人腺病毒疫苗的研究進(jìn)展

席華龍，顧韓雪 綜述，孫博，谷鐵軍 審校

1.長(zhǎng)春百克生物科技股份公司，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）于 1953 年被Rowe 從腺樣組織中分離出來，是一種無包膜的雙鏈 DNA 病毒［1］。病毒直徑 70 ～ 100 nm，衣殼呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由240 個(gè)六鄰體（hexon）和12個(gè)五鄰體組成，每個(gè)五鄰體上均外有纖突（fiber）［2］。大部分腺病毒（adenovirus，AdV）通過科薩奇腺病毒CAR 受體介導(dǎo)感染，少部分AdV 使用膜輔助因子CD46 和 ／ 或橋粒芯糖蛋白 2（desmoglein 2，DSG2）作為受體［3-5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 HAdV 共 7 種（A ～ G），分為60 多種血清型。早期對(duì)HAdV 鑒定、表征和分類主要依賴于血清中和（serum neutralization，SN）和血凝抑制的方法，目前則主要通過基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)整個(gè)病毒基因組進(jìn)行分析，來對(duì)新的病毒分型［6-8］。HAdV 可通過多種途徑感染引發(fā)多種疾病，如腺病毒F 和G 種引發(fā)的腸胃炎，腺病毒B、C 和E 種引發(fā)的呼吸道疾病，腺病毒C 種引發(fā)的肝炎，腺病毒A、B 和D 種引發(fā)的腦膜炎，腺病毒B 種引發(fā)的膀胱炎，腺病毒B 和D 種引發(fā)的角膜炎和結(jié)膜炎等［2，9］。其中，尤以在兒童和軍隊(duì)中引發(fā)的急性呼吸道疾病較為嚴(yán)重，且無有效的治療藥物，主動(dòng)免疫成為唯一有效的預(yù)防手段［10-11］。本文對(duì)HAdV 疫苗的研發(fā)和應(yīng)用作一介紹，以期有助于推進(jìn)國(guó)內(nèi)HAdV疫苗的研究。

1 HAdV 滅活疫苗

第一種HAdV 疫苗產(chǎn)品誕生于美國(guó)，為福爾馬林滅活疫苗，包含4 型和7 型兩個(gè)型別［12］。將RI-67（HAdV4）和 RI-4-202（HAdV7）分別經(jīng)人氣管上皮細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞分離，最終適應(yīng)至原代猴腎上皮細(xì)胞。病毒感染4 ～7 d 后，收獲培養(yǎng)物進(jìn)行均質(zhì)處理，經(jīng)離心、過濾獲得病毒懸液，病毒懸液被抗血清中和后通過多種途徑注射倉鼠、乳鼠、成年小鼠、兔、豚鼠和恒河猴等動(dòng)物，進(jìn)行一系列安全性檢測(cè)，未檢測(cè)到外源微生物。病毒懸液經(jīng)福爾馬林水浴36 ℃滅活6 d，用Hanks 緩沖液4 ℃透析去除滅活劑后，制備的滅活疫苗首先接種腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)12 d，然后將細(xì)胞培養(yǎng)物接種猴腎細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)12 d，無細(xì)胞病變確認(rèn)滅活完全。由于病毒的種屬特異性，滅活疫苗免疫豚鼠并未激起有效的免疫應(yīng)答。在人體試驗(yàn)中，12 名志愿者于肱三頭肌注射1 mL 滅活疫苗，對(duì)其中5 名志愿者免疫前后的血清中和抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，每位志愿者不僅產(chǎn)生了4 型和7 型病毒中和抗體，對(duì)3 型病毒也產(chǎn)生了一定的交叉保護(hù)，但第2 針注射并未引起免疫增強(qiáng)效果［13-14］。在美國(guó)迪克斯堡新兵訓(xùn)練營(yíng)開展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，311 名士兵接種HAdV 滅活疫苗1 周后，僅有4.8%因呼吸道疾病住院治療，而安慰劑組312 名士兵因呼吸道疾病住院治療占23.8%，雙價(jià)滅活疫苗顯著降低了急性呼吸道疾病的發(fā)病率；在隨后的大型臨床試驗(yàn)中，來自245 個(gè)連隊(duì)的約14 000 士兵接種了HAdV滅活疫苗，但因人員訓(xùn)練和調(diào)離等，僅對(duì)其中8 238人完成了臨床跟蹤，結(jié)果顯示，雙價(jià)滅活疫苗能將HAdV 引起的急性呼吸道疾病降低90%，進(jìn)一步表明了疫苗商業(yè)化生產(chǎn)的可行性［15］。增加3 型后的3價(jià)滅活疫苗的應(yīng)用分析報(bào)告指出，3 價(jià)疫苗將發(fā)熱性呼吸道疾病的總發(fā)病率降低了55%，疾病導(dǎo)致的住院治療減少了65%，盡管保護(hù)率下降，但據(jù)估算當(dāng)年約為美軍節(jié)省了500 萬美元的開支，對(duì)新兵急性呼吸系統(tǒng)疾病的控制具有有重要價(jià)值［16-17］。但之后的研究發(fā)現(xiàn)，制備疫苗的毒種被SV40 病毒污染，該病毒在哺乳期倉鼠與人類組織培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)化，且SV40 病毒基因組的一部分可整合至7 型腺病毒基因組中形成雜交病毒，具有潛在的致癌作用，隨后該HAdV 滅活疫苗退出市場(chǎng)［18-19］。

