葡萄酒泥蛋白質(zhì)水解制備氨基酸工藝研究

李鳳玲,洪詩雨,李夢娟,李 祥

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南 鄭州 450046)

葡萄酒泥是葡萄酒在釀造過程和陳釀期間產(chǎn)生的沉淀物，據(jù)統(tǒng)計每生產(chǎn)100 t的葡萄酒，可形成2.5 t～4 t的葡萄酒泥。葡萄酒泥的主要成分有酵母菌體、多酚類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類和脂類等物質(zhì)。目前酒泥的開發(fā)利用方式主要是提取酒泥谷胱甘肽[1]、提取酒石酸[2]、提取酚類物質(zhì)[3]、提取酒泥酵母多糖如甘露聚糖和葡聚糖[4-6]等，對酒泥蛋白質(zhì)的開發(fā)利用研究較少。

酒泥蛋白主要包括酵母菌體蛋白和葡萄蛋白。在葡萄酒成熟和穩(wěn)定的過程中，在特定的條件下，葡萄酒泥中的酵母會發(fā)生自溶，致酵母的細胞膜破裂，細胞中的蛋白酶、核酸酶、葡萄糖水解酶等物質(zhì)被釋放出來，酶的活性增加，導致細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)被分解為小分子成分[7]。所以酒泥酵母蛋白與一般酵母蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的差別，水解條件也有不同。本實驗采用酸水解的方法對葡萄酒酒泥蛋白進行水解，研究葡萄酒泥蛋白酸水解的最適工藝條件，為葡萄酒泥蛋白的進一步開發(fā)利用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葡萄酒泥由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院釀酒工程實驗室提供。

1.2 實驗儀器

Pwc214分析天平(武漢艾德衡器有限公司)；DHC-9143BS電熱鼓風干燥箱(蘇州江東精密儀器有限公司)；UV1100紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；DK-8D水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；TG18C高速離心機(江蘇凱特實驗儀器有限公司)；K1100全自動凱氏定氮儀(北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司)；BCD-529WD1 1HP海爾雙開門冰箱(青島海爾電冰箱總廠)；等。

1.3 實驗試劑

五水硫酸銅(天津市化工三廠有限公司)；18 mol/L硫酸(深圳市安澤科技有限公司)；甲基紅指示劑(分析純)、硫酸鉀(天津市致遠化學試劑有限公司)；2%硼酸溶液(江西金諾生物科技有限公司)；6 mol/L和12 mol/L鹽酸標準溶液(廣州和為醫(yī)藥科技有限公司)；醋酸溶液(廣州臻萃質(zhì)檢技術(shù)服務(wù)有限公司)；酚酞指示劑(南京滴純生物科技有限公司)；氫氧化鈉標準溶液(廣州市刺水科技有限公司)；0.5%茚三酮溶液(上海馨晟試劑有限公司)；pH 7的檸檬酸鈉緩沖溶液(廈門海標科技有限公司)；等。

1.4 葡萄酒泥預處理

1.4.1 除雜

采用加水浸泡的方法，將漂在水面的果皮和果梗等分揀出來。

1.4.2 脫色

精確稱取葡萄酒泥50.00 g，按樣品與水的比例1∶3加入蒸餾水水洗后放入離心機，10000 r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，經(jīng)重復水洗、離心，直至葡萄酒泥變?yōu)闊o色。

1.4.3 干燥

將所有酒泥倒入潔凈的托盤中，在105 ℃恒溫干燥箱中烘至半干，再分別用藥匙取出分裝到平皿中，烘干至恒重，計算含水量。

1.5 測定方法

1.5.1 葡萄酒泥蛋白質(zhì)含量的測定

用凱氏定氮法測定葡萄酒泥粗蛋白含量，按照下列公式計算結(jié)果。

式中：Y：葡萄酒酒泥蛋白質(zhì)含量(g/100 g)；V：酒泥消耗鹽酸的體積(mL)；V0：空白消耗鹽酸的體積(mL)；C：鹽酸的濃度(mol/L)；m：酒泥的質(zhì)量(g)；0.0140：1.0 mL鹽酸標準滴定溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量(g)。

1.5.2 酒泥水解液氨基酸含量的測定[8]

