核酸適配體在環(huán)境與食品檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

佟雨珊, 高志賢, 周煥英, 閆宏遠(yuǎn)

(河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 河北保定 071002)

1 前言

核酸適配體是一段DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)序列，通常是利用體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從核酸分子文庫中得到的能夠與轉(zhuǎn)移配體特異性結(jié)合的單鏈寡核苷酸序列〔1-4〕。核酸適配體這一概念最初是由Ellington和Szostak提出的〔1〕，而后Ellington利用SELEX技術(shù)成功篩選出了能夠與汽巴克隆藍(lán)、活性藍(lán)4特異性結(jié)合的RNA，命名為aptamer。 核酸適配體可以由人工合成，與靶物質(zhì)特異性結(jié)合，具有與抗原-抗體反應(yīng)類似的高親和性和高特異性〔5〕，因此又被人們稱為“化學(xué)抗體”。但實(shí)際上核酸適配體在很多性能方面超越了抗體，具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)如可進(jìn)行體外篩選、應(yīng)用范圍廣泛、對靶分子具有極高的分辨率、對實(shí)驗(yàn)具有極高的重復(fù)性、精確性和純度、便于保存等優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為檢測領(lǐng)域的一項(xiàng)新的熱點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物組裝、藥物遞送、信號轉(zhuǎn)換等多個(gè)領(lǐng)域。本文主要就核酸適配體近幾年在環(huán)境和食品檢測方面的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)、探討和展望。

2 核酸適配體在食品安全檢測中的應(yīng)用

食品安全問題一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，是衡量人民生活質(zhì)量、社會發(fā)展水平和國家經(jīng)濟(jì)建設(shè)的一個(gè)重要方面〔6〕。然而日益加劇的食品安全問題也在很大程度上給人們帶來了嚴(yán)重的危害。近年來，世界范圍內(nèi)食品安全事件頻發(fā)，食品安全儼然成為一個(gè)引起全球性關(guān)注的焦點(diǎn)問題。從我國近幾年出現(xiàn)的食品安全抽檢不合格的情況可以看出，我國食品安全問題主要集中于致病菌、重金屬、生物毒素、農(nóng)藥獸藥等幾個(gè)方面。針對食品中有害污染物，發(fā)展簡便快捷、靈敏可靠且高通量的現(xiàn)場快速檢測新技術(shù)是進(jìn)一步加強(qiáng)食品安全工作的重要保障〔7〕。近年來，核酸適配體技術(shù)的快速發(fā)展引來了越來越多的學(xué)者關(guān)注，納米科學(xué)在食品安全檢測領(lǐng)域有著巨大的潛能。

2.1 致病菌的檢測致病性細(xì)菌直接或間接污染食品和水源，人經(jīng)口感染可導(dǎo)致腸道傳染病的發(fā)生及食物中毒以及畜禽傳染病的流行。食源性致病菌是導(dǎo)致食品安全問題的重要來源。常見的是食品致病菌有痢疾桿菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀菌、金黃色葡萄桿菌、致病性鏈球菌等。目前一些傳統(tǒng)的檢測方法多是采用微生物培養(yǎng)、平皿計(jì)數(shù)等，這種方法還需要培養(yǎng)、分離，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測速度慢、效率低。近年來逐漸興起的DNA探針、核酸適配體技術(shù)也加入到食品安全檢測的隊(duì)伍中，這種技術(shù)選擇性高、特異性強(qiáng)，針對不同的致病菌有不同的適配體，結(jié)合電化學(xué)傳感器可實(shí)現(xiàn)快速、簡便、可靠的檢測手段，具有很高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性〔8〕。 2011年Li〔9〕等篩選出大腸桿菌K88毛蛋白的核酸適配體以來，核酸適配體用于大腸桿菌的檢測已成為研究的熱點(diǎn)。Wu〔10〕等人使用了大腸桿菌O157:H7外膜特異性的兩個(gè)不同的適配體。其中一個(gè)適配體用于磁珠富集，另一個(gè)作為該病原體的信號報(bào)告體，用等溫鏈置換擴(kuò)增(SDA)擴(kuò)增，并進(jìn)一步用橫向流動生物傳感器檢測，檢測到O157:H7大腸桿菌低至10個(gè)菌落形成單位(CFU)。不需要提取DNA，減少了處理和更簡單的設(shè)備要求，使該檢測方法成為一種簡單和快速的傳統(tǒng)方法的替代。Zhang〔11〕等基于核酸適配體特異性識別技術(shù)和納米離子增強(qiáng)拉曼信號原理，構(gòu)建了對鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行同時(shí)檢測的拉曼核酸適配體生物傳感器，最低檢測限達(dá)15，35 CFU/ml。

