非洲豬瘟病毒的侵染機(jī)制及疫苗研究進(jìn)展

牟 豪，趙光夫，余遠(yuǎn)迪，許國(guó)洋，楊 柳*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064;3.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,重慶 榮昌 402460)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)屬于雙鏈DNA病毒，基因組為170～193 kb，無(wú)內(nèi)含子，共編碼150～167個(gè)病毒蛋白。ASFV是一種對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)危害極其嚴(yán)重的病毒，具有高致死性和強(qiáng)傳染性的特點(diǎn)，每年該病對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó)，ASFV屬于一類動(dòng)物疫病，同時(shí)在國(guó)際上也屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)管制檢測(cè)疫病類型。ASFV的宿主特異性比較強(qiáng)，主要感染豬，包括家豬和野豬，不能感染人類，故不屬于人畜共患病。該病毒在臨床上可引起肺水腫、發(fā)燒、皮膚發(fā)紺、臟器黏膜出血等癥狀，其高毒力毒株能在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致豬的發(fā)病死亡，病死率高達(dá)100%[1]。遺憾的是，盡管ASFV的疫苗研究已有幾十年的時(shí)間，但目前市面上尚無(wú)針對(duì)ASFV保護(hù)性很強(qiáng)的商用疫苗，使得ASFV的防范工作難度進(jìn)一步加大[2-4]。我國(guó)于2018年8月首次向OIE上報(bào)了ASFV疫情[5]，且至今仍存在散發(fā)疫情。因此，了解ASFV的侵染機(jī)制以及疫苗研究進(jìn)展對(duì)于未來(lái)控制ASFV疫情具有重要的意義。

1 ASFV浸染細(xì)胞方式及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

1.1 ASFV浸染細(xì)胞方式ASFV進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程非常復(fù)雜，可以通過(guò)多種機(jī)制侵染細(xì)胞，同時(shí)取決于多種因素，包括溫度、膽固醇、能量和pH，以及需要依賴多個(gè)細(xì)胞因子[6]。ASFV擁有強(qiáng)大的細(xì)胞感染能力，當(dāng)病毒感染復(fù)數(shù)為50～80時(shí)，只需要30 min就可以浸染高達(dá)60%的Vero細(xì)胞[7]。

前期研究認(rèn)為，ASFV是通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，并能短暫寄宿于內(nèi)吞體。一旦內(nèi)吞體內(nèi)環(huán)境pH降低到一定程度，ASFV便會(huì)穿透內(nèi)吞體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中[8]。隨后研究證實(shí)，ASFV進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)吞途徑主要由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)(clartin mediated)和發(fā)動(dòng)蛋白介導(dǎo)(dynamin mediated)。相較于其他內(nèi)吞方式而言，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的吞噬作用是效率最高的胞內(nèi)外物質(zhì)交換方式。通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的吞噬作用，ASFV可以在幾秒鐘以內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞，并且在1～15 min 就能在內(nèi)吞體中檢測(cè)到ASFV病毒顆粒[9]。發(fā)動(dòng)蛋白是一種GTP酶，其能在細(xì)胞內(nèi)膜的小窩中發(fā)生聚集，并通過(guò)水解GTP的方式調(diào)節(jié)自身發(fā)生收縮，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生凹陷，最后再剪切質(zhì)膜并形成吞噬小泡，而胞外物質(zhì)可以通過(guò)凹陷處被吞噬進(jìn)入細(xì)胞。相應(yīng)地，使用發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑能在體外顯著性地限制ASFV對(duì)靶細(xì)胞的感染[9]。

除了依賴吞噬途徑進(jìn)入細(xì)胞外，ASFV也能通過(guò)大胞飲的方式進(jìn)入細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，有一大部分ASFV是通過(guò)大胞飲進(jìn)入到巨噬細(xì)胞，且使用大胞飲的抑制劑處理之后能夠顯著性降低ASFV進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力[6,10]。從機(jī)制上來(lái)講，大胞飲的產(chǎn)生依賴于細(xì)胞膜局部的不穩(wěn)定性，暗示ASFV能夠降低細(xì)胞膜局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而通過(guò)大胞飲來(lái)進(jìn)入細(xì)胞。

值得注意的是，已發(fā)表的研究結(jié)果多是通過(guò)使用內(nèi)吞抑制劑來(lái)研究ASFV侵染細(xì)胞的機(jī)制，但內(nèi)吞抑制劑均存在較為嚴(yán)重的非特異性的問(wèn)題，比如氯丙嗪在抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞的同時(shí)也會(huì)對(duì)大胞飲產(chǎn)生抑制作用[11]。此外，不同研究者在研究ASFV侵染細(xì)胞的機(jī)制時(shí)所采用的受體細(xì)胞也存在差異。因此，目前不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為ASFV是依賴于某一種或一類內(nèi)吞途徑侵染細(xì)胞，未來(lái)需要采用更新更準(zhǔn)確的方法來(lái)進(jìn)行相關(guān)研究。

