絲素支架應(yīng)用于骨組織工程的研究進(jìn)展

于瀟 馬勇△ 郭楊 潘婭嵐 涂鵬程 過(guò)俊杰

骨組織工程將材料工程與生物學(xué)相結(jié)合，制作三維支架，以模擬天然骨組織的結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到修補(bǔ)替換天然組織的目的。其三大基本要素包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和支架。支架作為組織工程中的核心部分，其材料的選擇及制備工藝一直備受關(guān)注。

研究者引入了多種天然或合成聚合物材料以及不同的加工方法用于支架的開(kāi)發(fā)研究，以重建天然骨基質(zhì)，填補(bǔ)骨缺損。絲素蛋白作為一種天然高分子纖維蛋白，憑借其來(lái)源廣泛、易水解且水解速率易于調(diào)控、良好的生物相容性與低免疫性、易于多種生物活性分子及礦物共混等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

本文對(duì)近年來(lái)絲素支架應(yīng)用于骨組織工程的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，多角度介紹絲素支架性能，重點(diǎn)闡述多種形態(tài)絲素支架在骨組織工程中的應(yīng)用。隨著研究的深入，越來(lái)越多的研究者關(guān)注于支架植入后宿主反應(yīng)，包括局部免疫微環(huán)境的改變及炎癥反應(yīng)。因此，對(duì)近來(lái)提出的支架的免疫微環(huán)境調(diào)控策略加以概括。最后，對(duì)目前研究中仍存在的問(wèn)題提出作者的看法并指出未來(lái)的研究方向。

1 絲素支架性能

支架在種子細(xì)胞遷移、增殖、分化的過(guò)程中，為其提供生物力學(xué)支持，因此支架需要提供與天然骨組織接近的力學(xué)性能、孔徑、孔隙方向、孔隙率和表面化學(xué)性質(zhì)，以促進(jìn)種子細(xì)胞的遷移、增殖以及分化。

1.1 機(jī)械強(qiáng)度

常用于組織工程的脫絲膠絲素具有300～740 MPa的拉伸強(qiáng)度、10～17 GPa的拉伸彈性模量、4%～26%的斷裂應(yīng)變[1]。然而，在蠶絲溶解過(guò)程中使用的溶劑往往容易導(dǎo)致分子間氫鍵的不可逆斷裂，導(dǎo)致人工制造的絲素蛋白無(wú)法達(dá)到天然蠶絲的強(qiáng)度。通過(guò)改變絲素蛋白纖維的構(gòu)象，將絲素由不穩(wěn)定ɑ-helix結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮榉€(wěn)定的β-sheet結(jié)構(gòu)，可以調(diào)節(jié)絲素的機(jī)械強(qiáng)度。例如，提高共混溶液中絲素的含量[2]、在處理絲素溶液的過(guò)程中摻入金屬離子(如Cu2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+等)[3]、使用激素類(lèi)物質(zhì)[4]等措施，均可以改變絲素蛋白纖維的構(gòu)象，誘導(dǎo)β-sheet結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。此外，納米級(jí)HAP等礦物的礦化作用也是提高絲素蛋白機(jī)械性能的有效途徑。

1.2 可降解性與生物相容性

理想支架的降解速率應(yīng)與骨再生速度相協(xié)調(diào)。過(guò)快的降解速率，使得支架不能提供適當(dāng)?shù)奈h(huán)境來(lái)保護(hù)細(xì)胞增殖和分化。過(guò)低的降解速率可能導(dǎo)致支架殘留物變成異物殘留，引起炎癥反應(yīng)，從而阻礙骨缺損部位的修復(fù)。作為一種蛋白質(zhì)，絲素易被蛋白酶XIV、ɑ-糜蛋白酶和膠原酶IA等多種酶降解[5]。其降解速率與絲素Ⅱ(即β-sheet)的比例負(fù)相關(guān)[6]。在處理蠶絲的過(guò)程中使用不同的溶劑可以通過(guò)控制β-sheet的數(shù)量和二級(jí)結(jié)構(gòu)，將生物降解率控制在幾周到12個(gè)月[7]。有機(jī)溶劑處理的支架在體內(nèi)降解需要12個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間，而水處理的支架在體內(nèi)降解時(shí)間則不超過(guò)6個(gè)月[8]。同時(shí)，支架的降解產(chǎn)物不應(yīng)對(duì)人體組織產(chǎn)生不利影響。絲素在降解過(guò)程中釋放的多肽有助于控制炎癥和成骨細(xì)胞產(chǎn)生膠原，此外，丙氨酸和甘氨酸作為組成絲素的主要氨基酸，同時(shí)也是絲素降解的副產(chǎn)物，均可以被用于合成新的蛋白，從而避免了副產(chǎn)物在局部的蓄積[9-10]。在體內(nèi)外的條件下，絲素生物材料所引起的免疫反應(yīng)程度與現(xiàn)下正廣泛使用的醫(yī)用植入物并無(wú)不同，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于外科縫線(xiàn)及敷料中[11]。

