臭椿生物堿對5 種植物病原真菌的抑制作用

李永春，趙美榮，張 智

（1. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

0 引言

【研究意義】當(dāng)前，大約80%的植物病害是由真菌引起的，施用化學(xué)藥劑是植物病害防治的主要手段[1]。然而化學(xué)藥劑的長期施用給生態(tài)安全和人類健康帶來威脅，因而，從植物中尋找具有農(nóng)藥生物活性的天然代謝物，成為開發(fā)新型生物農(nóng)藥和發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的一種有效途徑[2?3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】臭椿Ailanthus altissima（Mill.）Swingle，苦木科臭椿屬植物，為我國本土樹種，在國外被稱為“天堂樹”，是一種優(yōu)勢植物資源，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有一定的開發(fā)利用價(jià)值[4]。臭椿的葉、莖皮、根皮、種子等常作為“土農(nóng)藥”，用于殺蟲[5?6]、除草[7?8]、抗植物病害[9?10]等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。臭椿含有苦木素、生物堿、萜類化合物、黃酮類物質(zhì)等多種活性成分[11]，其中生物堿是其主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎殺菌、抗寄生蟲等作用[12?13]。近年來，臭椿生物堿的抑菌性能受到廣泛關(guān)注，研究表明，臭椿生物堿對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、變形鏈球菌等有較強(qiáng)的抑菌活性[14?15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】此類抑菌研究多集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，關(guān)于臭椿生物堿對植物病原真菌抑制作用的研究還鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了探索臭椿生物堿在植物病原真菌防治中的應(yīng)用，本研究以5 種植物病原真菌為供試菌，分析臭椿粗生物堿及其分離物對供試真菌生長的影響，探討其抑菌作用，以期篩選出抑菌活性成分，為開發(fā)環(huán)境友好型的綠色植物源抑菌劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 供試材料：臭椿（干燥莖皮），購于安徽亳州中藥材批發(fā)市場，粉碎至60 目，備用。主要試劑：PDA 培養(yǎng)基（海博生物），95%乙醇、氨水、鹽酸、二氯甲烷、乙酸乙酯等均為分析純。

1.1.2 供試菌種 黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.cucumerinum）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、冬瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.benincasae）、芍藥灰霉病菌（Botrytis paeoniae）、牡丹炭疽病菌（Gloeosporiumsp.）由赤峰學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，將5 種供試真菌活化后，于PDA 培養(yǎng)基上（25±2 ）℃培養(yǎng)6 d，備用。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 BSA224 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司），RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），TD5A-WS 型低速離心機(jī)（湖南滬康離心機(jī)有限公司），HVE-50 型高壓滅菌器（HIRAYAMA公司），VS-1300L-U 型超凈工作臺（蘇州安泰公司），SHP-1500 型生化培養(yǎng)箱（金壇市金祥龍電子公司），SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臭椿粗生物堿的提取 參考胡苗芬等[14]的提取方法。稱取臭椿莖皮粉500 g，加入10 倍體積的95%乙醇浸泡3 d，8 層紗布過濾后抽濾，濾液合并，減壓濃縮得乙醇浸膏（Ea），將浸膏用1%鹽酸溶液分散后，4 000 r·min?1離心10 min，分層，得油相（Eb）和沉淀（Ec），取酸水液用氨水堿化至pH 10 左右，加入二氯甲烷充分萃取，合并萃取液，減壓濃縮后得粗生物堿（Ed）。

1.2.2 臭椿粗生物堿的抑菌活性初篩 抑菌活性測定采用菌絲生長速率抑制法[16]。稱取Ea、Eb、Ec和Ed等4 種粗分離物，分別溶于1%的二甲基亞砜（DMSO）溶液，超聲使其完全溶解，經(jīng)0.22 μm 無菌濾膜過濾，在無菌條件下加入到滅菌的PDA 培養(yǎng)基中，制成2 mg·mL?1的 含 藥 培 養(yǎng) 基。分 別 在 培 養(yǎng)6 d 的供試菌落邊緣取直徑6 mm 的菌餅，接種在含不同藥液的PDA 平板中央，以不含藥液的PDA 平板作對照，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。菌絲面向下，于（25±2 ）℃條件下培養(yǎng)。72 h 后十字交叉法測定菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長抑制率。菌落直徑/mm= 測量菌落直徑?菌餅直徑，抑制率/%=（對照菌落平均直徑?處理菌落平均直徑）/對照菌落平均直徑×100。