2 HAdV 減毒活疫苗與口服活疫苗

由于猴腎細(xì)胞滅活疫苗的安全性問題以及猴的供應(yīng)短缺，科研人員使用更為安全且廉價(jià)的細(xì)胞來取代猴腎細(xì)胞［20］。取自豬的腎細(xì)胞在1 ～7 型HAdV感染7 ～14 d 后，產(chǎn)生類似于猴腎細(xì)胞或HeLa 細(xì)胞的病變效應(yīng)［21］。將7 型和4 型HAdV 分別在猴腎細(xì)胞上連續(xù)傳代17 代，再在豬腎細(xì)胞上傳代17 代，得到減毒的7 型和4 型HAdV。數(shù)名志愿者鼻腔滴入減毒后的病毒后，在7 型接種組，無志愿者發(fā)生類似感冒的感染癥狀，僅1 名接種150 000 TCID50病毒的志愿者因不適臥床1 日。初步觀察表明，1 500 TCID50以上劑量能誘導(dǎo)較高的中和抗體，但抗體水平在6個(gè)月內(nèi)下降了約2 倍。同時(shí)，接種組產(chǎn)生的中和抗體還對(duì)3 型HAdV 具有良好的交叉保護(hù)。5 名志愿者接種了減毒4 型HAdV，在咽喉部均未檢測(cè)到病毒。接種低劑量250 TCID50的3 名志愿者未產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體，而接種高劑量2 500 TCID50的2 名志愿者產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體，但均伴隨輕微的喉嚨疼痛［22］。由于未進(jìn)行傳代穩(wěn)定性研究，豬腎減毒的病毒株是否能回復(fù)毒力而在人群中造成感染，導(dǎo)致疾病流行仍是未知。

