慢性脊髓損傷動物模型的研究進(jìn)展

李瑋農(nóng)，趙繼榮，鄧強，朱換平，陳文，陳祁青，趙寧，朱寶，楊濤，張立存

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

慢性脊髓損傷(chronic spinal cord injury，CSCI)是由于椎間盤突出、骨贅形成、后縱韌帶骨化、黃韌帶肥厚、脊柱畸形、腫瘤等多種原因?qū)е伦倒芗吧窠?jīng)根管容積減小，漸進(jìn)性壓迫脊髓及其附屬結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段出現(xiàn)各種感覺和運動異常、括約肌功能障礙、肌張力異常及病理反射等相應(yīng)改變的一種損傷。CSCI的病理過程廣泛存在于脊髓型頸椎病、后縱韌帶骨化和椎管狹窄等多種疾病的病程中[1]。CSCI早期起病隱匿，癥狀不典型，容易被忽視；在疾病后期，隨著脊髓長期受壓，可造成脊髓功能不可逆性損傷，致殘率較高。雖然醫(yī)學(xué)界很早就開始關(guān)注并研究CSCI，但由于難以復(fù)制出與人類CSCI病理進(jìn)程相似的動物模型，限制了人們對該病的認(rèn)識和診療水平。本文從CSCI模型動物選擇和CSCI動物模型構(gòu)建2個方面對CSCI動物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 CSCI模型動物選擇

建立理想的動物模型是開展CSCI相關(guān)研究的前提條件，而選擇的實驗動物尤為重要。理想的CSCI實驗動物應(yīng)具備以下特點：①發(fā)病過程及組織病理學(xué)變化與人類相似；②實驗操作方便；③耐受損傷的能力強。

目前在CSCI的相關(guān)基礎(chǔ)研究中常選用中小型動物，如兔、大鼠及小鼠等[1-3]。兔的神經(jīng)系統(tǒng)較發(fā)達(dá)，價格相對便宜，容易獲得，且耐受損傷能力強，是目前應(yīng)用較多的CSCI模型動物，被很多研究者應(yīng)用于CSCI的實驗研究中[4-5]。大鼠來源充足，價格較低，容易喂養(yǎng)和護(hù)理，而且解剖操作方便、對疾病抵抗力強，其中應(yīng)用較多的是Sprague-Dawley大鼠和Wistar大鼠[6]。但大鼠的椎管周徑小、脊髓較細(xì)，實驗操作中容易誤傷脊髓。小鼠與人類有著較高的基因同源性，加之損傷后的行為學(xué)評估方法較為成熟，尤其是小鼠具有獨特的轉(zhuǎn)基因優(yōu)勢，使其更適用于基因干預(yù)的實驗研究。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們培養(yǎng)出了一種隨著年齡增長出現(xiàn)頸椎椎體鈣化沉積物增多的小鼠——Twy(tiptoe-walking Yoshimura)小鼠，被認(rèn)為是目前僅有的無創(chuàng)慢性進(jìn)行性動物脊髓壓迫模型動物[7]。但小鼠體形小，脊髓較大鼠更細(xì)，不利于實驗操作。

從方便實驗操作及獲得實驗結(jié)果的角度來講，羊、豬、犬等大型動物不失為更好的選擇。它們的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、組織器官構(gòu)造以及損傷后的癥狀都與人類有著很高的相似性，在脊髓損傷機制研究以及后期藥物應(yīng)用的評估方面都是很好的選擇[8]。但這些動物對飼養(yǎng)環(huán)境要求高、價格較貴，很難普遍應(yīng)用于實驗室CSCI研究的初期試驗。而與人類在解剖結(jié)構(gòu)、生理病理和代謝機能方面最為相似的靈長類動物，因較為稀少、價格昂貴且涉及道德倫理等原因，在研究中也未能普遍應(yīng)用[9]。

