血脊髓屏障模型的制作技術與方法研究進展

敖麗 周逸敏，2 張俐△

血脊髓屏障是存在于血液和脊髓之間中樞神經(jīng)系統(tǒng)所特有的屏障結構，由無孔毛細血管內皮細胞、基底細胞、周細胞、以及星形膠質細胞和緊密連接蛋白構成[1-2]。當脊髓受到損傷時，血脊髓屏障也可能隨之受損。血脊髓屏障被破壞會造成脊髓組織水腫、缺血缺氧和血漿內的各種分子無選擇性的進入脊髓實質，造成嚴重的繼發(fā)性脊髓損傷，導致患者生活自理能力下降甚至喪失[3]。因此，盡早修復血脊髓屏障，改善脊髓微環(huán)境，是防治繼發(fā)性脊髓損傷的關鍵。目前對于血脊髓屏障的研究主要是通過建立脊髓損傷模型或血脊髓屏障體外細胞模型，探討血脊髓屏障的作用機制，從而找到相應的治療對策。本研究通過查閱近年相關文獻，整理分析常見血脊髓屏障模型的制作技術、使用方法及優(yōu)缺點，擬為血脊髓屏障模型及脊髓損傷的相關研究提供參考。

1 急性鉗夾型脊髓損傷模型

急性鉗夾型脊髓損傷模型是一種通過使用外界器械對脊髓進行壓迫導致?lián)p傷的模型。其主要制作方法是先切除動物脊髓周邊椎板，使脊髓完全暴露，然后使用動脈瘤夾或者微血管夾施加一定的壓迫力壓迫脊髓，并壓迫一定時間，待脊髓造成損傷后即模型建立成功[4]，此模型可通過調節(jié)鉗夾部位、改變鉗夾力度以及持續(xù)時間造成不同程度的損傷，以模擬臨床上脊髓不同的受壓因素。

鉗夾部位的選擇除了損傷節(jié)段不同外，主要有腹背側鉗夾和側方鉗夾(垂直于脊髓方向夾閉脊髓)，腹背側鉗夾是指將動脈夾的兩端分別置于脊髓腹側和背側，使脊髓前后側形成一定的壓力，從而造成鉗夾損傷，魏衛(wèi)兵等[5]分別以大鼠脊髓的T8～T12節(jié)段為損傷中心，充分剝離并修整兩側椎板，使硬脊膜清晰暴露，用微血管夾鈍性端穿過硬脊膜與前方椎體之間，確保其完全穿過并能完全夾閉脊髓時，釋放微血管夾，鉗夾持續(xù)20 s后釋放，可見脊髓上有明顯血腫痕跡，通過下肢功能評分以及爬網(wǎng)格試驗證實該法成功構建了不同程度的脊髓損傷模型，并發(fā)現(xiàn)T10節(jié)段的脊髓損傷模型是最佳選擇。秦慧慧等[6]以T11脊髓節(jié)段為中心，行椎板切除術暴露脊髓，采用改良動脈夾并垂直于脊髓T11處兩側放置，瞬間釋放動脈夾，持續(xù)30 s后取下，可見鉗夾處明顯充血、水腫，且下肢出現(xiàn)標志性的痙攣及顫動。夾閉時間的不同，亦會導致不同程度的脊髓損傷。此外，不少研究者也會采用不同鉗夾力度進行實驗，如Führmann等[7]利用一種改良版動脈瘤夾用21 g的力鉗夾住脊髓表面1 min，使其造成脊髓損傷，用來研究神經(jīng)上皮細胞與硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合治療對脊髓損傷后的組織再生效果。Soubeyrand等[8]采用動脈瘤夾施加35 g的力度去鉗夾脊髓表面60 s以構建大鼠脊髓損傷模型，用于研究脊髓損傷后的出血情況。不同研究者對于鉗夾時間和力度的選擇可能不相一致[9-11]，缺乏統(tǒng)一的標準，徐偉龍等[12]通過整合并分析比較了國內外有關鉗夾法創(chuàng)建急性鉗夾型脊髓損傷大鼠模型的文章，總結出急性鉗夾型脊髓損傷最佳模型——用30 g動脈瘤夾急性壓迫脊髓60 s作為創(chuàng)建急性鉗夾型脊髓損傷動物模型的造模方式。