1.5.2.1 標準溶液的配制 用分析天平準確稱取0.5000 g甘氨酸，用蒸餾水定容至100 mL，即得5.0000 g/L的甘氨酸儲備溶液。用移液槍吸取1 mL 5.0000 g/L的甘氨酸儲備液于100 mL的容量瓶中，用99 mL緩沖溶液定容，配置成0.0500 g/L的甘氨酸標準溶液。用分析天平稱取1.0000 g茚三酮置于200 mL容量瓶中，用丙酮溶液定容至刻度，得到0.5%的茚三酮溶液。

1.5.2.2 標準曲線的繪制 用移液槍分別量取甘氨酸標準溶液0.00 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.70 mL、0.80 mL、0.90 mL、1.00 mL于7支試管中并編號，每個容量瓶中分別對應用移液槍加入5.00 mL、4.50 mL、4.40 mL、4.30 mL、4.20 mL、4.10 mL、4.00 mL的pH為7的中性檸檬酸鈉緩沖溶液，配成濃度為0.005 g/L、0.006 g/L、0.007 g/L、0.008 g/L、0.009 g/L、0.010 g/L，均加入1 ml的0.5%茚三酮顯色劑，于100 ℃水浴半個小時，取出后迅速冷卻。此時打開紫外分光光度計預熱，冷卻后在560 nm處測定，將加入0.00 ml甘氨酸的溶液當作空白值，分別測定另外6個的吸光值。通過測得的吸光值，以甘氨酸的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，應用Excel軟件繪制標準曲線和趨勢圖，得到回歸方程為y=188.91x-0.9649(R2=0.997)。

1.6 單因素實驗

1.6.1 溫度對酒泥蛋白水解度的影響

用分析天平分別稱取15份2.0000 g烘干的葡萄酒酒泥，放入圓底燒瓶中，每個燒瓶編號，均加入6.0 mol/L的鹽酸溶液20 mL，水解時間均為20 h，設(shè)定水解溫度為80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃，每個溫度做3個平行試驗，打開水浴鍋，設(shè)置好溫度，將對應溫度的燒瓶放置于水浴鍋中，擺放好后，在每個燒瓶瓶口處放上一個小漏斗，以免鹽酸被蒸干。

待水解時間到，將15個圓底燒瓶取出，迅速降至室溫，將水解液全部過濾到對應編號的25.00 mL的容量瓶中，用緩沖溶液定容至刻度處，取濾液5.000 mL(用5.000 mL蒸餾水做空白實驗)，用移液槍加0.5%茚三酮試劑1.000 mL，在100 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，測定在560 nm處的吸光值。測得吸光值的數(shù)據(jù)，根據(jù)下列公式計算氨基酸的含量，確定酒泥蛋白鹽酸水解的最適溫度。

式中Y為水解得到的氨基酸含量(mg/g)；m為葡萄酒酒泥測定樣品的質(zhì)量(g)；C為根據(jù)標準曲線回歸方程計算的氨基酸的濃度(mg/mL)。

1.6.2 水解時間對酒泥蛋白水解度的影響

用1.6.1同樣的方法取樣后，分別加入6.0 mol/L的鹽酸溶液20 mL，水解的溫度均為90 ℃，水解的時間為12 h、14 h、16 h、18 h、20 h。做酸水解試驗，用茚三酮測定氨基氮法測得的吸光值，通過公式計算得出氨基酸的含量，以確定蛋白質(zhì)酸水解的最適時間。

1.6.3 鹽酸濃度對酒泥蛋白水解度的影響

用濃度與物質(zhì)的量的公式，分別算出用6.0 mol/L、12.0 mol/L的鹽酸溶液配制出5.0 mol/L、5.5 mol/L、6.0 mol/L、6.5 mol/L、7.0 mol/L的鹽酸溶液需要加蒸餾水的體積，用量筒量取，再將濃鹽酸用玻璃棒引流至燒杯中，放至室溫，倒入鹽酸試劑瓶中備用。

用分析天平稱取15份1.0000 g酒泥放入圓底燒瓶中，分別取5.0 mol/L、5.5 mol/L、6.0 mol/L、6.5 mol/L、7.0 mol/L的鹽酸溶液20 mL，溫度為90 ℃，水解時間為16 h，進行酸水解試驗，得出酸水解的最佳濃度。

1.7 葡萄酒泥酸水解正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計正交實驗：取最適的點和它左右兩邊的點作為三因素三水平實驗的數(shù)據(jù)，按照正交實驗表2和表3進行實驗，三組平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 凱氏定氮法測定結(jié)果

