大鼠進(jìn)行DAI、CMDI及HS評(píng)分，檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α水平。

表2 CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 HS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 灌胃7 d后各組大鼠DAI 、CMDI及HS評(píng)分對(duì)比

灌胃7 d后，模型對(duì)照組DAI 、CMDI及HS 評(píng)分高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組DAI 、CMDI及HS 評(píng)分低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組HS評(píng)分低于柳氮磺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組與柳氮磺吡啶組DAI及CMDI評(píng)分對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。見(jiàn)表4。各組大鼠結(jié)腸組織蘇木素-伊紅(HE)染色后病理改變見(jiàn)圖1。

表4 灌胃7 d后各組大鼠DAI、CMDI及HS評(píng)分對(duì)比

A.空白對(duì)照組：腸黏膜完好，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體規(guī)則，杯狀細(xì)胞充足 B.模型對(duì)照組：腸黏膜損壞，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，腺體排列紊亂，隱窩基底層較多炎細(xì)胞浸潤(rùn) C.柳氮磺吡啶組：杯狀細(xì)胞和隱窩少許修復(fù)，較多腺體增生，隱窩基底層明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn) D.甘草瀉心湯+血竭組：杯狀細(xì)胞和隱窩明顯修復(fù)，較多腺體增生，隱窩基底層少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)

2.2 灌胃7 d后各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平對(duì)比

模型對(duì)照組大鼠血清IL-6、TNF-α水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組IL-6、TNF-α水平低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組IL-6、TNF-α水平低于柳氮磺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 灌胃7 d后各組大鼠血清IL-6及TNF-α水平對(duì)比

2.3 二次造模后各組大鼠DAI 、CMDI及HS評(píng)分對(duì)比

模型對(duì)照組和柳氮磺吡啶組各有2只大鼠在二次造模第3天死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)均有泌尿系統(tǒng)水腫及失血。二次造模后模型對(duì)照組DAI 、CMDI及HS 評(píng)分高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組DAI 、CMDI及HS 評(píng)分低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組HS 評(píng)分低于柳氮磺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組與柳氮磺吡啶組DAI及CMDI評(píng)分對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6。各組大鼠結(jié)腸組織HE染色后病理改變見(jiàn)圖2。

表6 二次造模后各組大鼠DAI、CMDI及HS評(píng)分對(duì)比 分，

A. 空白對(duì)照組：黏膜完整，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體規(guī)則，隱窩和杯狀細(xì)胞充足 B. 模型對(duì)照組：黏膜上皮損壞，潰瘍明顯，隱窩和杯狀細(xì)胞嚴(yán)重丟失，黏膜增厚、水腫，黏膜肌層較多炎細(xì)胞浸潤(rùn) C.柳氮磺吡啶組：黏膜少許瘢痕組織，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，隱窩基底層明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn) D.甘草瀉心湯+血竭組：黏膜少許瘢痕組織，杯狀細(xì)胞和隱窩少許丟失，隱窩基底層少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)

2.4 二次造模后各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平

模型對(duì)照組大鼠血清IL-6、TNF-α水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；柳氮磺吡啶組和甘草瀉心湯+血竭組IL-6、TNF-α水平低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組IL-6、TNF-α水平低于柳氮磺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表7。

