川麥冬、浙麥冬中8 種成分測定及綜合質(zhì)量評價

顧志榮，李 芹，呂 鑫，孫嵐萍，祁 梅*，葛 斌*

（1.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥學部，四川 瀘州 646000；3.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000）

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-GawL 的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1]，功效養(yǎng)陰生津、潤肺清心、潤腸通便，用于肺胃陰虛之津少口渴、干咳咯血，心陰不足之心悸易驚、心煩不眠，熱病傷津之腸燥便秘等［2]，主產(chǎn)于四川及浙江一帶，分別稱為“川麥冬”“浙麥冬”。目前，我國產(chǎn)量最大、應用最廣、市場流通量最大的是川麥冬，綿陽市三臺縣花園鎮(zhèn)是最大主產(chǎn)區(qū)，也是國家地理標志保護產(chǎn)品［3-4]，雅安市雨城區(qū)也是主產(chǎn)區(qū)。本草記載，杭麥冬質(zhì)量最好，為著名的“浙八味”之一，但因種質(zhì)資源匱乏、種植經(jīng)驗流失、價格波動大、生長周期長等原因?qū)е缕浞N植面積逐步萎縮，同時傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)城市化進程加快和地域經(jīng)濟發(fā)達，大多數(shù)藥農(nóng)已放棄種植，導致浙麥冬減產(chǎn)甚至近乎消失，現(xiàn)多為零散種植，大部分作為景觀作物，以慈溪市崇壽鎮(zhèn)種植較多［5]。

現(xiàn)代研究表明，川麥冬、浙麥冬屬不同產(chǎn)地的同一種屬中藥，其成分種類及主要藥理作用無明顯不同，但成分含量存在明顯差異。麥冬含有皂苷、黃酮、多糖等多種類型的有效成分，但在2020 年版《中國藥典》 中僅有總皂苷一項指標［2]，難以對其進行全面質(zhì)量控制與評價。目前，尚缺少基于多指標成分及將單體化合物與有效部位群相結(jié)合的川麥冬、杭麥冬綜合質(zhì)量評價，本實驗建立麥冬中5 個主要單體化合物及總皂苷、總黃酮、總多糖含量的測定方法，采用方差分析進行多重比較，并建立聚類分析及主成分分析模型進行產(chǎn)區(qū)鑒別與綜合質(zhì)量評價。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，包括二元泵、自動進樣器）；Alltech 3300 型ELSD（美國Grace 公司）；UV8100A 型紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（法國Merck Millipore 公司）；DZF-6090 型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；AL204 型電子天平（萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；DD-5M 型離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；SB25-12DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 60 批麥冬采集于四川、浙江3個主要產(chǎn)區(qū)，具體信息見表1，均經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根，粉碎后過80 目篩，冷藏備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

麥冬皂苷B（批號CHB180122）、麥冬皂苷D（批號 CHB180120）、麥冬皂苷 D′（批號CHB180121）、甲基麥冬二氫高異黃酮A（批號CHB190119）、甲基麥冬二氫高異黃酮B（批號CHB190125）、蘆?。ㄅ朇HB170303）、D-無水葡萄糖（批號CHB180115）對照品，均由成都克洛瑪生物科技有限公司提供，純度均≥98%；魯斯可皂苷元（批號4299）對照品，由上海詩丹德生物技術有限公司提供，純度≥98%。乙腈為色譜純（天津大茂化學試劑廠）；甲醇、正丁醇、無水乙醇、丙酮、高氯酸、濃氨溶液、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸等均為分析純（天津大茂化學試劑廠）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-ELSD 法同時測定5 種成分含量