急性鉗夾型脊髓損傷模型優(yōu)點是能較好模擬臨床脊髓損傷后癥狀，比如椎體脫位、椎體移位、椎管內出血等病變造成的擠壓型脊髓損傷，且該模型穩(wěn)定，易復制，可控性高，其試驗指標亦相對穩(wěn)定，適用于脊髓損傷的基礎研究[13]。但其作用力的大小一般不易掌握，包括擠壓瞬時準確施加的力以及和硬脊膜接觸瞬間的速度都無法測定，未知數(shù)較高，且腹背側鉗夾法因切除過多椎體骨質，易損傷硬脊膜側壁靜脈，導致出血過多，大鼠死亡率升高[13-14]。

2 體外血脊髓屏障模型

體外血脊髓屏障模型是一種將脊髓細胞與混合膠質細胞在體外培養(yǎng)建立的模型，該模型是一種新型的血脊髓屏障模型，目前常用于研究血脊髓屏障通透性及改善脊髓微環(huán)境等相關課題[15]。其主要的制作方法是將混合的膠質細胞與來自原代大鼠的脊髓微血管內皮細胞共同培養(yǎng)，當細胞融合度達到95%后進行消化，重懸后取1 mL密度為5×104個/mL的混合培養(yǎng)細胞接種在12孔板的Transwell下室，作為滋養(yǎng)層；接著取200 μL的脊髓微血管內皮細胞接種到上室，建立起一個為上下雙層細胞的共培養(yǎng)體系。貼壁之后需要每2 d換1次液。常規(guī)培養(yǎng)大概7 d后，Transwell嵌套內的脊髓微血管內皮細胞便可以形成內皮細胞屏障樣組織，可以模擬出BSCB組成細胞之間的相互作用，即成功構建體外BSCB模型[17-18]。

目前構建血脊髓屏障的體外模型主要有兩種，一種是體外血脊髓屏障模型，另一種是體外血脊髓屏障缺氧模型。第二種模型是在第一種模型基礎上利用一些化學試劑或者特殊處理建造的，但是兩種模型幾乎都是同時出現(xiàn)在一個實驗中作為對照。李在旺等[16-17]通過建立體外血脊髓屏障缺氧模型(利用二氧化碳先缺氧再復氧的方法)來研究表皮生長因子受體抑制劑對氧糖剝奪/復氧誘導的血脊髓屏障損傷的保護作用。曹陽等[18-19]運用在體外血脊髓屏障模型的基礎上添加氯化鈷構建體外血脊髓屏障缺氧模型的方法，研究MicoRNA-125a-5p在缺氧損傷后，核HO-1調節(jié)血脊髓屏障通透性中的作用。孫瑞等[20]利用體外血脊髓屏障模型進行低氧處理后，研究miR-429對體外血脊髓屏障通透性的影響。

體外血脊髓屏障模型優(yōu)點主要在于：1)可以較好的模擬血脊髓屏障的組成結構，與人體血脊髓屏障高度相似；2)不必使用動物，減少動物自身個體差異以及種屬差異帶來的實驗誤差；3)減少實驗動物的使用能節(jié)約實驗成本，縮短實驗周期。但是也有一些缺點：1)在分離培養(yǎng)出穩(wěn)定的脊髓血管內皮細胞之前，造模時需要用腦血管內皮細胞代替脊髓血管內皮細胞；2)雖然雙細胞共同培養(yǎng)(內皮細胞和膠質細胞)在解剖學上接近體內情況，但理論上將內皮細胞、星形膠質細胞以及周細胞共同培養(yǎng)建立的模型，才更加符合體內的血脊髓屏障結構[21-22]；3)做低氧或者缺氧處理時使用的化學物質多半對人體有傷害(例如氯化鈷屬于有毒物質)，使用時務必多加小心；4)由于體外細胞模型和體內血脊髓屏障微環(huán)境的差異，在研究血脊髓屏障實際轉運機制方面可能存在缺陷，需要研究者綜合考慮。

3 脊髓損傷動物打擊模型

墜落打擊法是脊髓損傷中使用度較高的造模方法，是一種利用器械對暴露脊髓進行墜落打擊從而造成脊髓損傷而構建的模型，諸多學者都是使用該模型進行脊髓損傷及血脊髓屏障的研究。目前主要的制作技術和方法是提前術區(qū)備皮，先使用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)采取腹腔注射方式麻醉SD大鼠后，碘伏消毒術區(qū)并用手術刀在脊髓正中位置逐層切開皮膚，鈍性分離肌肉組織后用椎板撐開器將T8～T10節(jié)段椎板充分暴露在外，接著將該椎板剔除，在脊髓組織充分暴露后，使用脊髓打擊器將一定重量的砝碼從一定的高度自由落體在以T8～T10節(jié)段的范圍。當出現(xiàn)打擊過程脊膜保持完整、T10節(jié)段脊髓血管水腫充血、雙下肢出現(xiàn)痙攣性抽搐以及尾部出現(xiàn)擺動的結果時，表示造模成功[23-26]。