2.2 毒素的檢測毒素是由生物體產(chǎn)生的，極少量就能引起人和動物中毒的一種物質(zhì)。按來源可分為動物毒素、植物毒素、微生物毒素。微生物毒素又分為細(xì)菌毒素、真菌毒素和單細(xì)胞藻類毒素。毒素對食品安全的各個(gè)環(huán)節(jié)危害極大，加強(qiáng)對其檢測很有必要〔12〕。其中真菌毒素最為常見，廣泛分布在農(nóng)作物中，通過食物進(jìn)入人體，引起各種中毒癥狀。 Zhisong Lu〔13〕等人利用核酸適體探針及其互補(bǔ)的ssDNA修飾金納米粒子，構(gòu)建了一個(gè)基于DNA折紙的黃曲霉毒素B1檢測平臺，為DNA折紙技術(shù)在多種小分子檢測中的應(yīng)用開辟了新的視野。Cruz-Aguado〔14〕等篩選出一條針對赭曲霉毒素A的單鏈DNA適配體，用具有很高的特異性，可用來建立多種檢測方法檢測農(nóng)產(chǎn)品中的赭曲霉毒素A。Qian〔15〕等人基于AuNPs在還原劑存在下促進(jìn)AgNPs化學(xué)沉積，結(jié)合DNA適配體的堿基互補(bǔ)原則構(gòu)建了一種雙通道多功能比色檢測技術(shù)，利用雙氧水催化TMB顯色反應(yīng)使其具有更高的吸光度，并用以檢測黃曲霉毒素B1。他的這種方法操作簡單、成本低、省時(shí)省力，在初篩中具有很好的應(yīng)用前景。

2.3 藥物殘留的檢測食品中的藥物殘留包括植物產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留和動物產(chǎn)品中的獸藥殘留，Kim〔16〕等利用DNA適配體固定化金電極芯片，建立了一種用于化學(xué)傳感的電化學(xué)檢測方法。當(dāng)17beta-雌二醇與DNA適配體相互作用時(shí)，結(jié)合的雌二醇干擾了亞鐵氰化物和亞鐵氰化物氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電子流，電流降低。在陰性對照實(shí)驗(yàn)中，由于其他化學(xué)物質(zhì)的存在，電流僅輕微下降。Liu〔17〕小組根據(jù)目標(biāo)分子和分子信標(biāo)競爭結(jié)合核酸適配體的原理，設(shè)計(jì)了一種三螺旋開關(guān)，由兩條帶有特定序列的DNA探針及目標(biāo)物適配體形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)目標(biāo)物啶蟲脒存在時(shí)，結(jié)構(gòu)發(fā)出熒光，當(dāng)啶蟲脒不存在時(shí)，熒光發(fā)生猝滅。該方法證實(shí)檢測線性范圍是100～1200 nmol/L，并成功應(yīng)用到卷心菜樣品中。許景月〔18〕等以核酸適配體作為識別元件、以插入型染料噻唑橙作為信號元件構(gòu)建了一種非標(biāo)記核酸適配體傳感器檢測四環(huán)素。在最優(yōu)反應(yīng)條件下,該核酸適配體傳感器對TET進(jìn)行檢測的線性范圍為0.05-1000 μg/m L,檢出限為0.022 μg/m L。這種非標(biāo)記核酸適配體傳感器對食品中的其他獸藥殘留、乃至其他有害物小分子均具有很好的應(yīng)用前景。

3 核酸適配體在環(huán)境衛(wèi)生檢測中的應(yīng)用

在經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的時(shí)代背景下，環(huán)境污染惡化問題也逐漸顯露出來，當(dāng)我國從農(nóng)業(yè)大國向工業(yè)強(qiáng)國轉(zhuǎn)變的時(shí)候，越來越多的工業(yè)活動對自然界生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生著不可逆的改變，全球變暖、土壤沙化、水資源污染、空氣質(zhì)量下降等都成為世界范圍內(nèi)不可忽視的重要方面。在環(huán)境保護(hù)問題上，我國始終走在世界前列。面對這些近在咫尺的環(huán)境問題，對工業(yè)廢氣、廢水進(jìn)行有效的檢測檢驗(yàn)，保證企業(yè)處理廢水、廢氣達(dá)到國家允許排放的標(biāo)準(zhǔn)顯得尤為重要。