1.3 孔徑與孔隙率

在諸多支架性能中，孔徑與孔隙率一直被視作設(shè)計(jì)支架的重要數(shù)據(jù)，對(duì)于細(xì)胞成分、新生血管的形成以及支架本身的降解率都有重要影響。但是，最適的孔徑仍存在爭(zhēng)議，Karageorgiou等則推薦孔徑在300～400 μm，這也是能觀(guān)察到毛細(xì)血管長(zhǎng)成的臨界數(shù)值[12]；也有研究者提出孔徑在150～300 μm之間的支架，和更小孔徑的支架相比有著更好的細(xì)胞黏附[13]。不同孔徑大小的支架對(duì)細(xì)胞分布的影響大于對(duì)細(xì)胞數(shù)量影響。細(xì)胞在較小的孔(200～500 μm)上均勻填充，而在較大的孔(1 000～1 500 μm)的孔壁上密集生長(zhǎng)，導(dǎo)致沿孔壁的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用更緊密，正是這些更緊密的細(xì)胞相互作用增強(qiáng)了成骨反應(yīng)[14]。較大的孔徑引發(fā)成骨，而較小的孔徑則導(dǎo)致血管形成受限和缺氧。局部的缺氧會(huì)增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肉芽組織的形成，并包繞植入體，阻止了進(jìn)一步骨化的發(fā)生。其潛在機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞的極化相關(guān)，孔徑的增大導(dǎo)致了M2表型表達(dá)的上調(diào)和M1表型表達(dá)的下調(diào)[15-16]，其中M1表型巨噬細(xì)胞啟動(dòng)血管生成，而M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管成熟[17]。

2 多種制備工藝生產(chǎn)絲素支架在骨組織工程中的應(yīng)用

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是組織細(xì)胞合成及分泌的結(jié)構(gòu)蛋白、多糖、酶等分子構(gòu)建的局部微環(huán)境，組織細(xì)胞與ECM的雙向交互作用決定了組織細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。原生ECM在誘導(dǎo)良好的免疫環(huán)境，特別是巨噬細(xì)胞極化的同時(shí)誘導(dǎo)組織重塑[18]。原生的ECM和基于原生ECM的支架可以降低異物反應(yīng)并在支架植入后調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抗炎表型[19]。因此，良好的支架需要在體內(nèi)提供與ECM相類(lèi)似的三維結(jié)構(gòu)以及免疫微環(huán)境。為了盡可能的復(fù)制原生ECM的結(jié)構(gòu)，研究人員從支架材料、形態(tài)以及制作工藝等方面進(jìn)行了多種嘗試。

2.1 三維多孔支架

三維多孔支架獨(dú)特的結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞附著、增殖和遷移，并可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)和代謝廢物的運(yùn)輸。常用的制備方法有粒子瀝濾法、冷凍干燥法以及3D打印法等。