1.2.3 粗生物堿對供試病原菌的毒力測定 將粗生物堿分別配制為 0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000 mg·mL?1的含藥PDA 培養(yǎng)基，接種供試菌，培養(yǎng)，計(jì)算菌絲生長抑制率，配制方法和抑菌活性操作同1.2.2。將抑制率換算為幾率值y、藥劑質(zhì)量濃度（mg·mL?1）換算為對數(shù)值x，并進(jìn)行毒力回歸分析，計(jì)算各供試病原真菌的EC50值[17]。

1.2.4 粗生物堿Ed的分離及抑菌活性測定 粗生物堿分離采用真空液相色譜法（VLC）[18?19]。稱取5 g Ed溶于二氯甲烷，拌入薄層層析用硅膠H 粉，充分混勻后除去溶劑，干法上樣，洗脫劑從正己烷開始，依次用二氯甲烷、二氯甲烷∶乙酸乙酯（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4），最后用乙酸乙酯梯度洗脫，每100 mL 收集1 份，共收集21 份，薄層色譜跟蹤活性成分，將單一斑點(diǎn)的溶液混合，減壓濃縮后，獲得S1、S2、S3、S4等共4 種組分，分別稱取4 種組分，無菌條件下配制成 25 μg·mL?1的含藥PDA 培養(yǎng)基，并進(jìn)行抑菌活性分析。配制方法和抑菌活性操作同1.2.2。

1.2.5 分離物S2對供試病原菌的毒力及純化鑒定 無菌條件下將S2分別配制為 1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0、50.000 0 μg·mL?1的含藥PDA 培養(yǎng)基，接種供試菌，培養(yǎng)，抑菌活性測定。配制方法和抑菌活性操作同1.2.2，毒力回歸分析同1.2.3。將一定質(zhì)量的S2用丙酮溶解，4 ℃條件下重結(jié)晶，使用高效液相色譜（HPLC），通過面積歸一法檢測結(jié)晶的純度，色譜條件參照文獻(xiàn)[20]，并利用核磁共振波譜（NMR）對其進(jìn)行初步鑒定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理使用DPS15.10 軟件，差異顯著性分析采用Tukey test 和one-way ANOVA 法在a=0.05 水平下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭椿提取物的抑菌活性

臭椿提取物對供試菌的抑菌效果（圖1、表1）表明，在2 mg·mL?1的條件下，4 種提取物對5 種病原菌菌絲生長的影響不同，其中，Ea、Eb、Ec對黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌菌絲生長均有明顯抑制作用，但抑制率不高，均低于25%，對芍藥灰霉病菌菌絲生長抑制作用不顯著（P＞0.05）。與Ea、Eb、Ec的抑菌效果相比，Ed對供試菌的抑制作用更顯著，對芍藥灰霉病菌的抑制作用明顯優(yōu)于其他3 種粗提物，抑制率為24.18%，對黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌的抑制率都在50%以上，其中對牡丹炭疽病菌、禾谷鐮刀菌抑菌作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)到90%以上。

圖 1 5 種植物病原真菌在不同臭椿提取物的PDA 培養(yǎng)基上生長情況Fig. 1 Growth of 5 plant pathogenic fungi on PDA medium in presence of fractions of A. altissima alkaloids extract

表 1 臭椿粗提物對5 種植物病原真菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effects of crude extracts of A. altissima on 5 plant pathogenic fungi

表 2 Ed 對供試病原真菌的毒力Table 2 Toxicity of Ed against tested fungi

2.2 粗生物堿對供試病原菌的毒力分析

抑菌活性初篩結(jié)果表明，粗生物堿Ed對4 種植物病原真菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，繼而用濃度梯度法建立了Ed對供試病原真菌的毒力回歸方程，進(jìn)一步分析Ed對供試真菌的抑制能力。由表2 可知，Ed對黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌都表現(xiàn)出了良好的抑菌性能，其EC50分別為0.55、0.41、0.35、0.31 mg·mL?1。此外，在供試病原真菌中，發(fā)現(xiàn)Ed對鐮刀菌屬的病原真菌都表現(xiàn)出抑制作用，其中對禾谷鐮刀菌的毒力作用最強(qiáng)，EC50為0.31 mg·mL?1。

2.3 臭椿生物堿分離物對供試病原菌的抑菌活性

為了進(jìn)一步分析抑菌活性成分，使用真空液相色譜法將Ed分離，得到S1、S2、S3、S4等共4 種組分。以5 種植物病原真菌為供試菌，對4 種分離組分進(jìn)行了抑菌活性測定，抑菌效果見圖2、表3。在25 μg·mL?1條件下，4 種分離物對供試真菌的作用效果不同。與對照相比，S1對冬瓜枯萎病菌菌絲的生長有一定的促進(jìn)作用，對其他4 種供試菌菌絲生長沒有明顯的影響，S3和S4對5 種供試菌的影響也無顯著差異（P＜0.05），表明這3 種組分沒有明顯的抑菌活性。除芍藥灰霉病菌外，S2對其他4 種供試菌都表現(xiàn)出了明顯的抑制活性，對黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌，菌絲生長抑制率分別為34.07%、36.55%、21.67%、62.28%。

