一磷酸腺苷活化蛋白激酶／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白與自噬在非酒精性脂肪肝中作用的研究進(jìn)展

錢子冰，曾佩蕓綜述，張琦，劉靜審校

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）在世界范圍內(nèi)日益流行，是胰島素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steato hepatitis，NASH）及肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要危險因素。因一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性在炎癥、肥胖及糖尿病患者中降低［1］，因此，AMPK被認(rèn)為是改善酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的一種可行的治療策略。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細(xì)胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子，AMPK／mTOR信號通路是調(diào)控自噬的主要信號通路之一。自噬不僅調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝臟及胰島素抵抗，且保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷和細(xì)胞死亡。本文就AMPK／mTOR／自噬信號通路在NAFLD中的作用機制進(jìn)行綜述。

1 AMPK

1.1 AMPK亞基 哺乳動物AMPK為一種異三聚體復(fù)合物，由 α（α1 及 α2）、β（β1 及 β2）及 γ（γ1、γ2及γ3）亞基三部分構(gòu)成，α-亞基是催化單元，其他亞基為調(diào)節(jié)單元，可表達(dá)12種不同的AMPK復(fù)合物，如 α1β1γ1、α2β1γ1 等［2-3］。通過 AMP 與 γ-亞基的變構(gòu)結(jié)合或蘇氨酸殘基172（Thr172）的磷酸化激活α-亞基［4］，α-亞基編碼一個 N-端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD），該結(jié)構(gòu)域與 C-端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域相連；β-亞基的C-端區(qū)域充當(dāng)支架，與α-亞基及γ-亞基的C-端區(qū)域相互作用，β-亞基還包含一個碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate binding module，CBM）區(qū)域，又稱為糖原結(jié)合域（glycogen binding domain，GBD。γ-亞基含4個胱硫氨酸-b-合成酶結(jié)構(gòu)域（cystathionine-β-synthase，CBS），參與核苷酸合成，這種現(xiàn)象已在γ2（人類）及γ3（豬）亞型的自然突變基因中得到證實［5］。γ-亞基的突變導(dǎo)致AMPK活性增加，為在體內(nèi)長期激活A(yù)MPK做好了準(zhǔn)備。人類在γ2中發(fā)現(xiàn)了一些顯性遺傳突變，這些突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟功能異常，包括左心室肥厚、糖原積累及心室預(yù)興奮（Wolff-Parkinson-White綜合征），也可能導(dǎo)致心臟性猝死［6-7］。人類γ2在心臟中高表達(dá)，而γ3幾乎僅在骨骼肌中表達(dá)［8］。因此，了解物種中AMPK亞基的表達(dá)模式至關(guān)重要。

1.2 AMPK調(diào)控 AMPK通過 Thr172在 α-亞基KD激活段的磷酸化而激活，哺乳動物中鈣／鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性蛋白激酶（Ca2+／calmodulin-dependent protein kinase kinase，CaMKK）β 及肝臟激酶 B1（liver kinase B1，LKB1）被確定為AMPK的兩種上游激酶［9-10］。Thr172的磷酸化使AMPK活性增加2～3個數(shù)量級，AMP／ADP降低了Thr172去磷酸化率［11］。此外，一些小分子的AMPK直接激活劑已被鑒定，如A769662、991及MT63-78，它們結(jié)合在KD和β-亞基CBM之間，這些小分子直接激活劑可防止Thr172去磷酸化［12］。AMPK可通過AMP與γ-亞基結(jié)合或通過小分子激活劑進(jìn)一步被變構(gòu)激活［12］。在多數(shù)情況下，變構(gòu)激活的程度取決于AMPK復(fù)合物的組成，而在AMP充足的情況下，也受ATP濃度的影響［13-14］。有研究報道，核苷酸可促進(jìn)Thr172磷酸化，盡管這方面的調(diào)節(jié)仍存在爭議。一項研究報告稱，AMP及二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）均促進(jìn)了CaMKK β對Thr172的磷酸化［15］；另一項研究表明，AMP通過LKB1激活，不被ADP及CaMKK β激活［16］。這些作用的分子機制尚不清楚，盡管一項單獨的研究報道了AMP促進(jìn)AMPK、LKB1及軸蛋白之間的相互作用，通過促進(jìn)AMPK與LKB1之間相互作用，軸蛋白可促進(jìn)AMP增加Thr172磷酸化的機制［17］。另一項研究檢測了Thr172和S108（β1上一個自磷酸化位點）磷酸化對AMPK活性的要求，結(jié)果表明，在無Thr172磷酸化的情況下，A769662激活了AMPK，其活性水平與Thr172磷酸化的AMPK相似［18］。A769662激活非Thr172磷酸化的AMPK需β1上S108的磷酸化，S108突變使丙氨酸顯著降低了A769662刺激AMPK的能力［19］。這些發(fā)現(xiàn)表明，AMPK的激活在完全無Thr172及S108磷酸化的情況下，僅通過變構(gòu)激活便可發(fā)生［18］。這可能意味著Thr172或β1中S108的磷酸化與AMPK活性調(diào)節(jié)無關(guān)，同時表明細(xì)胞及體內(nèi)AMPK的激活與Thr172磷酸化的增加有關(guān)。但并不是AMPK的變構(gòu)激活不重要，在大多數(shù)情況下，AMPK的變構(gòu)激活伴隨著Thr172磷酸化的增加。