粒子瀝濾法將一定的成孔劑溶解于絲素溶液中，隨后的溶劑蒸發(fā)導(dǎo)致在絲素基體中嵌入鹽顆粒。絲素基體在去離子水中浸泡后，支架上的鹽顆粒浸出，形成多孔結(jié)構(gòu)。成孔劑的選擇決定了支架孔徑與孔隙。Zhang等[20]以Na2CO3為成孔劑，用絲素蛋白與羧甲基殼聚糖、鍶取代羥基磷灰石、纖維素納米晶制得3種復(fù)合支架，成孔率分別為90.09%±0.19%、84.28%±2.05%、82.03%±1.45%，其中Sr-Hap/CNCs/SF/CMCs支架表現(xiàn)出最高的OPN和BSP表達(dá)。納米級(jí)礦化物的加入，提高了支架的機(jī)械性能及表面粗糙度，但是會(huì)造成孔徑、孔隙率及溶脹率的下降。Correia等[21]使用不同大小顆粒NaCl作為成孔劑，水溶液和六氟異丙醇(HFIP)作為溶劑，分別制得四種支架，其中400～600 μm的HFIP-SF支架表現(xiàn)出最優(yōu)的成骨能力。但是，有機(jī)溶劑的使用不可避免的增加了免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，降低了支架的生物相容性。

冷凍干燥法通過(guò)冰晶的升華作用在三維支架內(nèi)形成孔隙，可以避免有機(jī)溶劑的使用。Wang等[22]通過(guò)冷凍干燥法制得氧化石墨烯-羥基磷灰石-絲素復(fù)合支架，該支架外層致密含有5～15 μm的微孔，中間層疏松伴有15～30 μm的帶狀孔隙，內(nèi)層呈海綿狀孔隙大小為30～65 μm。和單純HAP-SF支架相比，具有更高的機(jī)械強(qiáng)度和蛋白吸附能力。層狀結(jié)構(gòu)和球狀結(jié)構(gòu)相比，更貼近于板層骨結(jié)構(gòu)，有利于種子細(xì)胞向板層骨分化，帶來(lái)更高的機(jī)械強(qiáng)度。高溫度梯度的快速凍結(jié)有利于納米纖維和定向結(jié)構(gòu)的形成。在-80 ℃下凍結(jié)的SF支架具有由隨機(jī)短通道/孔/納米纖維組成的混合結(jié)構(gòu)，但短通道和孔不相互連接。相比之下，在-20 ℃凍結(jié)的SF支架中只觀(guān)察到?jīng)]有很好地連接成網(wǎng)絡(luò)的隨機(jī)氣孔[23]。Gokila等在-80 ℃下制得具有典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)納米殼聚糖/絲素蛋白/透明質(zhì)酸支架，有著良好的增殖速率和細(xì)胞定植，同時(shí)保留了納米殼聚糖的抑菌效應(yīng)[24]?？咕?yīng)的保留對(duì)絲素支架可以一定程度上避免植入后的感染。

3D打印法通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)設(shè)支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可以極大程度上克服粒子瀝濾法及冷凍干燥法所制支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的隨機(jī)性。近年來(lái)，新興的生物打印技術(shù)通過(guò)CAD技術(shù)來(lái)規(guī)劃種子細(xì)胞的精確位置，然后逐層打印，可以實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞的3D打印。Suntivich等[25]將絲素聚合物逐層組裝成具有典型的“巢”狀結(jié)構(gòu)的支架，細(xì)胞在沒(méi)有損害其完整性的情況下被成功地種植到這些“絲巢”中。使用數(shù)字光處理輔助3D生物打印技術(shù)可以解決噴墨和擠壓打印的部分缺點(diǎn)，例如對(duì)被包封的細(xì)胞施加較大的機(jī)械應(yīng)力或由于打印時(shí)間長(zhǎng)而致細(xì)胞活力的降低[26]。使用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)將SF溶液甲基丙烯酸化可以提高SF基生物油墨的機(jī)械性能及流變性能，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞的多層印刷[27]。這使得具有多種細(xì)胞類(lèi)型的生物組織可以被復(fù)制，特別是涉及軟骨面的骨缺損。

