早孕篩查聯(lián)合無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在高齡孕婦產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

戴禹德,肖建平

隨著女性知識(shí)程度的提升及生育觀念的轉(zhuǎn)變，孕產(chǎn)婦呈現(xiàn)高齡化趨勢。有研究表明，高齡孕婦相較適齡孕婦而言，發(fā)生妊娠合并癥的風(fēng)險(xiǎn)增加，如妊娠期糖尿病、子癇前期等，低體重兒、胎兒生長受限、出生缺陷等不良妊娠結(jié)局發(fā)生率也增加[1]。因此，應(yīng)重視高齡孕婦這類人群的孕期產(chǎn)檢。孕婦年齡增加，卵巢功能發(fā)生減退，卵子質(zhì)量下降，生殖細(xì)胞乃至受精卵發(fā)生畸變、減數(shù)分裂時(shí)不分離的機(jī)會(huì)增加，從而造成胚胎/胎兒發(fā)生染色體異常概率變大。孕婦高齡已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)染色體異常的獨(dú)立高危因素。染色體異常是出生缺陷發(fā)生的一大常見原因，出生缺陷的發(fā)生給患兒及其家庭帶來傷害。迄今為止，大多數(shù)染色體異常的臨床診療尚缺乏有效手段。因此，染色體異常的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)顯得尤為重要。

1 現(xiàn)有產(chǎn)前篩查/診斷技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn)

1.1 血清學(xué)篩查

通過檢測孕婦血中的相關(guān)蛋白和激素的含量水平,使用配套分析軟件結(jié)合孕婦病史、年齡、體重、孕周等計(jì)算出胎兒患有染色體遺傳病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。此技術(shù)主要篩查21-三體綜合征、18-三體綜合征風(fēng)險(xiǎn)以及神經(jīng)管結(jié)構(gòu)畸形。其篩查結(jié)果受孕齡、體重、種族、受孕方式、妊娠胎兒數(shù)、妊娠期吸煙、實(shí)驗(yàn)操作以及實(shí)驗(yàn)試劑等多種因素影響。血清學(xué)篩查是臨床應(yīng)用最廣泛的篩查方法，在一定程度上能增加染色體異常的檢出率，有研究顯示血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)人群的染色體異常檢出率高于低風(fēng)險(xiǎn)人群[2]。但其同時(shí)存在較高的假陽性率，增加有創(chuàng)診斷操作，有統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)血清學(xué)篩查染色體高風(fēng)險(xiǎn)最終確診概率只有3.98%[3]。

1.2 超聲探查

在《產(chǎn)前超聲檢查指南》的指導(dǎo)下可快速篩查出胎兒的綜合情況、明確胎兒畸形數(shù)目以及胎兒畸形的嚴(yán)重程度，為臨床準(zhǔn)確評(píng)估胎兒的健康狀況提供強(qiáng)有力的參考依據(jù)，及時(shí)同孕婦及其家屬進(jìn)行有效溝通，最大化保障母嬰健康。除直觀檢測出畸形外，超聲異常與染色體異常之間存在相關(guān)性。在一項(xiàng)研究中，超聲提示前腦無裂畸形、臍帶外露、巨大兒或頸項(xiàng)透明層≥3.5 mm的胎兒中，其中約40%合并染色體異常，8%屬于21、18、13-三體以及特納綜合征以外的染色體異常[4]。即便是在分子檢測技術(shù)快速發(fā)展的現(xiàn)在，孕期超聲檢查也不可或缺，血清學(xué)低風(fēng)險(xiǎn)、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)低風(fēng)險(xiǎn)仍有發(fā)生染色體異常以及單純結(jié)構(gòu)異常的可能。

1.3 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測

NIPT是基于孕婦外周血中游離胎兒DNA片段進(jìn)行測序，通過對(duì)比參考序列從而獲得每條染色體序列位置信息，對(duì)其進(jìn)行判讀。目前臨床上NIPT廣泛應(yīng)用于T21、T18、T13的檢測，且檢測價(jià)值極高。在Gil等[5]的一項(xiàng)Meta分析中，NIPT對(duì)單胎妊娠21-三體的診斷率高達(dá)99%，18-三體的診斷率為98%，13-三體的診斷率為99%,以及極低的假陽性率(0.13%)。但對(duì)于常見染色體非整倍體之外的染色體異常的檢測效果不佳，性染色體的陽性預(yù)測值僅為42.9%，染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的陽性預(yù)測值更低[6]。另外，NIPT存在假陰性、假陽性。假陽性的原因可能與局限性胎盤嵌合、雙胎之一胎消亡、母親攜帶基因拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)、母親患惡性腫瘤等有關(guān)。假陰性可能與胎兒嵌合或外周血胎兒游離DNA不足等因素相關(guān)。在NIPT檢測前后，醫(yī)師均應(yīng)強(qiáng)調(diào)NIPT的局限性，檢測結(jié)果不等同核型分析，異常結(jié)果仍需通過介入性產(chǎn)前診斷驗(yàn)證。