SV40 的污染以及病毒較低的生產(chǎn)效率促使科研人員在其他方向進(jìn)行HAdV 疫苗的設(shè)計(jì)開發(fā)。通過一系列的研究發(fā)現(xiàn)，HAdV 易感染下腸道，因此研發(fā)了新的免疫方法。將4 型或7 型HAdV 灌裝進(jìn)腸溶膠囊進(jìn)行口服，可使膠囊在胃部不釋放，選擇性的感染下腸道［23］。最初用人胚胎腎細(xì)胞培養(yǎng)病毒，但這種原代細(xì)胞由于潛在的肝炎或其他病原污染的可能性而不適合大規(guī)模的疫苗生產(chǎn)，Wistar 研究所分離的諸多可連續(xù)傳代的人胚二倍體細(xì)胞成為首選［24］。CL68578（HAdV4）經(jīng) WI-26 細(xì)胞分離，隨后僅在 WI-26 和 WI-38 兩株細(xì)胞上連續(xù)傳代；55142（HAdV7）分離后在人胚腎細(xì)胞HEK 上傳代5 次，隨后在WI-38 細(xì)胞上傳代13 次［25］。美國(guó)惠氏公司實(shí)驗(yàn)室將病毒經(jīng)凍干后與微晶纖維素和乳糖混合，60 mg 分裝入膠囊中，并在膠囊外涂抹一層鄰苯二甲酸酯腸衣［26］，志愿者口服膠囊疫苗后，病毒在腸道釋放呈無癥狀感染且產(chǎn)生中和抗體。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間觀察，未在呼吸道及血液中檢測(cè)到HAdV，表明病毒不會(huì)擴(kuò)散至上呼吸道并且不會(huì)產(chǎn)生病毒血癥。病毒最快可在第2天隨糞便排出，最長(zhǎng)可持續(xù)21 d，但在23 人的小規(guī)模試驗(yàn)中，接觸志愿者的易感人群并未被腸道排出病毒感染［27］。由于膠囊中某些成分導(dǎo)致病毒效力降低，惠氏公司用口服腸溶片取代膠囊。盡管隨后的2 項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)表明，腸溶片疫苗可將HAdV 感染降低90%以上，但疫苗免疫后產(chǎn)生的中和抗體強(qiáng)度要低于自然感染，惠氏的回復(fù)是與感染的嚴(yán)重程度有關(guān)［28］。在21 型口服疫苗的人體試驗(yàn)中，血清中檢測(cè)到IgA 而鼻腔分泌物中未檢測(cè)到，導(dǎo)致對(duì)黏膜免疫的作用產(chǎn)生了質(zhì)疑［29］。自1971 年開始，美軍開始在新兵訓(xùn)練營(yíng)實(shí)施口服4 型和7 型HAdV 疫苗的免疫計(jì)劃，直至1996 年，生產(chǎn)商惠氏公司由于廠房需升級(jí)改造停止生產(chǎn)，隨后幾年HAdV 感染在美軍中再次爆發(fā)［30］。

自2000 年，美國(guó)國(guó)防部開始加速尋找替代供應(yīng)商，隨后Barr 實(shí)驗(yàn)室承接惠氏公司的生產(chǎn)工藝并對(duì)劑型升級(jí)為口服腸溶包芯片，于2004 年開始臨床試驗(yàn)［31］。58 名美國(guó)陸軍軍校生參與了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，疫苗組和安慰劑組的不良反應(yīng)發(fā)病率基本一致。最常見（＞10%）的不良反應(yīng)報(bào)告為鼻塞、咳嗽、喉嚨痛、頭痛、腹痛、腹瀉、惡心，關(guān)節(jié)痛和鼻竇炎等，但均未影響日常訓(xùn)練。在第56 天，疫苗組對(duì)4 型和7 型HAdV 的抗體陽轉(zhuǎn)率分別達(dá)到73%和69%［25］。在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，有4 000 名美國(guó)陸軍和海軍士兵參與，91.9%的疫苗組和93.9%的安慰劑組接種者報(bào)告了不良反應(yīng)，但嚴(yán)重不良反應(yīng)均占1.2%。疫苗組對(duì)4 型和7 型HAdV 的抗體陽轉(zhuǎn)率分別達(dá)到94.5%和93.8%。該疫苗對(duì)預(yù)防由4 型HAdV 引起的發(fā)熱性呼吸道疾病的有效性達(dá)到99%；盡管在臨床期間未觀察到7 型HAdV 引發(fā)疾病的病例，但FDA 認(rèn)可7 型的血清學(xué)結(jié)果，準(zhǔn)許上市［32］。自2011 年上市后至2012 年底，Barr 生產(chǎn)了超過27 萬劑疫苗，近21萬美軍士兵參與了免疫計(jì)劃，由HAdV 感染導(dǎo)致的呼吸道疾病發(fā)病率迅速下降；在后續(xù)7 年的持續(xù)臨床觀察中，也未發(fā)現(xiàn)由HAdV 口服疫苗導(dǎo)致的意想不到的不良反應(yīng)［32-33］。