2.2 靜電紡絲支架

在靜電紡絲中，高壓產(chǎn)生的電勢(shì)差使絲素溶液自噴射板中噴出，并在噴射過(guò)程中迅速蒸發(fā)，形成固體纖維。多種營(yíng)銷(xiāo)因素決定了電紡絲素纖維的性能。電紡絲素纖維的直徑隨溶液濃度的增加而增大，當(dāng)絲素濃度低于20%無(wú)法成功紡絲，而高于30%則無(wú)法形成圓形截面纖維[28]。溫度及相對(duì)濕度的升高是造成纖維不均及不良紡絲的重要因素。在30 ℃和25%相對(duì)濕度的條件下，可以制造出最高的抗?jié)B透性和整體上最均勻的純絲蛋白纖維[29]。Kim等[30]通過(guò)電紡絲制備了一種經(jīng)干擾素處理的納米絲素支架，不僅使植入其上的hMSCs有著良好的增殖與遷移，還提高免疫調(diào)節(jié)功能性細(xì)胞因子，IDO和COX2的表達(dá)。Gao等[31]通過(guò)電紡絲制得具有分層結(jié)構(gòu)的礦化納米絲素支架，在保持良好孔徑與孔隙率的同時(shí)將壓縮模量和應(yīng)力分別是提高了32.8和3.0倍，分層結(jié)構(gòu)則顯著增加了細(xì)胞粘附和增殖與間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。通過(guò)電紡絲生產(chǎn)的絲納米纖維通常具有ɑ-helix結(jié)構(gòu)或低穩(wěn)定性的無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象。這些納米纖維墊需要浸入有機(jī)溶劑(例如甲醇)中，以誘導(dǎo)在納米纖維中形成更穩(wěn)定的反平行β-sheet結(jié)構(gòu)。但是，使用有機(jī)溶劑和腐蝕性溶劑可能會(huì)破壞生物分子的結(jié)構(gòu)和生物活性。因此，最好在靜電紡絲前使用更溫和的手段避免使用有機(jī)溶劑以最大限度地減少殘留溶劑的毒性作用。紅外光譜證明，在靜電紡絲前使用簡(jiǎn)單的超聲波處理溶液可以一定程度上調(diào)節(jié)溶液的黏度，在電紡基質(zhì)中誘導(dǎo)水穩(wěn)定性。流變性能測(cè)試表明，超聲處理顯著提高了溶液的黏度，進(jìn)一步提高了電紡纖維的質(zhì)量，改善了干、濕條件下的力學(xué)性能[32]。

3 絲素支架的免疫調(diào)節(jié)手段

骨生物材料的植入后的免疫反應(yīng)對(duì)隨后的成骨和骨整合有著重要影響。絲膠作為蠶絲中含量第二的蛋白質(zhì)，通常被認(rèn)為是引發(fā)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素?？赡芘c絲膠上調(diào)的腫瘤壞死因子-ɑ的表達(dá)有關(guān)[33]，而摻入4-己基間苯二酚(4HR)則可以抑制這一過(guò)程，增強(qiáng)成骨[34]。但是，也有研究員制得摻有不同濃度絲膠的絲素支架，各組之間促炎性標(biāo)志物TNF-ɑ、CXCL10和CD197的基因表達(dá)與無(wú)絲膠組相比并無(wú)明顯差異[35]。亦有部分研究同樣支持絲素絲膠共混，絲膠蛋白引發(fā)的類(lèi)骨羥基磷灰石結(jié)晶形成，或有利于骨形成[36-37]。對(duì)于各研究者得出的不同結(jié)果，可能與處理蠶絲的過(guò)程中脫絲膠過(guò)程及絲膠的制備工藝有關(guān)，因此，絲膠對(duì)免疫反應(yīng)的影響尚需進(jìn)一步研究。