脊髓損傷動物打擊模型應用廣泛，但是根據(jù)具體實驗所需要的數(shù)據(jù)會有不同的打擊方法、力度或高度。彭程等[25]通過改良版Allen’s打擊法用10號克氏針在3 cm高處自由落體擊中T10節(jié)段脊髓，以此模型研究miR-126對大鼠急性脊髓血管損傷的作用機制。范筱等[27]對大鼠T9～T11椎板完全剝離，暴露脊髓后，采用MASCIS脊髓打擊器對T10節(jié)段(參數(shù)設置為高12.5 mm，質量10 g)進行打擊，以此探討小膠質細胞P2X7受體在NLRP3炎性體依賴性炎癥中調節(jié)脊髓損傷后神經(jīng)炎癥的機制。張謝等[28]在打擊器平臺上用1.5 N的打擊力度撞擊T9節(jié)段建立模型，以研究bFGF對大鼠血脊髓屏障損傷修復的促進作用。

此模型的優(yōu)點主要在于：1)所需器材簡單易得，方法簡便；2)廣泛應用于脊髓損傷研究中；3)判斷造模成功與否的條件可靠簡略。缺點：1)需有較好的手術操作經(jīng)驗與技術；2)對無菌環(huán)境的要求偏高，容易引起術后感染，注意防止泌尿道感染、腸梗阻、褥瘡等并發(fā)癥[26]；3)打擊的力度不好掌握，操作不當可能給大鼠造成二次打擊，可能需要多次預試驗才能確定自己實驗時所需的最終要求。

4 大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型

大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型是近年來研究血脊髓屏障的較為推崇的模型，是一種借助外力先將大鼠脊髓血管夾閉致其缺血，再進行灌注的損傷模型。其主要的制作方法與技術為先即根據(jù)大鼠的體格使用10%的水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射麻醉，再將大鼠胸腹部備皮、碘伏消毒，用靜脈留置針沿著右側股靜脈穿刺置管固定并采取右側臥位，沿著右側肋緣逐層分離暴露出其腎臟和腸管，并將周圍組織推移至左側，使腹主動脈被分離暴露出。用無創(chuàng)血管夾夾閉腎動脈分支上的腹主動脈，讓其缺血30 min后取出血管夾恢復血流，最后逐層關閉腹腔[30]。

此模型在臨床研究應用時，通常還需加入預處理或者后處理，為的是保證實驗動物的存活以及保證實驗能完整進行。張麗敏等[29]是根據(jù)改良的Zivin法[27]用右美托咪定后處理后構建的脊髓缺血再灌注損傷模型來研究血脊髓屏障的影響和Caspase-3、IL-1β的表達。而秦美滿等[31]則是采用在肩胛下的第二、三肋骨區(qū)進行夾閉之前先進行電針預處理的方法建造大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，進而研究建模后對血脊髓屏障的影響。

此模型的好處在于：1)后期可使用改良的Tarlov評分標準[32]進行評分，使實驗結果更準確；2)使用右美托咪定可以保護大鼠缺血后大腦、脊髓等器官[33-35]；3)使用藥物后處理在臨床上使用更廣泛，因此此模型更具存在價值及使用意義。不足之處主要是：1)右美托咪定藥物可能對模型引起的副作用尚不可知，存在一定的風險性和不確定性[29]；2)掌控好缺血時間，以減少大鼠死亡率。

從以上研究資料來看，不同方法構建的實驗模型具有不同的特點，且各自都有優(yōu)缺點和適用范圍，為了獲得理想的結果，應盡可能根據(jù)不同的實驗目的和要求選擇最佳的造模方法和評價指標，操作盡量簡單，且成模率高，符合臨床中血脊髓屏障發(fā)病機理的實驗模型。其次，隨著現(xiàn)代的社會的進步，脊髓損傷的發(fā)病率逐年升高，而現(xiàn)有的血脊髓屏障損傷模型依然存在種類少，鑒定標準參差不一，缺乏統(tǒng)一性等問題，研究較為貧瘠。因此，如何在原有的模型基礎上找到更簡便有效、經(jīng)濟實用、可復制且穩(wěn)定性高的血脊髓屏障模型，是研究其損傷的先決要素，并為今后血脊髓屏障損傷或脊髓損傷的基礎研究及臨床診療提供一定的思路。