3 重組HAdV 疫苗

來自廣州醫(yī)科大學(xué)的周榮團(tuán)隊(duì)對(duì)HAdV 疫苗進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究。通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建了1 株具備感染性的重組3 型HAdV，隨后將已知的7 型HAdV 六鄰體表位基因整合至重組3 型HAdV 上進(jìn)行表位替換，繼續(xù)將重組3 型HAdV 的E3 基因替換為55 型HAdV 的六鄰體基因，最終構(gòu)建出的重組HAdV 可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)3 種型別HAdV 的抗體，在病毒攻擊時(shí)能有效降低肺部病毒載量。組織病理學(xué)觀察顯示，未經(jīng)免疫保護(hù)的小鼠肺部呈明顯的急性炎癥反應(yīng)，由炎癥細(xì)胞滲透導(dǎo)致肺泡壁明顯增寬，肺泡萎縮減少［34-36］。通過分子生物學(xué)方法分別將 7 型、14 型、55 型 HAdV 的六鄰體基因與 3 型HAdV的六鄰體進(jìn)行替換，包裝出不同型別的HAdV，通過β 丙內(nèi)酯滅活制備的四價(jià)HAdV 滅活苗可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生均衡的中和抗體應(yīng)答，彼此不會(huì)產(chǎn)生免疫干擾［37］。然而其制備過程中使用的癌細(xì)胞不具備疫苗生產(chǎn)資質(zhì)，更換為Vero 細(xì)胞或人二倍體等細(xì)胞后是否能工藝重現(xiàn)、滿足生產(chǎn)需求仍待進(jìn)一步研究。

4 流感載體疫苗

流感減毒活疫苗（live attenuated influenza vaccine，LAIV）是一種已獲批準(zhǔn)的流感疫苗，經(jīng)鼻腔給予LAIV 可誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫等多重免疫應(yīng)答［38-39］。將冷適應(yīng)、減毒流感病毒的6個(gè)內(nèi)部基因及HA、NA 基因通過反向遺傳學(xué)方法可包裝拯救出LAIV，如果將某些病毒的中和表位嵌入HA 或NA 基因中，則可包裝出具備嵌合表位的重組減毒活流感病毒［40］。如將呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的 G 蛋白或 F 蛋白的中和表位嵌入HA 基因中包裝出的重組病毒可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)特異性RSV 的中和抗體，并且在病毒攻擊時(shí)不會(huì)產(chǎn)生肺組織病理改變，結(jié)果表明，流感病毒載體能有效地提呈外源病毒表位并產(chǎn)生保護(hù)［41-42］；將 HAdV 六鄰體蛋白中和表位的 2 個(gè)重復(fù)序列嵌入NA 基因中，包裝出的重組病毒對(duì)小鼠滴鼻免疫后可產(chǎn)生較好的體液免疫應(yīng)答，在肺鼻灌洗液中檢測(cè)到黏膜sIgA 抗體并可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答［43］。將3 型和7 型HAdV 的六鄰體蛋白的 8個(gè)不同表位嵌入NS1 基因，也能在多種細(xì)胞中成功包裝拯救出重組病毒，滴度高達(dá)107PFU ／ mL。小鼠通過滴鼻免疫后可產(chǎn)生強(qiáng)大的體液、黏膜和細(xì)胞免疫反應(yīng)，既能對(duì)流感病毒又能對(duì)兩種型別的HAdV產(chǎn)生保護(hù)［44］。LAIV 已經(jīng)在俄羅斯應(yīng)用超過30 年，在美國(guó)和歐洲也已上市多年，2020 年也在我國(guó)上市，安全性均得到了有效驗(yàn)證［45-46］。在新冠疫情期間，國(guó)內(nèi)疫苗企業(yè)研發(fā)的攜帶新冠病毒刺突蛋白基因片段的流感病毒減毒疫苗株也已獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的臨床試驗(yàn)批件（批件號(hào)：2020L00039），該疫苗可通過鼻腔噴霧的方式接種，模擬呼吸道病毒天然感染途徑，激活局部免疫應(yīng)答和全身性免疫應(yīng)答而發(fā)揮保護(hù)作用。這些試驗(yàn)表明，在流感病毒載體基因中插入外源基因片段不會(huì)改變病毒自身屬性，基于流感病毒載體的HAdV 疫苗有待進(jìn)一步的臨床前和臨床研究。