2 CSCI動物模型構(gòu)建

雖然研究者們都在盡量探索與人類CSCI病理進(jìn)程相似、易于推廣的標(biāo)準(zhǔn)化CSCI動物模型構(gòu)建方法，但目前還沒有任何一種模型能完全模擬出人類CSCI的病理進(jìn)程。理想的CSCI動物模型應(yīng)具備以下特點：①臨床相似性。動物模型的病理進(jìn)程與CSCI相似，能反映脊髓受損后的病理變化和運動行為改變情況。②可調(diào)控性。能根據(jù)實驗需要，準(zhǔn)確調(diào)節(jié)損傷的進(jìn)程和強度，達(dá)到慢性、漸進(jìn)性損傷的要求。③可復(fù)制性。動物模型的制作技術(shù)和設(shè)備要求適中、動物死亡率低、實驗可重復(fù)性好，從而可以快速大批量制作。

目前國內(nèi)外較為成熟的CSCI動物模型有球囊壓迫模型、螺釘壓迫模型、骨?；刂舱T導(dǎo)骨贅壓迫模型、硅膠片壓迫模型、腫瘤壓迫模型、可膨脹材料壓迫模型、Twy小鼠模型等[10-12]。

2.1 球囊壓迫模型球囊壓迫法可調(diào)控性較強，被廣泛應(yīng)用于脊髓損傷的實驗研究中。Tralov等[13]于1953年用犬建立了最早的可充氣式球囊壓迫模型，他們通過手術(shù)將球囊植入實驗動物椎管內(nèi)，待麻醉恢復(fù)后，通過擰緊螺釘使硬脊膜外氣囊充氣壓迫脊髓，形成血流供給障礙，造成脊髓組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致脊髓組織變性壞死。這種模型中脊髓損傷的程度主要取決于球囊提供的壓力大小和脊髓受壓時間的長短。由于氣囊膨脹時囊內(nèi)壓力并非呈線性增加，且反復(fù)充氣對脊髓的反復(fù)刺激容易造成急性及亞急性損傷，難以完全模擬CSCI的病理進(jìn)程。楊詩球等[14]對這一模型進(jìn)行了改進(jìn)，他們自大鼠胸椎椎弓根處向椎管內(nèi)鉆一小圓孔，通過圓孔將1個水囊放置在硬脊膜囊外，用骨臘封閉圓孔后向水囊內(nèi)注入不同劑量的泛影葡胺使水囊膨脹壓迫脊髓。但這種改進(jìn)后的水囊壓迫模型也未能解決球囊膨脹時非線性壓迫的弊端，只是通過注入不同劑量的液體控制了椎管狹窄的程度。

2.2 螺釘壓迫模型Hukuda等[15]于1972年選擇犬作為模型動物，通過頸前路手術(shù)將螺釘置于犬頸椎椎體中，并在體外留一旋轉(zhuǎn)柄，通過旋轉(zhuǎn)柄緩慢將螺釘推進(jìn)到椎管內(nèi)，以造成頸脊髓慢性壓迫。這種造模方式能較好地控制脊髓損傷的進(jìn)程和強度，被廣泛應(yīng)用于脊髓損傷的動物實驗中。但這種直接的螺釘壓迫常導(dǎo)致脊髓直接性損傷，易造成實驗動物癱瘓及死亡，且金屬螺釘在MRI檢查時會出現(xiàn)偽影，不利于實驗效果的評價。為解決這一問題，Xu等[16]將特殊設(shè)計的固定裝置固定在大鼠T7～T9脊椎上，自T8椎板開窗放置1塊塑料板，通過旋轉(zhuǎn)螺釘推擠塑料板對脊髓進(jìn)行緩慢間接的壓迫，持續(xù)6周，期間每周通過影像學(xué)檢查對壓縮裝置的放置位置和脊髓的受壓程度進(jìn)行觀察，并計算大鼠的運動感覺缺陷指數(shù)，6周后收集受壓的T7～T9脊髓進(jìn)行組織學(xué)檢查。這種改進(jìn)后的裝置通過對脊髓的漸進(jìn)性壓迫，成功誘發(fā)了大鼠運動和感覺功能紊亂。該模型通過在硬脊膜外使用塑料板，避免了螺釘直接損傷脊髓，可以較好地控制壓迫程度，形成CSCI。這種造模方式的弊端在于塑料墊片在X線檢查時不顯影，擰入螺釘過程中不易評價螺釘、墊片與脊髓之間的位置關(guān)系。趙鵬等[17]也采用與Xu等[16]相似的裝置進(jìn)行CSCI造模，但將塑料墊片改為鋼板，證實了該裝置及所制作的動物模型的穩(wěn)定性和可靠性。如何消除或減少急性損傷導(dǎo)致的動物癱瘓和死亡，是應(yīng)用此類方法造模的關(guān)鍵[18]。