結(jié)果見表1。通過公式計算得出，凱氏定氮法測得的粗蛋白含量為19.26 g/100 g。

表1 凱氏定氮法結(jié)果

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 溫度對水解率的影響

結(jié)果見圖1。通過圖1可以看出，隨著溫度的升高，氨基酸含量也越來越高，90℃時達最高，隨后氨基酸含量下降。說明90 ℃是酒泥蛋白反應的最適溫度，氨基酸含量最高(144.58 mg/g)，蛋白質(zhì)水解率達到了75.07%。在80 ℃、85 ℃時比90 ℃時測得的氨基酸含量少，可能是因為在較低溫度時，蛋白質(zhì)并不能完全水解，所以氨基酸得率較低；在95 ℃、100 ℃、105 ℃時，溫度升高氨基酸含量卻降低，可能是在較高溫度時蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物有部分遭到了破壞。

圖1 水解溫度對氨基酸含量的影響

圖2 水解時間對氨基酸含量的影響

2.2.2 時間對水解率的影響

結(jié)果見圖2。通過圖2可以看出，水解時間延長，水解得到的氨基酸含量也在增加，水解時間達到16 h后，氨基酸含量不再上升，反而下降，表明酒泥蛋白水解的最佳時間為16 h，氨基酸含量為144.37 mg/g，蛋白質(zhì)水解率為74.96%。在12 h、14 h時，蛋白質(zhì)水解成氨基酸的含量較16 h低，可能是因為時間短，蛋白質(zhì)不能充分水解；在18 h、20 h時，水解的氨基酸含量比16 h低，可能是因為水解時間長導致其他物質(zhì)也被水解出來或水解出來的氨基酸遭受到一定的破壞所致，在20 h時可以看到比18 h時有略微的上升，但此時斜率已經(jīng)沒有14 h～16 h水解蛋白質(zhì)的斜率高，所以16 h仍是最佳的水解時間。

2.2.3 鹽酸濃度對水解率的影響

結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，在鹽酸的濃度為6.5 mol/L時，氨基酸含量最高，為146.09 mg/g，蛋白質(zhì)水解率達到了75.85%。此為酸水解的最適鹽酸濃度。氨基酸的含量在鹽酸濃度5.0 mol/L、5.5 mol/L、6.0 mol/L時較6.5 mol/L低，可能是因為酸的濃度不夠，水解產(chǎn)物不完全；在7.0 mol/L時比6.5 mol/L低，濃度升高，氨基酸含量卻下降，可能是因為在酸度過高時，水解得到的氨基酸部分被破壞。

圖3 鹽酸濃度對氨基酸含量的影響

2.3 正交實驗結(jié)果

正交實驗的因素水平見表2。

表2 因素水平表

正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 正交設(shè)計及結(jié)果

正交實驗方差分析見表4。

表4 正交實驗方差分析

正交實驗主體間效應檢驗見表5。

用SPSS 26數(shù)據(jù)分析軟件對正交實驗的結(jié)果進行方差分析和主效應檢驗，從表3、表4、表5的結(jié)果可以看出三種因素影響的主次順序為：水解溫度>水解時間>酸的濃度。提取葡萄酒酒泥氨基酸的最優(yōu)組合為：A3C2B1，即水解的溫度為95 ℃，水解的時間為14 h，鹽酸的濃度為6.5 mol/L。通過表4和表5可以看出水解的溫度和時間對氨基酸水解的影響較為顯著。采用最優(yōu)組合條件，氨基酸產(chǎn)量為168.26 mg/g，水解率達到了87.36%，在此條件下得到的氨基酸含量比正交實驗中其他各組的結(jié)果都高，證明這個組合即為葡萄酒酒泥氨基酸制備的最佳工藝條件。

表5 正交實驗主體間效應檢驗

3 結(jié)論

采用酸水解法水解酒泥蛋白，研究水解溫度、時間、酸的濃度三個因素對葡萄酒酒泥蛋白質(zhì)水解的影響。實驗結(jié)果表明，酒泥蛋白水解的最適條件為：溫度90 ℃、時間16 h、鹽酸濃度6.5 mol/L。由正交實驗可知，酒泥蛋白水解的最佳條件為：水解溫度95 ℃，水解時間14 h，鹽酸濃度6.5 mol/L。在此條件下酒泥蛋白水解液的氨基酸含量可達到168.26 mg/g，水解率達到了87.36%。對葡萄酒泥蛋白質(zhì)其它水解方法的水解條件和水解效果以及葡萄酒泥的開發(fā)途徑尚待進一步研究與探索。