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 5.51、7.72、8.62、10.14、7.53 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至25 mL，制備成質(zhì)量濃度分別為0.220 4、0.308 8、0.344 8、0.405 6、0.301 2 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取麥冬粉末約4.0 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入50 mL 甲醇，超聲（500 W、40 kHz）提取60 min，濾過，濾液于60 ℃水浴蒸至近干，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，以甲醇洗滌并定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent Extend C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～60 min，35%～ 65% A）；體積 流量1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測器ELSD，漂移管溫度100 ℃；氮氣體積流量3.0 L/min；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、5、10、15、20、25、30 μL，在“2.1.3”項色譜條件下測定。以峰面積的對數(shù)值為縱坐標（Y），對照品進樣量的對數(shù)值為橫坐標（X）進行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 精密吸取同一批供試品溶液（HY1）20 μL，在“2.1.3”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測得麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮 B 峰面積 RSD 分別為 0.92%、0.71%、0.84%、0.81%、0.93%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液（HY1），于0、2、4、6、10、14、18、24 h 在“2.1.3”項色譜條件下進樣，測得麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 峰面積RSD 分別為0.84%、0.98%、1.13%、1.21%、0.75%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批供試品溶液（HY1），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣，測得麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 峰面積RSD 分別為1.52%、1.85%、1.45%、1.61%、1.78%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的樣品（HY1）約2 g，共9 份，精密稱定，按低、中、高3 個水平（0.8、1.0、1.2 倍）精密加入對照品適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣，計算回收率。結(jié)果，麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 的平均加樣回收率分別為101.19%、100.24%、102.33%、98.93%、99.57%，RSD 分別 為1.76%、1.87%、1.94%、2.13%、2.21%。

2.1.9 樣品含量測定 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下測定，計算含量，結(jié)果見表3。

2.2 麥冬總皂苷含量測定 按2020 年版《中國藥典》 方法進行測定［2]，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

2.3 麥冬總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取于105 ℃干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對照品10.03 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度為0.200 6 mg/mL），于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 供試品溶液制備及吸光度測定 取麥冬粉末約1.5 g，精密稱定，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取2 h，放冷，70%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3.5 mL，分別加入5% 亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min 后加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min，再加入1% 氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻，用水定容至刻度，放置12 min［6]，即得。另精密吸取3.5 mL 純化水，同法制備得空白對照溶液。在200～800 nm 波長處進行全掃描，發(fā)現(xiàn)對照品與供試品溶液均在510 nm 處有最大吸收，因此在此處測定吸光度。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10、12 mL，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容，各精密量取3.5 mL，按“2.3.2”項下方法測定吸光度。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A=24.572X-0.423 8（r=0.999 6），在0.008～0.096 mg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按

“2.3.2”項下方法測定吸光度，連續(xù)6 次，測得其RSD 為1.26%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實驗 取同一批供試品溶液（HY1），按“2.3.2”項下方法于0、10、20、30、40、50、60 min 測定吸光度，測得其RSD 為1.25%，表明溶液在1 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗 取同一批供試品溶液（HY1）6 份，按“2.3.2”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.16%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批供試品溶液（HY1）6 份，精密加入對照品適量，按“2.3.2”項下方法測定吸光度，計算回收率。結(jié)果，總黃酮平均加樣回收率為100.35%，RSD 為1.72%。

2.3.8 樣品含量測定 按“2.3.2”項下方法測定吸光度，計算總黃酮含量，結(jié)果見表3。

2.4 麥冬總多糖含量測定

2.4.1 供試品溶液制備 取麥冬粉末約20 g，精密稱定，以石油醚250 mL 回流1 h 脫脂，濾過，棄提取液，揮干藥渣，藥渣加500 mL 純化水回流提取3 次，每次1 h，趁熱抽濾，合并提取液，水浴濃縮至100 mL，加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇體積分數(shù)達95%，靜置過夜，濾過，殘渣依次用丙酮、無水乙醇洗滌2 次，60 ℃烘干，稱定質(zhì)量。取約1 g，精密稱定，用純化水定容至100 mL量瓶中，即得［7]。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取于105 ℃干燥至恒定質(zhì)量的D-無水葡萄糖對照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，純化水溶解并定容至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL），于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 檢測波長選擇 精密吸取對照品、供試品溶液各1 mL，分別置于2 個20 mL 具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，再精密加入濃硫酸5 mL，迅速放入沸水浴中加熱15 min，迅速取出后于冰水混合液中冷卻5 min，停止反應。另精密吸取1 mL 純化水于20 mL 具塞試管中，同法制備得空白對照溶液，在200～800 nm 波長處進行全掃描。結(jié)果，對照品、供試品溶液均在488 nm 處有最大吸收，因此在此處測定吸光度。

2.4.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，純化水定容，各取1 mL，按“2.4.3”項下方法測定吸光度。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A=28.709X-0.126 4（r=0.999 3），在0.01～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按“2.4.3”項下方法測定吸光度，連續(xù)6 次，測得其RSD 為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液（HY1），按“2.4.3”項下方法于0、10、20、30、40、50、60 min 測定吸光度，測得 其RSD 為1.52%，表明溶液在1 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復性試驗 取同一批供試品溶液（HY1）6 份，按“2.4.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.34%，表明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批供試品溶液（HY1）6 份，精密加入對照品適量，按“2.4.3”項下方法測定吸光度，計算回收率。結(jié)果，總多糖平均加樣回收率為101.43%，RSD 為1.88%。