2.3 骨粒回植誘導(dǎo)骨贅壓迫模型周磊等[19]切除大鼠L5棘突，切除部分椎板形成3 mm×15 mm的缺損，將切取的骨塊制成直徑0.5 mm的碎骨粒，回植于切取骨塊處(實驗組)，對照組僅切除L5棘突及同體積椎板；術(shù)后實驗組大鼠下肢運動功能評分較術(shù)前減小，術(shù)后16周時實驗組大鼠出現(xiàn)明顯的間歇性跛行；病理檢查發(fā)現(xiàn)，術(shù)后10周時實驗組大鼠出現(xiàn)明顯椎管狹窄，瘢痕組織與硬脊膜囊粘連明顯，再生椎板基本形成；影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1周時實驗組大鼠L5椎管橫截面積較對照組減小16.1%。由于碎骨粒誘導(dǎo)椎板再生而導(dǎo)致椎管狹窄的過程是慢性進(jìn)行性的，所以不會對脊髓造成急性壓迫和損害，是對CSCI病理進(jìn)程的良好模擬，理論上是一種既簡單又理想的造模方法。陳振南等[20]在新西蘭兔L5左側(cè)椎板開窗，將碎骨粒鑲嵌于醫(yī)用膠原蛋白海綿上，放置于椎板開窗處，也成功復(fù)制了CSCI模型。這種造模方式的優(yōu)點在于：①造模后隨著瘢痕組織形成，瘢痕組織與硬脊膜囊粘連，可對脊髓組織形成自外向內(nèi)的慢性壓迫，能很好地模擬CSCI的病理進(jìn)程；②操作簡便安全，動物成活率高；③模型制作周期短，一般12～16周即可完成。其缺點包括：①大鼠、小鼠等小型動物的椎板較小，實驗操作難度大，實際中多選用大中型動物，導(dǎo)致實驗成本增加；②椎板開窗后將自體骨植入到較小的手術(shù)操作區(qū)域，由于椎板有一定的再生能力，能很快重新形成硬脊膜后方的骨性屏障，有可能達(dá)不到對脊髓組織的持續(xù)壓迫。