植入物誘導(dǎo)多核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致肉芽腫形成是移植失敗的主要原因。巨噬細(xì)胞是宿主對(duì)生物材料反應(yīng)的第一反應(yīng)者，并且已被證明是下游組織重塑事件的預(yù)測(cè)因子。同時(shí)，具有高度可塑性的巨噬細(xì)胞使得通過(guò)改變支架成分及結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)免疫成為可能。近年來(lái)，多種措施被應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，包括：1)通過(guò)支架表面修飾以改變拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及粗糙度，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞與支架材料之間的相互作用[38]。支架的表面是第一個(gè)與生理環(huán)境和細(xì)胞相互作用的場(chǎng)所，表面粗糙度的增加促進(jìn)了細(xì)胞與蛋白質(zhì)宿主位點(diǎn)的相互作用，對(duì)細(xì)胞附著和密度有著深遠(yuǎn)的影響。有研究員提出理想的骨種植體，表面粗糙度應(yīng)在1～2 μm[39-40]。未經(jīng)處理的絲素蛋白表面粗糙度平均為40 nm，經(jīng)乙烯基磷酸(VPA)浸泡、乙烯基磺酸(VSA)浸泡、臭氧中紫外線(xiàn)照射(UV/O3)處理后，均可使絲素蛋白的表面粗糙度提升，而碳酸氫鈉(NaOH)浸泡、丙烯酸(AAC)浸泡的處理則能減低絲素蛋白的表面粗糙度[41]。有機(jī)化合物的使用在提高絲素表面粗糙度的同時(shí)不可避免的提高了免疫原性，因此需要更溫和的手段實(shí)現(xiàn)表面粗糙度的提升。2)通過(guò)控釋方式摻入生物活性元素來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)[42-44]。摻有鎂離子的材料可上調(diào)巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子，包括TNF-ɑ和IL-6的表達(dá)，而與骨修復(fù)相關(guān)的TGF-β1細(xì)胞因子[45]。Wang等[46]證實(shí)摻入Sr的SrHA/SF納米球比HA/SF納米球有著更高的成骨分化潛能。摻入的金屬離子的支架需嚴(yán)格控制支架的降解及離子的控釋?zhuān)悦庠斐僧愇锍练e。3)摻入生物活性因子如巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑或炎性細(xì)胞因子。Spiller等[47]設(shè)計(jì)了吸附有干擾素-γ(IFNg)及白介素4(IL4)的骨再生支架，以短時(shí)釋放IFNg促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1表型，然后持續(xù)性釋放IL4促進(jìn)M2表型，利用宿主巨噬細(xì)胞的血管生成行為來(lái)實(shí)現(xiàn)支架血管化。4)與免疫調(diào)節(jié)藥物聯(lián)用。與硫酸軟骨素共聯(lián)后的絲素支架降低了IL1-β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[48]，這與文獻(xiàn)中證明的硫酸軟骨素的免疫調(diào)節(jié)及骨整合作用相一致[49]。聯(lián)用免疫調(diào)節(jié)藥物時(shí)，控制藥物的初始突釋至關(guān)重要。通過(guò)改變絲素纖維的直徑和厚度，可調(diào)節(jié)藥物的釋放動(dòng)力學(xué)。

4 展望

骨組織工程致力于開(kāi)發(fā)一種與骨組織微環(huán)境相似的骨植入物，旨在通過(guò)結(jié)合骨祖細(xì)胞和生長(zhǎng)因子募集細(xì)胞進(jìn)入由各種生物材料制成的支架中來(lái)促進(jìn)骨修復(fù)和再生。這些生物材料提供必要的機(jī)械支持，具有足夠的血管化能力，以允許獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)支持，并盡可能少的引起免疫反應(yīng)。有研究員提出了骨免疫調(diào)節(jié)能力(Osteoimmunomodulation，OIM)的概念，即誘導(dǎo)良好免疫反應(yīng)的能力，并將其作為生物材料篩選的標(biāo)準(zhǔn)[50]。但是，關(guān)于絲素支架不同特征引起的不同免疫反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制尚缺乏研究。同時(shí)，對(duì)于不同的免疫細(xì)胞和干細(xì)胞的相互作用和分子機(jī)制的研究目前大多集中于巨噬細(xì)胞，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞仍需在體內(nèi)外進(jìn)一步深入研究，為通過(guò)支架在體內(nèi)更好地調(diào)節(jié)這些細(xì)胞提供理論依據(jù)。另一方面，在絲素支架制備過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑及各種改性劑會(huì)顯著提高支架的免疫原性。開(kāi)發(fā)新型可以完全蒸發(fā)或洗掉的改性劑，抑或開(kāi)發(fā)新型純絲素蛋白纖維支架是解決該問(wèn)題的不錯(cuò)選擇。此外，外源生物活性成分的應(yīng)用，導(dǎo)致了一些尚未解決的關(guān)鍵問(wèn)題，如無(wú)法控制的再生和潛在的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，限制了絲素支架的應(yīng)用。因此，在應(yīng)用于人體之前，尚需要開(kāi)發(fā)更為安全的生長(zhǎng)因子?？傊?，對(duì)于骨組織工程支架的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮成骨能力、免疫調(diào)節(jié)能力及安全性等多方面因素，以實(shí)現(xiàn)良好的組織修復(fù)。