圖 2 5 種植物病原真菌在不同粗堿分離物的PDA 培養(yǎng)基上生長情況Fig. 2 Growth of 5 plant pathogenic fungi on PDA medium in presence of separated components of A. altissima alkaloids extract

表 3 粗堿分離物對5 種植物病原真菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of separated components on 5 plant pathogenic fungi

2.4 臭椿分離物S2 對供試病原菌的毒力分析

臭椿生物堿分離組分S2對供試菌的毒力分析見表4，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明了組分S2對供試的4 種病原真菌菌絲生長都具有良好的抑制作用，且抑制作用均與S2濃度呈正相關(guān)，其中對禾谷鐮刀菌的毒力作用最強(qiáng)，EC50為20.32 μg·mL?1，其后依次為牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌和黃瓜枯萎病菌。

表 4 S2 對供試病原真菌的毒力Table 4 Toxicity of S2 against tested fungi

3 討論與結(jié)論

臭椿作為一種優(yōu)勢資源植物，在抑制植物病原真菌方面有著較大的潛力。許多研究發(fā)現(xiàn)臭椿提取物具有抑制植物病原菌菌絲生長的作用。Balkan 等[21]研究發(fā)現(xiàn)臭椿葉片提取物具有抑制某些谷物病原真菌的能力。張燕寧等[22]采用生長速率法測定了56 種植物甲醇提取物的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭椿的甲醇提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性，對5 種植物病原真菌的生長抑制率均在80%以上。周江鴻等[9]研究了16 種園林植物粗提物對黃櫨枯萎病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)臭椿葉提取物對黃櫨枯萎病菌菌絲生長有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌效果達(dá)98.53%。生物堿作為臭椿的主要成分之一，其抑菌性能備受關(guān)注。劉繼梅等[23]研究結(jié)果表明，含有效成分生物堿的臭椿提取物對番茄霜霉病菌、西瓜枯萎病菌等顯示較強(qiáng)的抑菌活性。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，臭椿粗生物堿對5 種供試菌，黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、芍藥灰霉病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌等的抑制效果明顯優(yōu)于臭椿乙醇提取物（P＜0.05），除芍藥灰霉病菌外，臭椿粗生物堿對其余4 種供試真菌都具有較強(qiáng)的抑制活性，其中對牡丹炭疽病菌、禾谷鐮刀菌抑制率達(dá)到90%以上。

為了進(jìn)一步分析臭椿生物堿的抑菌活性成分，對臭椿生物堿進(jìn)行單一組分的分離并測定分離組分的抑菌活性。本試驗(yàn)采用了快速、高效的VLC 法初步分離臭椿粗生物堿，得到4 種單一組分。單一分離組分的抑菌活性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅組分S2表現(xiàn)出抑菌活性，且抑菌效果明顯。通過毒力測試，發(fā)現(xiàn)S2對黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌的EC50分別為51.95、44.33、46.67、20.32 μg·mL?1，與生物堿粗提物（Ed）相比，單堿的抑菌能力要優(yōu)于粗生物堿。用HPLC法測得S2的純度為95.6%，重結(jié)晶后含量大于98%。經(jīng)NMR 鑒定且與文獻(xiàn)[23?24]比較，該化合物為鐵屎米-6-酮生物堿。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，單一成分的生物堿對芍藥灰霉病菌菌絲生長沒有明顯的影響，粗生物堿對芍藥灰霉病菌雖有一定的抑制作用，但相比其他4 種供試菌，抑制效果不大。無論是單一成分還是粗生物堿對黃瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌等鐮刀菌和牡丹炭疽病菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，這一結(jié)果說明臭椿生物堿對植物病原真菌生長抑制作用具有選擇性。

綜上所述，臭椿粗生物堿以及單一成分鐵屎米-6-酮生物堿對黃瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌都產(chǎn)生較強(qiáng)的抑菌活性，在抑制植物病原真菌方面表現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛力。然而，臭椿的活性成分復(fù)雜多樣，其抗菌活性成分并不唯一。趙春超等[25]研究發(fā)現(xiàn)，臭椿種子含有的黃酮類化合物和木脂素類物質(zhì)也具有抗菌作用。王樂飛等[26]也報(bào)道從臭椿根皮中分離得到的臭椿萜酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌顯示較弱的抑制活性。因而對于臭椿中其他抗菌物質(zhì)成分，還有待進(jìn)一步探索，臭椿作為植物源抑菌劑的潛在應(yīng)用價(jià)值還需做深入的研究。