1.4 介入性產(chǎn)前診斷

在超聲波的引導(dǎo)下經(jīng)孕婦腹部提取胎兒相關(guān)樣本，進(jìn)而通過細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)或生化遺傳學(xué)檢查，進(jìn)行染色體診斷或基因診斷。羊水是目前最常用的檢測樣本。對(duì)樣本進(jìn)行分析方法包括染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、產(chǎn)前液相芯片技術(shù)(bacs-on-beadstm，Bobs)、染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)等。核型分析被認(rèn)為是遺傳性疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其培養(yǎng)周期長，出具報(bào)告長達(dá)4周，且分辨率低，僅能發(fā)現(xiàn)10 Mb以上的染色體異常。FISH理論上可以檢測所有染色體的異常，但由于探針尚未完善，目前僅用于21、18、13-三體及性染色非整倍體的快速檢測[7]。FISH是通過計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞來決定羊水細(xì)胞是否攜帶染色體數(shù)目異常，因此能夠準(zhǔn)確地檢出嵌合體。Bobs檢測目標(biāo)疾病有限，包括21、18、13、X、Y染色體異常及9種染色體微缺失、微重復(fù)。CMA是一種新興的染色體芯片分析技術(shù)，其檢測周期短，分辨率高，可檢出>1 Kb的亞顯微變異，可提高染色體異常的檢出率，但同時(shí)也增加了1%～2%的臨床不明意義的CNVs，給臨床遺傳咨詢帶來挑戰(zhàn)，且由于自身限制，無法檢測平衡性染色體結(jié)構(gòu)異常[8]。

2 高齡孕婦產(chǎn)前篩查及診斷應(yīng)用現(xiàn)狀

隨著國內(nèi)外各項(xiàng)篩查技術(shù)的發(fā)展、完善，高齡孕婦的產(chǎn)前篩查和診斷同步發(fā)生變化。2001年，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)及我國母嬰保健法均提出高齡孕婦應(yīng)行介入性產(chǎn)前診斷。但因其有創(chuàng)性可能帶來感染、胎兒損傷、醫(yī)源性胎兒流失等風(fēng)險(xiǎn)，且檢測周期長，技術(shù)要求高，加重孕婦心理負(fù)擔(dān)，使得高齡孕婦臨床依從性下降。2011年，NIPT投入臨床應(yīng)用，其無創(chuàng)、早期、高效等優(yōu)點(diǎn)成為高齡孕婦的備選。Okmen等[9]對(duì)NIPT應(yīng)用前后產(chǎn)前診斷發(fā)生的改變研究中，發(fā)現(xiàn)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷操作數(shù)目明顯減少。多項(xiàng)研究均表明NIPT可作為高齡孕婦首選篩查手段[10-12]。2015年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)及母胎醫(yī)學(xué)會(huì)均提出NIPT可作為一線篩查方式，高風(fēng)險(xiǎn)者再行介入性產(chǎn)前診斷。2016年《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》中指出孕婦年齡≥35歲是NIPT的慎用人群。其一，高齡孕婦行NIPT較高概率是高風(fēng)險(xiǎn)，從而推遲產(chǎn)前診斷時(shí)間及后續(xù)處理；其二，NIPT不能檢測到全部染色體異常[13]。高齡孕婦作為染色體異常高發(fā)的高危人群，一旦漏診，將給患兒及家庭增加負(fù)擔(dān)。因此，高齡孕婦首選NIPT還是產(chǎn)前診斷是一個(gè)非常艱難的平衡。

血清學(xué)篩查是臨床應(yīng)用最廣泛的篩查方法，然而隨著NIPT不斷發(fā)展進(jìn)步，有學(xué)者對(duì)血清學(xué)篩查存在的必要性提出質(zhì)疑。2016年，美國醫(yī)學(xué)遺傳和基因組學(xué)會(huì)提出NIPT可取代血清學(xué)篩查，但結(jié)合我國產(chǎn)篩中心覆蓋面不全及成本的考慮，血清學(xué)篩查仍有存在的必要性。在王宏等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)如果孕婦血清學(xué)篩查提示高風(fēng)險(xiǎn)，胎兒發(fā)生染色體異常風(fēng)險(xiǎn)增加，并且胎兒超聲篩查異常、自然流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局也均顯著高于血清學(xué)篩查低風(fēng)險(xiǎn)人群。