1.2 ASFV 胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)ASFV一旦經(jīng)過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)沿著內(nèi)吞途徑寄宿于早期內(nèi)吞體(early endosome)、晚期內(nèi)吞體(late endosome)，最后到溶酶體(lysosome)[6]。

CUESTA-GEIJO等[9]發(fā)現(xiàn)，ASFV僅需要1～15 min 就能從胞外通過(guò)吞噬作用進(jìn)入Vero細(xì)胞的早期內(nèi)吞體中，并檢測(cè)到ASFV的衣殼層關(guān)鍵蛋白p72。早期內(nèi)吞體形成后會(huì)隨著內(nèi)吞途徑進(jìn)一步形成晚期內(nèi)吞體，而早期內(nèi)吞體和晚期內(nèi)吞體的表面標(biāo)記有著明顯差異：早期內(nèi)吞體的表面標(biāo)記主要是EEA1，而晚期內(nèi)吞體的表面標(biāo)記主要是RAB7或CD63。另外，早期內(nèi)吞體轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)吞體的過(guò)程中，其囊泡膜上的v-ATPase泵會(huì)將胞質(zhì)中的H+離子泵入囊泡內(nèi)引起囊泡內(nèi)環(huán)境酸化。早期內(nèi)吞體轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)吞體過(guò)程中，隨著內(nèi)吞體內(nèi)環(huán)境pH的降低，ASFV會(huì)發(fā)生脫殼效應(yīng)，此時(shí)，在光電子顯微鏡下不能觀察到其二十面體的形態(tài)特征，但如果使用抗ASFV核心蛋白的抗體檢測(cè)仍然能夠檢測(cè)到ASFV[6,12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用v-ATPase的抑制劑可以顯著抑制ASFV在細(xì)胞質(zhì)中的復(fù)制，并且能夠在晚期內(nèi)吞體中觀察到大量的帶有完整衣殼的ASFV[13]。這一現(xiàn)象也說(shuō)明，ASFV感染依賴于內(nèi)吞體內(nèi)環(huán)境的酸化所導(dǎo)致的ASFV脫殼效應(yīng)。

ASFV發(fā)生脫殼效應(yīng)之后，會(huì)將自己的內(nèi)核膜與內(nèi)吞體膜融合，釋放核心組分進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生復(fù)制。這一個(gè)過(guò)程是依賴ASFV內(nèi)膜層上的一個(gè)穿膜多肽pE248R蛋白來(lái)完成的[6]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)ASFV會(huì)促進(jìn)整個(gè)內(nèi)吞過(guò)程，使內(nèi)吞體累積在細(xì)胞核周圍的ASFV “病毒工廠”附近，利用內(nèi)吞體內(nèi)的膽固醇和膜上磷脂酰肌醇(phosphoinositides)為ASFV的膜融合以及ASFV的復(fù)制提供原料[14]。最新的研究表明，ASFV感染后還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇向“病毒工廠”富集，而細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)運(yùn)輸膽固醇脂類轉(zhuǎn)運(yùn)體包括羥固醇綁定蛋白(oxysterol-binding protein，OSBP)和膽固醇綁定蛋白(OSBP-related proteins，ORP)介導(dǎo)了該過(guò)程。使用OSBP抑制劑伊曲康唑(itraconazole，ITZ)處理細(xì)胞后，能夠在不影響OSBP定位的情況下顯著抑制ASFV的復(fù)制[15]?？紤]到脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)可能對(duì)ASFV的膜融合和病毒復(fù)制起到至關(guān)重要的作用，那么阻止“病毒工廠”所需要的脂類轉(zhuǎn)運(yùn)可能會(huì)極大地限制ASFV感染。據(jù)報(bào)道，在其他病毒(如丙型肝炎病毒)感染過(guò)程中，通過(guò)抑制其脂類運(yùn)輸過(guò)程能夠顯著限制其感染[16]。