3.1 重金屬檢測在各種環(huán)境污染中，重金屬污染已經(jīng)成為最嚴(yán)重的環(huán)境生態(tài)污染之一，某些有毒重金屬對人體危害極大，同時(shí)又屬于累積性污染物，需要格外地引起重視。DNA適配體技術(shù)在重金屬檢測中有很大的發(fā)展。 Liu〔19〕設(shè)計(jì)了高選擇性識別Pb2+和Hg2+的DNA探針，與凝血酶連接的適配體探針(TBA)5’端和3’端分別標(biāo)記熒光供體羧基熒光素和熒光受體4-〔4-(二甲胺基)苯基偶氮〕苯甲酸，TBA在溶液中保持一個(gè)自由的線狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入靶標(biāo)物Pb2+和Hg2+后構(gòu)相發(fā)生改變，這種構(gòu)相的改變，使兩端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光強(qiáng)度下降，通過這種熒光強(qiáng)度的變化選擇性的檢測Pb2+和Hg2+，檢測最低濃度達(dá)到300 pmol/L和5.0 nmol/L，可用于土壤Pb2+和水中的Hg2+的檢測。 Li〔20〕等發(fā)現(xiàn)不同金屬離子與單標(biāo)記核酸鏈的結(jié)合動力學(xué)存在差異性 ，首次根據(jù)其動力學(xué)特征來區(qū)分不同的金屬離子，將一端標(biāo)記羧基熒光素的核酸鏈作為熒光探針，利用Cr3+的熒光猝滅動力學(xué)特征來檢測湖水中的Cr3+。該方法為核酸適配體在金屬離子的檢測中提供了新的思路。 袁敏〔21〕等設(shè)計(jì)了一種基于核酸適配體的電化學(xué)生物傳感器來檢測Cd2+，由于適配體與Cd2+有特異性結(jié)合能力，當(dāng)鎘離子存在時(shí)與核酸適配體互補(bǔ)鏈競爭結(jié)合適配體，根據(jù)電化學(xué)信號的變化來進(jìn)行檢測。此方法對Cd2+的線性檢測范圍為1.0 nmol/L～10.0 μmol/L，檢出限為65.1 pmol/L，是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測方法，在鎘環(huán)境污染監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 農(nóng)藥殘留檢測隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高度發(fā)展農(nóng)藥廣泛使用，土壤、水環(huán)境中也容易出現(xiàn)殘留的農(nóng)藥污染物，這些經(jīng)過污染的水體不止存在自然界中，也會影響到我們的日常生活。目前核酸適配體的高特異性高靈敏度的分析檢測能力在環(huán)境安全監(jiān)控中發(fā)揮著重要作用。 Bala〔22〕等將有機(jī)磷農(nóng)藥的適配體與納米金連接形成一種光學(xué)傳感器，當(dāng)目標(biāo)殺蟲劑存在時(shí)，適配體構(gòu)象改變，納米金顆粒聚集，溶液顏色發(fā)生改變，不僅肉眼可辨，檢測限可低至0.01 nM，且具有極高的特異性，當(dāng)存在其它干擾物質(zhì)時(shí)也可選擇性的識別磷酸鹽，從而成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。但農(nóng)藥的種類繁多，我們生存的環(huán)境中需要檢測的農(nóng)藥也并不單一，一種物質(zhì)上可能存在好幾種農(nóng)藥，高通量檢測是趨勢也是必然。2020年Liu〔23〕等研究建立了一種基于廣譜適配體的有機(jī)磷農(nóng)藥比色檢測方法可以對不用類型的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行分析檢測，在最優(yōu)條件下，該方法可有效檢測50～1000 ng/ml的異碳磷和100～500 ng/mL的氧樂果。這種廣譜適配體可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留的高通量檢測。

4 展望

目前，科技經(jīng)濟(jì)的巨大發(fā)展為實(shí)現(xiàn)快速靈敏高效的檢測提供的更大的平臺，核酸適配體作為分子探針在檢測領(lǐng)域已經(jīng)取得了一定的成果，其可塑性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此。隨著針對不同分子靶標(biāo)的核酸適配體的出現(xiàn)，更多的基于核酸適配體檢測方法與檢測平臺也將被設(shè)計(jì)出來，也將產(chǎn)生更多高靈敏高特異性的檢測手段。相信隨著科技的不斷發(fā)展和廣大科研工作者的不懈努力，核酸適配體將在食品安全、環(huán)境監(jiān)控、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。