納米四氧化三鐵在茶葉農(nóng)藥殘留檢測中的應用及方法優(yōu)化

李 捷，張 峰，黃菁菁，丁立平，楊 方 ，姚清華

（1. 福州海關技術中心，福建 福州 350001；2. 榕城海關綜合技術服務中心，福建 福州 350300；3. 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】茶與咖啡、可可并稱世界三大非酒精性飲料，具有抗癌、提高機體抗氧化能力和增強免疫的功效，備受消費者青睞，也是我國重要的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一[1]。小綠葉蟬、茶尺蠖、茶麗絞象甲、茶餅病等病蟲害是影響茶葉產(chǎn)量的重要因素之一，為了控制病蟲害、雜草及提高產(chǎn)量，茶農(nóng)常常在茶園中施用農(nóng)藥[2?3]。近年來，茶葉中的農(nóng)藥殘留問題日益受到消費者的關注?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)外學者就茶葉中的農(nóng)藥殘留檢測、遷移規(guī)律和風險評估等進行了大量的研究[4?7]，其中精確定量分析茶葉中農(nóng)藥殘留是其他研究的基礎。目前，茶葉中農(nóng)藥殘留分析的樣品凈化方法多是采用固相分散萃取技術，N-丙基乙二胺填料（N-propyl ethylene diamine, PSA）和石墨化碳黑（GCB）是常用的關鍵凈化材料，主要用于去除色素、有機酸等干擾物質(zhì)[8?10]。但是PSA 和GCB 價格相對較高，大幅度增加了檢測成本；GCB 對多菌靈等平面型結構的農(nóng)藥具有較強的吸附性，對測定結果的準確性具有一定影響[11]?！颈狙芯壳腥朦c】納米Fe3O4，具有比表面積大、吸附位點多、吸附特異性強等優(yōu)點[12?14]，對茶葉中色素的選擇性吸附可能優(yōu)于PSA，且更利于平面型結構的農(nóng)藥測定，可大幅度提高樣品凈化效率和測定準確性。【擬解決的關鍵問題】本研究以多菌靈、三環(huán)唑2 種典型的平面型結構農(nóng)藥和嘧霉胺、吡蟲啉、啶蟲脒、滅多威、噻蟲嗪等5 種茶葉中常見的農(nóng)藥殘留種類為檢測對象，將納米Fe3O4應用于農(nóng)藥殘留檢測前處理，以期建立基于納米Fe3O4-磁固相分散萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的農(nóng)殘檢測方法，降低檢測成本，縮短操作時間，對茶葉質(zhì)量安全管控具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 1200-6460，美國Agilent 公司），配備ESI 離子源；SYNERY UV 超純水器（美國Milipore 公司）；IKA-MS3 漩渦振蕩器（德國IKA 公司）；氮吹儀（HN200，濟南海能儀器股份有限公司）；TDL-40B 離心機（上海安亭科學儀器廠）。50 mL 具塞聚丙烯離心管（德國Greiner 公司）；石墨化碳黑固相萃取填料（80～100目，美國Agilent 公司）；納米四氧化三鐵（98%，50～100 nm，阿拉丁試劑有限公司）；乙腈、甲苯（色譜純，德國Merck 公司）；無水硫酸鎂、無水氯化鈣、氯化鈉（分析純，上海試一化學試劑有限公司）；有機濾膜（0.22 μm，天津津騰有限公司）。多菌靈、嘧霉胺、三環(huán)唑、吡蟲啉、啶蟲脒、滅多威、噻蟲嗪標準物質(zhì)購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，含量均為100 μg·mL-1。

1.2 標準溶液配制

準確移取7 種農(nóng)藥標準溶液各0.500 mL 于50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，配制成1.00 μg·mL-1的混合標準儲備液，使用時再用乙腈配制成適當濃度的標準工作溶液。