2 ASFV疫苗的研究現(xiàn)狀

早在1950年就有報(bào)道，ASFV感染康復(fù)后的豬能夠抵御相同毒力ASFV的感染[17]，意味著ASFV疫苗研發(fā)擁有良好的前景，但由于種種原因直到現(xiàn)在都還沒(méi)有一個(gè)成熟可用的ASFV疫苗。限制ASFV疫苗發(fā)展的一個(gè)重要因素是ASFV具有強(qiáng)大的免疫逃逸能力，包括先天性免疫和適應(yīng)性免疫。例如：ASFV的CD2v蛋白能夠抑制淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)病毒的感染；A238L基因能夠抑制NF-κB和NEAT的激活，同時(shí)抑制一氧化氮的釋放[18]；MGF360和MGF530/505基因能夠抑制Ⅰ型干擾素等一系列炎性因子的釋放，提升感染細(xì)胞的存活能力[19]。即便如此，在過(guò)去幾十年里，研究者在ASFV疫苗領(lǐng)域仍取得了一定的進(jìn)展。目前，針對(duì)ASFV開(kāi)發(fā)的疫苗類型主要分為3種：滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程亞單位疫苗。

2.1 ASFV滅活疫苗滅活疫苗是最常見(jiàn)的疫苗類型，已有多種感染性疾病通過(guò)滅活苗得到了有效的控制[20]。但是，滅活疫苗往往對(duì)于某些復(fù)雜的病毒起不到保護(hù)作用。前期有研究通過(guò)給豬群免疫經(jīng)滅活的ASFV感染的巨噬細(xì)胞和滅活的ASFV，發(fā)現(xiàn)并不能給豬提供有效保護(hù)[21]。2014年，BLOME等[22]將滅活的ASFV與不同免疫佐劑混合免疫豬群，發(fā)現(xiàn)該滅活疫苗同樣不能給豬群提供有效的保護(hù)。從目前看來(lái)，ASFV滅活疫苗的方式可能成功率不高。其原因可能是，ASFV在體內(nèi)感染過(guò)程中表達(dá)的蛋白譜和體外培養(yǎng)條件下表達(dá)的蛋白譜差異很大，滅活疫苗不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性抗體。

2.2 ASFV弱毒疫苗弱毒疫苗是通過(guò)病毒或細(xì)菌在體外或非宿主動(dòng)物體內(nèi)的連續(xù)傳代制成。弱毒疫苗與滅活疫苗相比，弱毒疫苗能夠持續(xù)性誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體。不少研究者也嘗試通過(guò)給豬群免疫自然獲得的弱毒ASFV或體外致弱的ASFV，但其效果并不理想，免疫豬群往往出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[23]，原因可能是弱毒疫苗依然是活病毒。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)感染非敏感性細(xì)胞(如：Vero細(xì)胞)致弱后的ASFV毒株在豬群體內(nèi)復(fù)制的能力顯著性下降，毒力基因的表達(dá)也同時(shí)下降，導(dǎo)致動(dòng)物不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)[24]。隨著對(duì)ASFV病原學(xué)的深入研究，鑒定出了越來(lái)越多的ASFV毒力相關(guān)基因，與此同時(shí)，出現(xiàn)了一些基因缺失弱毒疫苗。與傳統(tǒng)的自然選擇或體外選擇弱毒疫苗相比，基因缺失弱毒疫苗是基于ASFV病原學(xué)進(jìn)行的定向突變，其蛋白質(zhì)組信息更加清晰，安全性與可靠性也更高。已經(jīng)有一些基因缺失弱毒疫苗在試驗(yàn)中對(duì)豬群起到了較好的保護(hù)作用。比如，GALLARDO等[25]報(bào)道，缺失了A224L和EP153R基因的NH/P68ΔA224L和NH/P68ΔEP153R弱毒苗能夠保護(hù)豬群對(duì)同源ASFV毒株的感染；以及缺失MGF360基因的BeninΔMGF弱毒苗免疫豬群后能夠?qū)?qiáng)毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)效果[26]。以及近日CHEN等[27]報(bào)道，1株缺失了7個(gè)基因的弱毒疫苗株HLJ/18-7GD，免疫SPF豬、商品豬以及妊娠母豬后可以產(chǎn)生非常好的保護(hù)作用，這可能是一種安全有效的疫苗，有望在控制ASFV傳播方面發(fā)揮重要作用。2020年6月10日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新聞辦公室發(fā)布了哈爾濱獸醫(yī)研究所自主研發(fā)的1株基因缺失疫苗環(huán)境釋放和臨床試驗(yàn)進(jìn)展順利的相關(guān)消息。該疫苗是于2020年3月獲農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品臨床試驗(yàn)批件，按照臨床試驗(yàn)方案，于2020年4月上旬、5月上旬和6月上旬分別在黑龍江、河南和新疆等3個(gè)基地啟動(dòng)疫苗臨床試驗(yàn)。截止6月底，該疫苗株環(huán)境釋放試驗(yàn)表明疫苗接種仔豬生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)異常臨床狀況；疫苗接種母豬狀態(tài)良好，無(wú)異常臨床表現(xiàn)，無(wú)異常發(fā)情、無(wú)流產(chǎn)；免疫豬無(wú)疫苗毒排放，無(wú)水平傳播；免疫后大部分母豬已產(chǎn)仔，免疫組與對(duì)照組產(chǎn)仔、死胎率無(wú)顯著性差異，仔豬生長(zhǎng)狀況良好?？偟膩?lái)說(shuō)，弱毒疫苗，尤其是基因缺失弱毒疫苗給ASFV的防制帶來(lái)了希望。