2.4 硅膠片壓迫模型1999年Yamaguchi 等[21]通過在大鼠椎管內(nèi)放置硅膠片成功制作了CSCI模型，組織學(xué)檢查顯示整個實驗過程中大鼠脊髓組織軸突持續(xù)變性和再生。國內(nèi)學(xué)者劉學(xué)勇等[22]將特制的硅膠片分別插入大鼠L4和L6椎管，造成橫截面積各縮小30%的雙節(jié)段椎管狹窄，制成雙節(jié)段CSCI模型；并進(jìn)行高頻率刺激和追加壓迫，觀察不同刺激條件和壓力下受壓馬尾神經(jīng)的復(fù)合動作電位和復(fù)合感覺神經(jīng)動作電位的變化情況，發(fā)現(xiàn)動態(tài)負(fù)荷使受壓的馬尾神經(jīng)動作電位發(fā)生一過性降低。代鳳雷等[23]通過手術(shù)將自制的硅膠片放置于大鼠L4、L5椎板下，術(shù)后大鼠的平板運動距離較造模前明顯減小，CT檢查顯示實驗部位椎管內(nèi)密度值較正常椎管內(nèi)密度值明顯升高；進(jìn)一步的三維有限元建模結(jié)果顯示大鼠椎管內(nèi)徑較正常大鼠明顯狹窄；解剖后發(fā)現(xiàn)大鼠受壓節(jié)段的馬尾神經(jīng)受壓達(dá)50%～70%。硅膠片壓迫造模的優(yōu)點是：①硅膠植入造成的CSCI病理過程與人體椎管狹窄導(dǎo)致的CSCI病理過程相似，均屬于致壓物壓迫脊髓及其附屬結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應(yīng)癥狀；②所采用的醫(yī)用硅膠具有較好的組織相容性，免疫反應(yīng)小，且價格較低；③實驗者可以選擇不同規(guī)格的硅膠片植入椎管的不同部位，造成相應(yīng)部位脊髓損傷。但這種造模方式在實際操作中很難掌握脊髓壓迫的程度，存在造成急性、亞急性脊髓損傷的可能?？傮w來說，該模型符合目前學(xué)術(shù)界對于CSCI病理進(jìn)程的認(rèn)識。

2.5 腫瘤壓迫模型腫瘤壓迫模型是通過各種途徑將腫瘤組織植入到動物硬脊膜外，借助腫瘤組織在硬脊膜外腔的緩慢浸潤生長，逐漸對脊髓組織產(chǎn)生壓迫的一種模型。Fu等[24]將腫瘤組織種植于大鼠T9節(jié)段的硬脊膜外間隙，實驗動物在術(shù)后18.8 d(平均)時出現(xiàn)了神經(jīng)損害表現(xiàn)。2013年，Sarabia-Estrada等[25]在一項觀察前列腺癌轉(zhuǎn)移至脊柱的試驗中，將人前列腺腫瘤細(xì)胞PC3通過注射方式植入到雄性無胸腺大鼠(5周齡)的L5椎體，使用視頻監(jiān)控觀察動物步態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在植入腫瘤組織后第20天(平均)大鼠出現(xiàn)明顯的步態(tài)障礙體征(拖曳尾巴，后肢肢體不協(xié)調(diào)等)，第22天處死大鼠解剖后觀察到大鼠椎體及周圍組織均顯示出腫瘤浸潤生長的跡象并壓迫脊髓組織，病理檢查發(fā)現(xiàn)其脊髓周圍腫瘤組織與植入的前列腺癌腫瘤組織一致。這種造模方法的局限性在于：①可用于實驗的腫瘤組織來源困難，取材、制備和保存要求高，目前應(yīng)用較多的有肝癌組織、前列腺癌組織和乳腺癌組織；②腫瘤組織的植入方式和位置無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且生長浸潤方向無法人為控制，對脊髓組織形成壓迫的程度也不一致，實驗結(jié)果的可控性和實驗的可重復(fù)性較差；③腫瘤細(xì)胞在動物體內(nèi)生長機制復(fù)雜，易造成重要臟器損傷，影響動物壽命，導(dǎo)致樣本丟失嚴(yán)重；④腫瘤組織生長速度快，容易對脊髓形成急性及亞急性損傷。由于存在這些問題，目前在CSCI實驗研究中，該模型已很少被應(yīng)用。