1.3 樣品提取與凈化

稱取2 g（精確至0.01 g）粉碎并混勻的茶葉樣品，置于50 mL 具塞塑料離心管中，加入3 mL 飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻并靜置10 min 后準確加入20 mL乙腈，蓋緊瓶蓋，再渦旋振蕩30 s，超聲提取60 min，4 000 r·min?1離心5 min 后，將10 mL 上清液轉(zhuǎn)移至另一個塑料離心管中，加入2 g 無水氯化鈣，渦旋振蕩1 min，4 000 r·min?1離心5 min 后 移取6 mL 上清液至另一玻璃試管中，加入0.6 mL 甲苯和0.3 g 納米Fe3O4，渦旋振蕩30 s 后將磁鐵置于玻璃離心管底部，待納米Fe3O4全部吸附于玻璃試管底部后，準確移取5.5 mL 上清液于45 ℃下氮吹至干，1 mL 乙腈+水（1+1）復溶，過0.22 μm 有機濾膜，待進樣分析。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱Phenomenex Luna C8（150 mm × 2.0 mm × 3.0 μm）；流動相A 為含0.1 %甲酸（v/v）和5 mmol·L?1乙酸銨的水；流動相B 為乙腈；梯度洗脫：初始為70 %的A，30 %的B，保持0.5 min；0.5～3.0 min，A 線性變換為10 %，B 變換為90 %；3～6 min，保持10%的A，90%的B；6～9 min，A 線性變換為70 %，B 變換為30 %，保持3 min；全程共13 min。流速：0.3 mL·min?1；進樣量：5 μL；柱溫：35℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源；毛細管電壓：3 500 V；氣簾氣溫度：325 ℃；氣簾氣流速：8 mL·min?1；鞘氣溫度：340 ℃；鞘氣流速：12 mL·min?1；多反應監(jiān)測（MRM）方式檢測；7 種待測農(nóng)藥的保留時間、母離子、特征離子碎片、碰撞電壓及保留時間見表1。

表 1 7 種農(nóng)藥的液相色譜質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 LC-MS/MS testing parameters for 7 pesticides

2 結果與分析

2.1 納米Fe3O4 對茶葉的凈化效果

無水氯化鈣不但具有無水硫酸鎂的吸水作用，還能對茶葉提取液中的色素進行初步的凈化，降低后續(xù)凈化的難度，因此本試驗使用無水氯化鈣代替無水硫酸鎂作為除水劑。但是經(jīng)過無水氯化鈣初步凈化后，提取液仍有明顯的顏色，本研究采用納米Fe3O4進行二次凈化。圖1 為經(jīng)過MgSO4與CaCl2初步凈化，以及CaCl2初步凈化并納米Fe3O4二次凈化的茶葉提取液在可見光區(qū)波長400～780 nm 的吸光度曲線。結果表明，CaCl2去除茶葉色素的能力要優(yōu)于MgSO4，而在添加納米Fe3O4后，提取液中的色素含量更是大幅度降低，納米Fe3O4可以有效去除色素。以農(nóng)藥含量為50 μg·kg?1的茶葉樣品為檢測對象，納米Fe3O4組7 種農(nóng)藥的回收率均明顯高于農(nóng)藥殘留檢測GCB 組（圖2）。

圖 1 提取液經(jīng)不同材料凈化后的色素變化Fig. 1 Variation on pigments in tea extracts after treatment of different pigment-removing materials

2.2 納米Fe3O4 用量的優(yōu)化

納米Fe3O4使用量對農(nóng)藥回收率的影響如圖3示，平面結構農(nóng)藥多菌靈和三環(huán)唑的回收率隨著Fe3O4用量增加逐漸下降。Fe3O4用量高于300 mg時，回收率低于70%。綜合考慮到7 種農(nóng)藥的回收率均要滿足殘留檢測的要求，將Fe3O4用量定為300 mg。

圖 2 不同凈化材料對7 種農(nóng)藥的回收率影響Fig. 2 Recovery rate on 7 pesticides of newly developed method with pretreatment using different pigment-removing materials

2.3 基質(zhì)效應的考察

在電噴霧離子源進行離子化時，基質(zhì)和目標化合物會有競爭關系，包括基質(zhì)增強效應和基質(zhì)抑制效應[15]。試驗配制0、1、5、10、20、50 ng·mL?16個質(zhì)量濃度的基質(zhì)標準工作溶液及同濃度的溶劑標準工作溶液，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制工作曲線，以（基質(zhì)標準工作曲線斜率/溶劑標準工作曲線斜率）×100% 計算基質(zhì)效應（ME）。分別使用納米Fe3O4和GCB 進行二次凈化后，茶葉中7 種農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應如圖4 示，2 組基質(zhì)工作曲線和標準工作曲線斜率比值均低于50%，表明存在明顯的基質(zhì)效應。因此，本方法采用基質(zhì)匹配曲線對7 種農(nóng)藥殘留進行定量分析。但相比于GCB，F(xiàn)e3O4可以有效降低茶葉樣品在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上的基質(zhì)抑制效應。

圖 3 納米Fe3O4 用量的優(yōu)化Fig. 3 Optimization on Fe3O4 nanoparticle usage

圖 4 凈化材料對茶葉中農(nóng)藥檢測基質(zhì)效應的影響Fig. 4 Effect of pigment-removing materials on determination of 7 pesticides in tea