2.4.9 樣品含量測定 按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下方法測定吸光度，計算含量，結(jié)果見表3。

2.5 樣品成分含量的多重比較及相關性分析 為了比較3 個主產(chǎn)區(qū)麥冬中8 種成分含量的差異性，本實驗采用方差分析（ANOVA）進行兩兩比較，并繪制柱狀圖，見圖2，相關性分析見表4。由此可知，四川綿陽與雅安產(chǎn)麥冬的麥冬皂苷B、D、D′，甲基麥冬二氫高異黃酮A，總皂苷、總黃酮、總多糖含量均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），浙江慈溪產(chǎn)麥冬與四川綿陽、雅安產(chǎn)麥冬的麥冬皂苷B、D、D′，甲基麥冬二氫高異黃酮A、B，總黃酮、總多糖含量均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），浙江慈溪、四川綿陽、雅安產(chǎn)麥冬的甲基麥冬二氫高異黃酮B含量均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但三者總皂苷含量均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表4 樣品中化學成分含量的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of chemical constituent contents in samples

圖2 樣品中化學成分含量的多重比較Fig.2 Multiple comparison of chemical constituent contents in samples

浙麥冬中麥冬皂苷B、D′，甲基麥冬二氫高異黃酮A、B，總黃酮、總多糖的含量均高于川麥冬（P＜0.05），但川麥冬中麥冬皂苷D 高于浙麥冬（P＜0.05）；四川綿陽產(chǎn)麥冬中甲基麥冬二氫高異黃酮B 含量高于雅安（P＜0.05），其他成分均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

相關性分析表明，麥冬皂苷B、D′與甲基麥冬二氫高異黃酮A、B、總黃酮、總多糖的含量均呈顯著正相關，而麥冬皂苷D 與麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、B、總黃酮、總多糖的含量均呈顯著負相關，呈顯著正相關的成分在體現(xiàn)麥冬總體質(zhì)量及藥理效應方面可能具有正向協(xié)同作用，即一種成分含量較高時另一種成分含量傾向于也較高，而呈顯著負相關的成分則恰好相反。甲基麥冬二氫高異黃酮A、B 與總黃酮、總多糖，以及總黃酮與總多糖的含量均呈顯著正相關，表明麥冬中總黃酮與總多糖在體現(xiàn)藥材總體質(zhì)量及藥理效應方面可能具有正向協(xié)同作用，同時甲基麥冬二氫高異黃酮A、B 是麥冬總黃酮的重要組分。

2.6 聚類分析 本實驗以麥冬中8 種化學成分含量為變量進行聚類分析，以Euclidean distance（歐氏距離）系數(shù)為測度，采用between-groups linkage（組間平均鏈鎖）法進行聚類［8]，結(jié)果見圖3。由此可知，聚類分析能將浙麥冬與川麥冬明確歸類鑒別，但無法將川麥冬中的綿陽產(chǎn)麥冬與雅安產(chǎn)麥冬進行鑒別，進一步表明兩地麥冬的化學成分含量無明顯差異，但2 種麥冬之間差異明顯。

圖3 60 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of sixty batches of samples

2.7 基于主成分分析的綜合質(zhì)量評價 本實驗以麥冬中8 種化學成分含量的歸一化數(shù)據(jù)為變量，對3 個產(chǎn)區(qū)的60 批樣品進行主成分分析［9]，共提取了2 個主成分，累積貢獻率為77.563%，能反映整體變量的主要特征，主成分分析散點圖見圖4，主成分得分（F）及排名見表5。由此可知，主成分分析模型能鑒別浙麥冬與川麥冬，但無法區(qū)分川麥冬中的綿陽產(chǎn)麥冬與雅安產(chǎn)麥冬，與聚類分析一致。

表5 各樣品主成分得分排名Tab.5 Ranks of constituent scores of various samples

圖4 60 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for sixty batches of samples

F 越高，樣品質(zhì)量越好，可知排名前20 的樣品全部為浙麥冬，表明其總體質(zhì)量最好；排名第21～40 名的樣品中，綿陽產(chǎn)麥冬有14 批，占比70%，而雅安產(chǎn)僅占30%，表明川麥冬中綿陽產(chǎn)麥冬總體質(zhì)量優(yōu)于雅安產(chǎn)麥冬。綜合來看，3 個產(chǎn)區(qū)的麥冬質(zhì)量依次為浙江慈溪＞四川綿陽＞四川雅安。