2.6 可膨脹材料壓迫模型1989年，Arbit等[26]首次將一種遇水可膨脹材料(甲基纖維素-聚丙烯腈)植入動物硬脊膜外，制成CSCI模型。此后，這種造模方式在脊髓損傷的實驗研究中多有應(yīng)用。2013年，Long等[27]將一塊吸水后可膨脹聚氨酯薄板(規(guī)格為1 mm×3 mm×1 mm，能在2 h內(nèi)吸收椎管內(nèi)液體，使體積增大為原來的7倍)植入大鼠C6椎板和硬脊膜之間，利用其在硬脊膜外吸水后的膨脹力對脊髓形成直接壓迫。由于材料膨脹速度過快，容易造成脊髓組織急性或亞急性損傷，該模型不完全符合CSCI慢性壓迫的損傷機制。2016年，李金軒[28]采用醫(yī)用甲基乙烯基硅橡膠進(jìn)行CSCI造模，這種材料的吸水成分為交聯(lián)聚乙烯基毗咯烷酮水凝膠，這種材料在吸水性和保水性方面具有較強的穩(wěn)定性，吸水后體積近似均勻增長，7 d后體積增大為原來的2.92倍；實驗中他們將規(guī)格為3 mm×1.5 mm×1.2 mm的壓迫材料放置在大鼠C6～C7硬脊膜外，術(shù)后觀察大鼠脊髓慢性受壓后的病理變化，證實了應(yīng)用吸水性和保水性方面更穩(wěn)定的材料能更好地模擬CSCI慢性漸進(jìn)性的損傷特點?？膳蛎洸牧蠅浩饶Ｐ偷膬?yōu)點是：①手術(shù)操作簡單，一次手術(shù)就可完成造模操作；②感染率較低，動物成活率較高，樣本量丟失較少；③材料膨脹時可形成對脊髓的均勻壓迫，較為符合CSCI的病理特征。不同材料內(nèi)植物遇水膨脹的速度以及持續(xù)時間差別較大，而且難以人為控制，因此這種造模方法也容易形成急性或亞急性脊髓損傷，影響實驗效果。相信隨著材料工藝和技術(shù)的不斷進(jìn)步，這種造模方式將會成為理想的CSCI造模方法。

2.7 Twy小鼠模型1981年，Hosoda等[29]培育出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，這種小鼠與異質(zhì)結(jié)合體的同胞小鼠產(chǎn)生的后代具有常染色體隱性遺傳病，隨著年齡增長，會在其頸椎后出現(xiàn)鈣化物沉積，逐漸造成頸脊髓壓迫，因其特征性的踮腳爬行方式，故被命名為Twy小鼠。Yato等[30]利用Twy小鼠證實了中度慢性脊髓壓迫(20%<占位率<30%)并不會引起脊髓組織結(jié)構(gòu)性改變，而是導(dǎo)致脊髓運動神經(jīng)元功能改變。Song等[31]利用Twy小鼠研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶2信號通路參與慢性壓迫性頸脊髓損傷的炎癥反應(yīng)，抑制絲裂原活化蛋白激酶2能減輕頸脊髓炎癥反應(yīng)，從而抑制頸脊髓細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)功能障礙得到顯著改善。Twy小鼠模型目前被廣泛應(yīng)用于CSCI的實驗研究中，但該模型存在壓迫過程中不能控制壓迫程度，且無法重復(fù)實驗結(jié)果的弊端。

3 小 結(jié)

在CSCI模型動物的選擇上，大鼠因具有容易獲取、生長周期短、抗感染能力強等優(yōu)點，成為眾多CSCI造模方式中首選的模型動物。球囊壓迫模型、螺釘壓迫模型、骨粒回植誘導(dǎo)骨贅壓迫模型、硅膠片壓迫模型、腫瘤壓迫模型、可膨脹材料壓迫模型及Twy小鼠模型等均為目前國內(nèi)外較為成熟的CSCI動物模型，但尚無一種模型被學(xué)界公認(rèn)。CSCI的發(fā)病原因多樣、機制復(fù)雜，根據(jù)不同的發(fā)病原因所建立的模型，其病程進(jìn)展不盡相同，而采用不同的動物、造模機制所建立的模型又有其各自的特點，所以在選擇CSCI動物模型時，應(yīng)根據(jù)實驗需要，選擇與之相適應(yīng)的CSCI實驗動物和造模方式。建立一種具有高度可重復(fù)性和穩(wěn)定性，能客觀、準(zhǔn)確、定量模擬出與人類CSCI病理進(jìn)程類似的動物模型還有一定困難，還需在前期研究的基礎(chǔ)上不斷完善。