5 核酸疫苗和基因工程亞單位疫苗

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，逐漸出現(xiàn)新的疫苗形式。新冠的流行給mRNA 疫苗帶來了歷史性的機(jī)遇；亞單位疫苗由于其良好的安全性、穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性等也有望逐步替代傳統(tǒng)疫苗［47-50］。但以上兩種形式的疫苗均依賴于免疫原的選擇，mRNA 疫苗還有賴于高效的遞送系統(tǒng)［51］。AdV 衣殼主要由3 種結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別為六鄰體蛋白、纖突蛋白和五鄰體蛋白。雖然針對(duì)3 種衣殼蛋白均能產(chǎn)生中和抗體，但相關(guān)研究表明，六鄰體蛋白是主要的靶點(diǎn)，為目前研究較多的抗原結(jié)構(gòu)蛋白，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多針對(duì)六鄰體的單克隆抗體［52-55］。無論是核酸疫苗還是基因工程亞單位疫苗均應(yīng)對(duì)免疫蛋白抗原進(jìn)行深入的研究和篩選，尋找適應(yīng)的動(dòng)物模型充分評(píng)價(jià)這些蛋白的免疫保護(hù)效果，獲得高免疫保護(hù)性的抗原來制備疫苗無疑會(huì)明顯降低疫苗的生產(chǎn)成本。

6 討論及展望

HAdV 引發(fā)的呼吸道疾病，在中國(guó)曾引發(fā)間歇性的流行爆發(fā)，尤其是21 世紀(jì)以來的55 型，在我國(guó)首次出現(xiàn)即引起數(shù)百人感染。AdV 感染不存在特效藥，有效的預(yù)防手段仍然是疫苗接種，相比于流感、呼吸道合胞病毒而言，國(guó)內(nèi)對(duì)于HAdV 的關(guān)注和研究較少。目前，全球范圍內(nèi)僅美國(guó)對(duì)HAdV 疫苗進(jìn)行過系統(tǒng)性的研究，并擁有全球唯一的HAdV 口服活疫苗。而中國(guó)人口密集大，為了預(yù)防易感人群感染，需盡早開發(fā)HAdV 疫苗。但開發(fā)何種形式的疫苗、如何確立相應(yīng)的檢測(cè)方法和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)均是未來需面對(duì)的挑戰(zhàn)。對(duì)于口服活疫苗，病毒排出是否會(huì)污染公共衛(wèi)生環(huán)境以及生物安全上的風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注；而減毒株的篩選與分離需大量的篩選工作和減毒特性驗(yàn)證，動(dòng)物細(xì)胞馴化的減毒株能否返祖引發(fā)更大規(guī)模更嚴(yán)重的感染也需重點(diǎn)關(guān)注；滅活疫苗的抗原如何檢測(cè)、疫苗效力如何測(cè)定以及缺乏國(guó)家標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)品，這均需企業(yè)與國(guó)家職能部門有效配合；未來針對(duì)HAdV 的新型的亞單位疫苗、病毒載體疫苗及DNA ／ mRNA 的核酸疫苗等對(duì)預(yù)防疾病感染的有效性仍有待進(jìn)一步科學(xué)研究；不同亞型的AdV 利用不同的受體進(jìn)行感染以及AdV 受體（CAR、DSG2、CD46）在人與鼠及其他模式動(dòng)物間的較大差異性，導(dǎo)致缺乏科學(xué)有效的動(dòng)物模型來進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)；以上這些問題均限制著疫苗的研發(fā)，亟待科研人員解決［56-58］。

綜上所述，AdV 作為病毒疫苗載體而被熟知，但其導(dǎo)致的呼吸道疾病的感染卻始終未引起社會(huì)關(guān)注。隨著GSK 公司重組帶狀皰疹疫苗的引入及國(guó)內(nèi)疫苗廠家相應(yīng)產(chǎn)品的臨床申報(bào)，HAdV 疫苗將成為國(guó)內(nèi)極少數(shù)欠缺的疫苗，因此應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注HAdV疫苗的研發(fā)。