2 mTOR

2.1 mTOR mTOR是PI3K相關(guān)激酶（phosphatidy linositol 3-kinase，PIKK）家族中一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，由2 549個氨基酸組成，包括多個功能及調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。mTOR可通過不同相對獨立的結(jié)構(gòu)域招募多個伴侶，形成2個不同的信號復(fù)合物：mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）［19］。mTOR的機制靶點是調(diào)節(jié)自噬的核心樞紐，受不同上游信號通路調(diào)控自噬。mTOR的3條上游信號通路包括PI3K／蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號通路、AMPK信號通路及RAS／Raf／MEK／ERK信號通路［20］。這些通路可通過調(diào)節(jié)mTOR相應(yīng)地抑制或增強自噬水平。因此，調(diào)節(jié)mTOR的不同上游信號通路可能是治療肝損傷的新研究思路。

2.2 mTORC1及mTORC2mTORC1及mTORC2復(fù)合物具有特定的底物偏好，可觸發(fā)不同的下游信號事件來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。mTORC1由3種核心成分（mTOR、Raptor、mLST8）和 2個抑制亞基（PRAS40、Deptor）組成，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及代謝，整合多種刺激及信號網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)新陳代謝［21］。mTORC1可通過直接磷酸化2種關(guān)鍵底物促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，如磷酸化70 000核糖體蛋白S6激酶1（phosp-horylated 70 ribosomal protein S6 kinase 1，p70S6K1）及真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白（4E binding protein，4EBP）。mTORC2由 4種核心成分（mTOR、Rictor、mLST8、mSIN1）和 1 個抑制性亞基 Deptor組成，主要通過磷酸化蛋白激酶A、G及C（AGC）家族的幾個成員來控制細(xì)胞的增殖、存活、離子轉(zhuǎn)運及骨架重塑［22］。如mTORC2可磷酸化蛋白激酶C（PKCα、PKCδ、PKCζ、PKCγ 及 PKCε）以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑及細(xì)胞遷移［19］。此外，mTORC2還可磷酸化并激活血清／糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（serum／glucocorticoid regulated kinase 1，SGK1），調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運及細(xì)胞存活［23］。與mTORC1比較，對mTORC2通路了解較少，僅知其上游激活因子是生長因子／PI3K信號軸。研究表明，PI3K信號可能通過促進(jìn)mTORC2與核糖體的結(jié)合而激活mTORC2，但核糖體結(jié)合如何激活mTORC2的機制還需進(jìn)一步研究［23］。