表7 二次造模后各組大鼠血清IL-6及TNF-α水平對(duì)比

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是慢性非特異性炎癥性腸病的一種，主要病理表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜損傷，病變常累及黏膜和黏膜下層，發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是機(jī)體的異常免疫反應(yīng)導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能損壞及炎癥反應(yīng)[19-20]。隨著環(huán)境影響和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率在我國(guó)逐年增高[21],且病程超過(guò)30年的癌變率可高達(dá)30%[22]，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。研究表明，一位潰瘍性結(jié)腸炎患者每年的花費(fèi)在926.49～6 583.17美元之間，且經(jīng)濟(jì)付出與治療回報(bào)常不成正比[23]，長(zhǎng)期用藥的不良反應(yīng)和高昂的費(fèi)用降低了患者的生活質(zhì)量和滿意度。西醫(yī)學(xué)治療UC只能緩解癥狀[24]，而越來(lái)越多的中醫(yī)藥被研究證實(shí)對(duì)UC具有良好的抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用并被廣泛用于UC的治療。 根據(jù)潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作的痛、瀉、黏液膿血便的主要臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾虛為其發(fā)病之本，濕邪為其致病之標(biāo)，血瘀為局部病理變化[25]。濕與瘀交結(jié)，蘊(yùn)于腸間，寒熱錯(cuò)雜，導(dǎo)致UC經(jīng)久不愈，每因感受外邪、飲食不當(dāng)、勞累、情志變化時(shí)誘發(fā)，益氣健脾、除濕化瘀是緩解其發(fā)作，也是防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[26]。甘草瀉心湯由甘草、半夏、黃芩、黃連、干姜、大棗、黨參組成，補(bǔ)、清結(jié)合，是治療濕阻中焦、脾胃虛弱、寒熱錯(cuò)雜的經(jīng)典方，有黏膜修復(fù)劑之稱，具有抗?jié)?、調(diào)節(jié)黏膜分泌和機(jī)體免疫功能的作用，能促進(jìn)UC腸道屏障功能修復(fù)[11-12]。中藥血竭能散瘀定痛，止血生肌，可改善局部血液瘀滯狀態(tài)，調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)結(jié)腸黏膜潰瘍愈合[13]。甘草瀉心湯聯(lián)合血竭緊扣UC患者濕伏血瘀、脾胃虛弱的病機(jī)特點(diǎn)，既能健脾益氣，除腸間之濕；又能行內(nèi)瘀之血，使內(nèi)伏濕瘀得除，消除致病之因和病理產(chǎn)物，從而達(dá)到治療和防止UC復(fù)發(fā)的作用。

IL-6和TNF-α是重要的促炎癥細(xì)胞因子。IL-6 能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，使TNF-α的生物學(xué)活性增強(qiáng)，炎癥反應(yīng)加重，其在血清中的水平可反映UC的嚴(yán)重程度[22]。TNF-α能激活上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子，使中性粒細(xì)胞聚集，炎癥效應(yīng)放大，損傷腸黏膜組織，其在血清中的水平與UC嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[27]。本研究表明，第1次造模后，大鼠倦怠，厭食，腹瀉，便血，體質(zhì)量減輕；結(jié)腸黏膜充血、水腫，腸腔管壁增厚粘連，腸黏膜腺體排列紊亂，上皮損壞及潰瘍形成，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，隱窩基底層較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組大鼠經(jīng)相應(yīng)藥物灌胃后，大鼠活動(dòng)量及進(jìn)食量增加，大便逐漸成形并轉(zhuǎn)為顆粒狀，便血消失，體質(zhì)量增加，腸黏膜充血、水腫、糜爛減輕；杯狀細(xì)胞和隱窩有不同程度的修復(fù)，較多腺體增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。第2次造模后模型對(duì)照組大鼠大便質(zhì)地更稀，便血量增多；結(jié)腸黏膜上皮損壞加重，潰瘍?cè)龆?，結(jié)腸與周?chē)M織粘連明顯，隱窩和杯狀細(xì)胞嚴(yán)重丟失，黏膜肌層較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組大鼠的大便質(zhì)地不同程度變軟，再次出現(xiàn)便血；腸黏膜充血、水腫，并有糜爛，新生潰瘍下面有少許瘢痕組織，隱窩和杯狀細(xì)胞少許丟失，隱窩基底層可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。灌胃7 d和二次造模后模型對(duì)照組DAI、CMDI、HS 評(píng)分及血清TNF-α、IL-6水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組DAI、CMDI、HS 評(píng)分及血清TNF-α、IL-6水平較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組HS 評(píng)分及血清TNF-α、IL-6水平較柳氮磺吡啶組低(P<0.05)。結(jié)果表明，甘草瀉心湯+血竭能消除UC模型大鼠的癥狀，促進(jìn)損傷的腸黏膜炎癥消退并修復(fù)，改善結(jié)腸黏膜的病理?yè)p害，促進(jìn)潰瘍愈合、抑制UC大鼠血清TNF-α、IL-6的表達(dá)。

綜上所述，甘草瀉心湯聯(lián)合血竭灌胃能改善DSS誘導(dǎo)的UC模型大鼠腹瀉及黏液血便的癥狀，降低UC大鼠結(jié)腸DAI、CMDI及HS 評(píng)分，抑制UC大鼠血清TNF-α、IL-6的表達(dá)，具有明確的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎復(fù)發(fā)作用。