3 討論

造成浙麥冬與川麥冬質(zhì)量差異的環(huán)境因素在于兩者主產(chǎn)區(qū)的氣候類型及環(huán)境因子差異較大，浙麥冬主產(chǎn)區(qū)海拔較川麥冬低，無霜期較短，年日照時數(shù)較長［10]；川麥冬的2 個主產(chǎn)區(qū)三臺縣花園鎮(zhèn)與雅安市雨城區(qū)的氣候類型及環(huán)境因子相近。除了環(huán)境因素，浙麥冬與川麥冬的種植模式也差異較大，川麥冬在種植次年的清明之后采收，而浙麥冬則在種植后的第3 年立夏后采收，兩者采收期時間跨度差異較大，加之種植環(huán)境差異明顯，是造成質(zhì)量差異的最顯著因素。浙麥冬品質(zhì)最優(yōu)，但生產(chǎn)周期長達3 年，種植成本較高，種植效益沒有川麥冬好，近年來生產(chǎn)規(guī)模逐年萎縮，種植資源逐漸向山東曹縣等地遷移，并且浙江東陽等地種植麥冬大多為引種的川麥冬［4]。

四川綿陽與雅安所產(chǎn)麥冬中麥冬皂苷B、D、D′，甲基麥冬二氫高異黃酮A、總皂苷、總黃酮、總多糖等含量均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），兩者均屬川麥冬主流產(chǎn)品，質(zhì)量具有均一性；浙江慈溪產(chǎn)麥冬與四川綿陽、雅安所產(chǎn)麥冬中麥冬皂苷B、D、D′，甲基麥冬二氫高異黃酮A、B，總黃酮、總多糖等含量均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），且浙麥冬中麥冬皂苷B、D′，甲基麥冬二氫高異黃酮A、B，總黃酮、總多糖的含量更高，表明川麥冬與浙麥冬的化學成分含量差異非常明顯，兩者不具有質(zhì)量均一性。從有效成分含量的角度講，浙麥冬的質(zhì)量明顯優(yōu)于川麥冬。

聚類分析與主成分分析均能將浙麥冬與川麥冬明確歸類鑒別，但無法將川麥冬中的綿陽產(chǎn)麥冬與雅安產(chǎn)麥冬進行鑒別，表明四川綿陽與雅安產(chǎn)麥冬的化學成分含量差異不明顯，但川麥冬與浙麥冬非常明顯，總體表現(xiàn)為后者更高。主成分得分及排名表明，川麥冬中綿陽產(chǎn)麥冬總體質(zhì)量優(yōu)于雅安產(chǎn)麥冬。

最新研究表明，麥冬抗動脈粥樣硬化的有效成分是總皂苷與高異黃酮類化合物［11]。麥冬總黃酮（尤其是高異黃酮類）是麥冬抗氧化、抗衰老、抗炎、抗應激、抗組胺、心血管保護等藥理效應的物質(zhì)基礎，而甲基麥冬二氫高異黃酮A 及B 是麥冬高異黃酮類的主要代表性成分［12]。麥冬皂苷與麥冬黃酮同是天然的誘導型一氧化氮合酶抑制劑［13]，也是麥冬抗炎、抗腫瘤的主要活性成分，麥冬皂苷與麥冬多糖也是潛在的天然免疫增強劑［14]，麥冬多糖是麥冬抗心肌缺血［15]、降血糖［16]的主要有效成分，麥冬皂苷D 具有較好的鎮(zhèn)咳［17]、抗炎［18]、抗腫瘤［19]作用，麥冬皂苷B［20]、麥冬皂苷D′［21]也是麥冬抗腫瘤的主要活性成分。

綜上所述，當前的質(zhì)量標準難以對麥冬進行全面質(zhì)量控制與評價；另一方面，浙麥冬與川麥冬的物質(zhì)基礎具有統(tǒng)計學差異，表明兩者質(zhì)量不具有一致性、均一性，因此不能用統(tǒng)一的標準來控制。對此，2015 年版《浙江省中藥炮制規(guī)范》 已有單獨的浙麥冬地方標準，可以有效區(qū)分浙麥冬與川麥冬［22]。