現(xiàn)有產(chǎn)前篩查及診斷手段對(duì)高齡孕婦各具優(yōu)缺點(diǎn)，也發(fā)現(xiàn)它們間聯(lián)合互補(bǔ)將呈現(xiàn)更大的優(yōu)勢。董媛等[15]通過對(duì)具有不同產(chǎn)前診斷指征行羊水穿刺的孕婦進(jìn)行回顧性分析，有351例高齡孕婦胎兒存在染色體異常，其研究假設(shè)所有高齡孕婦若只進(jìn)行血清學(xué)篩查，染色體異常胎兒檢出率為51%，只行NIPT異常檢出率為69.2%，若先行血清學(xué)篩查進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層再行NIPT其檢出率可達(dá)84.6%。羅麗雙等[16]對(duì)各類NIPT指征檢出染色體異常情況分析中，超聲軟指標(biāo)異常組NIPT陽性率(10.50%)高于其他組(P<0.01)。Kagan等[17]的研究中應(yīng)用早期血清學(xué)篩查聯(lián)合超聲可使21-三體檢出率達(dá)到90%，假陽性率為3%～5%，對(duì)早孕聯(lián)合篩查結(jié)果為臨界風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行NIPT檢測，可使21-三體檢出率提高至95%以上，假陽性率在3%以下。

3 高齡孕婦產(chǎn)前篩查/診斷策略展望

采用非侵入性方法盡可能篩查出更多的胎兒染色體異常已成為行業(yè)風(fēng)向。近年來，國內(nèi)外一些產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)對(duì)NIPT進(jìn)行了升級(jí)，檢測范圍拓展至性染色體異常(sex chromosome abnormalities,SCA)、CNV以及其他常染色體非整倍體的篩查。① SCA。Grati等[18]于2017年發(fā)表了一篇關(guān)于SCA的研究，NIPT檢測的陽性預(yù)測值為53%。針對(duì)合并超聲異常病例中，NIPT對(duì)SCA的陽性預(yù)測值可達(dá)到98.9%。NIPT對(duì)SCA檢測價(jià)值逐漸被認(rèn)可，但SCA不影響智力發(fā)育，共同臨床特征除多發(fā)性畸形外，表現(xiàn)為性特征發(fā)育異?；蛐韵侔l(fā)育不全，可通過激素替代治療或手術(shù)矯正。因此，對(duì)SCA檢測時(shí)應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的遺傳咨詢，避免醫(yī)療性胎兒丟失；② CNV(包括染色體微缺失/微重復(fù))。越來越多的臨床數(shù)據(jù)表明，CNV是人類遺傳疾病的主要原因之一，與胎兒結(jié)構(gòu)功能、智力發(fā)育等相關(guān)。近年來，有研究表明NIPT對(duì)21q11缺失、15q11.2-13缺失、1p36缺失、5p缺失等CNV檢出率可達(dá)90%以上[19]。CNV的檢測取決于胎兒游離DNA比例、測序深度、CNV大小等，測序深度越深，付出的經(jīng)濟(jì)成本顯著增加，胎兒游離DNA擴(kuò)增技術(shù)可提高胎兒游離DNA比例至4%以上，從而提高CNV的檢出率[20]；③ 其他常染色體非整倍體。從目前技術(shù)上可以檢測，但因缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù)，故也不推薦常規(guī)應(yīng)用于除T21、T18、T13以外的常染色體非整倍體。隨著測序深度及分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，從長遠(yuǎn)來看，NIPT有望成為一種常規(guī)產(chǎn)前診斷手段。

雖然介入性診斷存在一系列風(fēng)險(xiǎn)，但有學(xué)者對(duì)進(jìn)行和未進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦之間的流產(chǎn)率以及死胎率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)并無顯著性差異[21-22]。因此，在對(duì)有需要的孕婦進(jìn)行臨床遺傳咨詢時(shí)，應(yīng)詳細(xì)告知各項(xiàng)可供選擇的檢測方法的風(fēng)險(xiǎn)與收益，由孕婦自行選擇。此外，少數(shù)研究對(duì)孕婦年齡進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，40歲及以上年齡組異常率顯著高于35～39歲年齡組[23-24]。其中一項(xiàng)研究中，35～39歲27例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)羊水穿刺染色體核型分析檢出15例染色體異常，年齡≥40歲16例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)最終檢出11例染色體異常。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦年齡越大，NIPT檢測結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果符合率越高。由此，有學(xué)者提出可對(duì)年齡≥40歲的孕婦直接進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷。然而，結(jié)合目前分子檢測范圍及水平的限制，是否可以建議針對(duì)年齡>40歲的孕婦直接行介入性產(chǎn)前診斷，還需要足夠的臨床數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)語

當(dāng)高齡孕婦同時(shí)具有一項(xiàng)或多項(xiàng)的異常篩查結(jié)果，胎兒染色體異常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更高。隨著測序深度的加深、生物信息算法的優(yōu)化以及實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的進(jìn)步，早孕篩查聯(lián)合NIPT這一無創(chuàng)、高效的篩查策略將受到更多孕婦青睞、更多產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)認(rèn)可。但現(xiàn)階段，該篩查策略不能檢測出全部染色體異常和單基因變異，因此，應(yīng)對(duì)有需要的孕婦進(jìn)行詳細(xì)的遺傳咨詢。