2.4 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以含0.1 % 甲酸的水作為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫的方式，對7 種農(nóng)藥進行MRM條件優(yōu)化，7 種農(nóng)藥均可在正離子模式下獲得[M+H]+的母離子，再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，分析碎片離子信息，選擇2～3 對響應值高、基線噪音值低的離子對作為定性離子對，選擇其中信號最強、干擾最小的定性離子對作為定量離子對。

進一步對液相色譜條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用Phenomenex Luna C8 色譜柱代替?zhèn)鹘y(tǒng)的C18 色譜柱進行分離，多菌靈的峰形得到明顯的改善；另外當采用含0.1 %甲酸和5 mmol·L?1乙酸銨的水替代含0.1 %甲酸的水作為流動相A 后，連續(xù)對混合標準溶液進樣，峰面積的RSD均較小，故將流動相A 改為含0.1 %甲酸和5 mmol·L?1乙酸銨的水。7 種農(nóng)藥的總離子流圖見圖5。

圖 5 50 μg·L?1 的7 種農(nóng)藥的標準溶液的總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatograms on 50 μg·L?1 solutions of 7 pesticides

2.5 方法的評價

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 配制質(zhì)量濃度水平分別為0、1、5、10、20、50 ng·mL?1的基質(zhì)混合標準工作溶液，以峰面積A 與對應目標物質(zhì)量濃度（X，ng·mL?1）繪制7 種農(nóng)藥的基質(zhì)標準工作曲線，線性相關系數(shù)（R2）均高于0.995，線性回歸方程和相關系數(shù)見表2。在空白茶葉樣品中添加含7 種目標物的標準溶液，制得不同目標物含量的加標樣品，按優(yōu)化條件進行測定，分別以3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比計算方法的檢出限和定量限。該方法的檢出限為0.15～0.60 μg·kg?1，定量限范圍為0.5～2.0 μg·kg?1。方法線性范圍可以滿足實際茶葉樣品檢測的需要。

2.5.2 方法的準確度和精密度 在茶葉空白樣品中添加混合標準溶液，獲得目標物含量為5、10、50 ng·g-13 個加標水平，按優(yōu)化后的方法重復測定6 次。茶葉樣品中7 種農(nóng)藥的加標回收率及精密度（RSD）如表3 示，茶葉中添加不同水平7 種農(nóng)藥的回收率為71.6%～107.7 %，相對標準偏差（RSD）為3.95%～13.62 %，表明該方法具有良好的回收率和精密度，能夠滿足茶葉中這7 種農(nóng)藥殘留量的分析要求[16]。

表 2 方法的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, R2, LODs, and LOQs on detections of 7 pesticides by newly developed detection method

表 3 7 種農(nóng)藥的加標回收率及精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and RSDs on spiked pesticides of newly developed detection method (n=6)

3 討論與結論

在使用有機試劑對茶葉等干性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留目標物提取前通常需要加水浸泡樣品，以此提高中強極性農(nóng)藥目標物的提取效率[17]。但是，同時會導致茶葉中色素、茶多酚、咖啡堿、有機酸等水溶性雜質(zhì)大量溶出，造成后續(xù)凈化的難度增大[17]。無水硫酸鎂由于其具有良好吸水性能被廣泛應用于QuEChERS 等植物源性食品農(nóng)藥殘留檢測的前處理[18?19]。但是無水硫酸鎂對于茶葉中的主要雜質(zhì)沒有凈化效果，而無水氯化鈣除了吸水性外，還能凈化茶多酚、咖啡堿、有機酸及色素等多種雜質(zhì)，本研究使用無水氯化鈣代替無水硫酸鎂對茶葉農(nóng)藥殘留提取液中多種雜質(zhì)進行初步凈化，取得良好的凈化效果。其可能性的機理是Ca2+有促進茶湯沉淀形成的作用，且隨著Ca2+濃度的增加，沉淀量相應增加[20]。

在對色素含量較高的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留進行分析時，由于具有平面結構的石墨化碳黑（GCB）對色素等具有類似平面結構的雜質(zhì)有極強的吸附作用，常在前處理時用作色素凈化吸附劑[21]。但其對多菌靈和三環(huán)唑等具有類似平面結構的農(nóng)藥也具有極強的吸附作用，導致這類農(nóng)藥經(jīng)過GCB 凈化后的回收率極低，難以滿足殘留檢測分析的要求。而本研究所用的納米Fe3O4不但能凈化色素，對農(nóng)藥尤其是平面結構農(nóng)藥的吸附作用明顯低于GCB，可以有效解決這一技術難題。同時，由于納米Fe3O4具有磁性，可以利用外加磁場進行分離，效率遠高于離心分離技術，大幅度提高了檢測效率[22]。因此，納米Fe3O4更加適用于茶葉中平面結構農(nóng)藥的凈化。