3 自噬

自噬最初在肝臟實驗中被發(fā)現(xiàn)，為一種降解受損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)聚集的細(xì)胞過程。在基礎(chǔ)條件下，所有細(xì)胞的自噬水平均較低，且可被不同形式的壓力進(jìn)一步誘導(dǎo)，如營養(yǎng)或饑餓、生長因子耗盡、感染及缺氧。該過程使細(xì)胞從各種應(yīng)激狀態(tài)中解放出來，是應(yīng)激刺激下細(xì)胞存活的一種機制［19］。目前已知自噬失調(diào)可引起許多肝病，因此如何正確調(diào)節(jié)自噬是治療肝病的關(guān)鍵。自噬是細(xì)胞降解和代謝自身成分的過程，分為非選擇性自噬及選擇性自噬［18］。非選擇性自噬用于饑餓條件下大量細(xì)胞質(zhì)的周轉(zhuǎn)，而選擇性自噬則專門針對受損或多余的細(xì)胞器，包括受損的線粒體、不需要的過氧化物酶體、多余的核糖體、脂滴及侵入性微生物。同時，自噬為一種溶酶體降解過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞器及蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。作為細(xì)胞管家，自噬在肝臟中的功能主要分兩方面［19］：一方面，自噬通過消除肝臟相關(guān)疾病中引入的受損細(xì)胞器及蛋白質(zhì)避免細(xì)胞損失及死亡；另一方面，在不同的條件下，自噬可促進(jìn)肝臟損傷的進(jìn)一步惡化（如過度自噬可導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡；肝星狀細(xì)胞自噬增加可促進(jìn)其活化，加重肝纖維化）［20］。但自噬在NAFLD中如何進(jìn)行選擇性的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

4 AMPK／mTOR／自噬信號通路

LKB1及CAMKK β等上游激酶作為AMPK的重要激活位點，可通過磷酸化Thr172直接激活A(yù)MPK［24］。激活的AMPK通過兩種互補作用維持能量平衡，即抑制多細(xì)胞生物的多種合成途徑，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及碳水化合物生物合成，同時激活各種分解代謝過程，如葡萄糖代謝及自噬［25］。mTOR為一種營養(yǎng)敏感的激酶［26］，在營養(yǎng)豐富的條件下，mTORC1整合各種刺激及信號，促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂類及核苷酸的合成，同時阻斷代謝分解過程，如抑制自噬，促進(jìn)細(xì)胞生長及增殖［27］，這與AMPK的作用正相反。因此，在能源短缺條件下，mTOR是AMPK的重要下游靶點。此外，AMPK還能維持能量平衡，通過抑制mTOR對自噬的調(diào)節(jié)，從而在治療一些肝臟損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。值得注意的是，自噬不僅是mTOR重要的下游調(diào)控機制，且在AMPK維持能量平衡的過程中也起關(guān)鍵作用。UNC-51樣激酶1（ULK1）是自噬啟動和發(fā)展的重要調(diào)控因子，而mTOR是ULK1的上游負(fù)調(diào)控因子。研究表明，AMPK通過AMPK／mTOR途徑間接激活ULK1的自噬。一方面，AMPK通過激活mTORC1及結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物蛋白2（tuberous sclerosis complex-2，TCS2）的負(fù)調(diào)節(jié)因子抑制mTOR的活性；另一方面，AMPK通過抑制mTORC1的主要亞基Raptor來抑制mTOR的活性［28］。通過以上兩方面的作用，mTOR對ULK1的抑制作用被釋放，最終激活自噬作用。此外，AMPK還可直接激活ULK1或直接磷酸化ATG9、VPS34及Beclin-1等自噬核心成分，促進(jìn)自噬［29］。

5 NAFLD

NAFLD是全球最常見的慢性肝病，與肥胖、高脂血癥及糖尿病密切相關(guān)，NAFLD的社區(qū)患病率從20世紀(jì)80年代小于10%上升至目前15% ～30%［30］。NAFLD患者肝臟組織表現(xiàn)出明顯的脂肪變性、肝臟炎癥甚至肝細(xì)胞壞死，肝臟脂肪變性進(jìn)一步發(fā)展將危及生命，如肝硬化、肝細(xì)胞癌及肝功能衰竭等［18］。NAFLD肝臟組織學(xué)表現(xiàn)為：①當(dāng)脂肪≥5%的實質(zhì)受累時，最初為單純脂肪變性或脂肪肝；②脂肪性肝炎、小葉性炎癥、肝細(xì)胞球囊和／或Mallory-Denk的生成；③脂肪性肝炎合并肝纖維化，一旦膠原沉積在肝實質(zhì)，首先以小葉中心或肝竇周圍發(fā)生，隨后門脈纖維化；④肝硬化（當(dāng)纖維化將肝細(xì)胞包裹并分離成結(jié)節(jié)時）；⑤晚期肝?。ó?dāng)門靜脈高壓和／或肝細(xì)胞癌并發(fā)癥發(fā)生時）［30］。NAFLD還與心血管疾病、代謝綜合征、非肝及肝細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)病率增加有關(guān)，早期對NAFLD患者進(jìn)行分層，并定期跟蹤患者進(jìn)行再分層，對于預(yù)測和管理NAFLD并發(fā)癥具有重要意義。

6 NAFLD與AMPK／mTOR／自噬信號通路

NAFLD治療方案的一個共同特點是激活A(yù)MPK［1］。實際上AMPK的激活與多種代謝改善有關(guān)，可能在介導(dǎo)各種藥物／營養(yǎng)物質(zhì)有益作用方面起至關(guān)重要的作用。在肥胖人群中，脂肪組織AMPK活性的降低與全身胰島素抵抗有關(guān)，表明脂肪組織AMPK活性水平可能與NAFLD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［31］。利拉魯肽（Liraglutide，LRG）及含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白 5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5）可通過誘導(dǎo)自噬來改善肝臟脂肪變性和減少肝臟脂質(zhì)積累［32］。相反，高脂飲食或脂質(zhì)的長期積累可能降低自噬活性［33］。在NAFLD中，脂質(zhì)積累、高胰島素血癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞因子表達(dá)降低被證明會導(dǎo)致肝自噬缺乏［34］。研究表明，脂肪吞噬是自噬參與調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的主要機制，增加AMPK活性被認(rèn)為是改善NAFLD的可行性治療策略之一［18］。有研究提出，在開發(fā)AMPK激活劑治療NAFLD時，重要的是應(yīng)避免中心通路中AMPK的慢性激活，因這種作用可能導(dǎo)致肥胖［35］。SMITH總結(jié)了AMPK在影響NAFLD中3種主要機制［31］：①抑制肝臟新生脂肪生成；②增加肝臟脂肪酸的氧化；③保護(hù)脂肪組織線粒體功能。研究發(fā)現(xiàn)，對乙酰氨基酚的治療劑量可加重NAFLD的脂肪積累，其潛在機制可能與抑制AMPK／mTOR通路進(jìn)而抑制自噬有關(guān)［36］。ZHANG 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，AMPK／mTOR介導(dǎo)的自噬水平在高脂喂養(yǎng)的小鼠及游離脂肪酸處理的LO2細(xì)胞（人正常肝細(xì)胞）中均有明顯抑制作用，當(dāng) Ghrelino-?；D(zhuǎn)移酶（GOAT）被抑制時，AMPK／mTOR介導(dǎo)的自噬水平顯著升高，從而減輕肝臟毒性。據(jù)報道，硫化氫（H2S）對NAFLD有治療作用，其作用機制是通過激活A(yù)MPK／mTOR介導(dǎo)的自噬作用于 AMPK α2［38］。因此，推測激活 AMPK／mTOR介導(dǎo)的自噬是治療NAFLD的一種新興方法。目前已確定了幾種藥物可恢復(fù)NAFLD自噬通量的能力［39-40］。如肝癌發(fā)生尚未開始，這些藥物可能是有希望預(yù)防NALFD相關(guān)肝癌的方法。但這些藥物的臨床應(yīng)用仍有待在大型隊列人類研究中進(jìn)一步驗證。除治療外，最近發(fā)現(xiàn)循環(huán)p62／SQSTM1血清水平可作為自噬標(biāo)記［41］。自噬缺陷與NAFLD相關(guān)的肝癌有因果關(guān)系，可能是通過p62／SQSTM1的積累，誘導(dǎo)且維持致癌的NF-KB活性，并保留受損的線粒體，這些線粒體產(chǎn)生反應(yīng)性氧化物來損傷DNA。該發(fā)現(xiàn)可能為NAFLD的診斷開辟了一條新的途徑。

7 小結(jié)與展望

mTOR調(diào)控的信號通路與人類疾病如癌癥、糖尿病、血管病變及衰老息息相關(guān)。近年來，隨著AMPK／mTOR與自噬在細(xì)胞代謝及疾病發(fā)生發(fā)展中的重視作用，該通路在NAFLD的研究成為熱點。因此，研究該信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)中的作用，對正常生理及疾病很有必要。未來的一個重大挑戰(zhàn)是將基于細(xì)胞動物模型的研究轉(zhuǎn)化為人類生理學(xué)／病理學(xué)研究，盡可能地利用靶向AMPK／mTOR與自噬的強大潛力。