2.3 ASFV亞單位疫苗亞單位疫苗是通過(guò)化學(xué)或生物手段，選取細(xì)菌或病毒具有免疫保護(hù)活性的蛋白或核酸所制成的疫苗，因此被認(rèn)為是最安全的疫苗類型。ASFV病原學(xué)的研究揭示了不少關(guān)于ASFV黏附和進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，如p30、p54、pp220、pp62、p72和CD2v等，這些關(guān)鍵蛋白均可以作為ASFV亞單位疫苗的候選靶點(diǎn)[28-29]。據(jù)報(bào)道，利用桿狀病毒表達(dá)的p54、p30和p72蛋白作為亞單位疫苗對(duì)豬群進(jìn)行免疫，其產(chǎn)生的中和性抗體能給豬群提供部分保護(hù)作用[30-21]。另?yè)?jù)報(bào)道，通過(guò)對(duì)豬群免疫p54和p30的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有保護(hù)性的體液免疫[32]。但是，也有報(bào)道稱同樣使用桿狀病毒表達(dá)ASFV的p22、p30、p54和p72蛋白免疫豬群后，發(fā)現(xiàn)并不能提供足夠的免疫保護(hù)作用[33]。這看似矛盾的結(jié)果可能是因?yàn)樵囼?yàn)設(shè)計(jì)的不同，并不能因此直接否認(rèn)ASFV亞單位疫苗的價(jià)值。

2.4 ASFV基因疫苗CD8陽(yáng)性T細(xì)胞在抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起到了舉足輕重的作用，所以ASFV的DNA疫苗也成為一個(gè)熱門(mén)的研究領(lǐng)域。DNA疫苗與亞單位蛋白疫苗不同，DNA疫苗能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞從細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病毒蛋白，能直接通過(guò)MHC-Ⅰ分子呈遞給CD8陽(yáng)性T細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，從而進(jìn)一步激活后天免疫流程[34]。LACASTA等[35]通過(guò)將ASFV的開(kāi)放閱讀框(ORFs)文庫(kù)和泛素共表達(dá)來(lái)作為DNA疫苗免疫豬群，發(fā)現(xiàn)可以為豬群提供有效的免疫保護(hù)，其保護(hù)機(jī)制可能包括誘導(dǎo)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，并且篩選到了多個(gè)保護(hù)性抗原。鑒于有些蛋白或肽段并不能穩(wěn)定的誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生，已經(jīng)有很多研究人員將病毒DNA和蛋白共表達(dá)來(lái)作為一種新型DNA疫苗。但遺憾的是，將ASFV的DNA(CD2v、p72、p32、±p17)和蛋白(p15、p35、p54、±p17)作為DNA疫苗免疫豬群并不能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[36]。

總之，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)55個(gè)具有免疫原性的ASFV蛋白和44個(gè)ASFV新的病毒多肽[37-38]。但是，還不清楚這些蛋白或多肽是否具有完整的免疫保護(hù)性。目前，亞單位疫苗研究中，需要找到一個(gè)穩(wěn)定的抗原靶標(biāo)，同時(shí)也需要進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更多具有免疫原性的蛋白。盡管現(xiàn)在亞單位疫苗僅能誘導(dǎo)出部分免疫保護(hù)作用，還不能作為真正的疫苗使用，但依賴著它具有高安全性等優(yōu)點(diǎn)，在該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究是極具意義的。

近年來(lái)，重組病毒載體疫苗作為一種新型的基因工程疫苗受到了廣泛的關(guān)注。目前，有研究團(tuán)隊(duì)用重組病毒載體表達(dá)多個(gè)ASFV抗原來(lái)免疫豬群，盡管攻毒免疫豬群依然會(huì)出現(xiàn)了感染癥狀，但免疫豬群血液和淋巴組織載毒量較正常豬群發(fā)生了顯著性下調(diào)[38]。在我國(guó)，張會(huì)雷等[39]將ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白p72和p54或CD2v和p30的基因分別插入到痘苗基因組中，構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)p72和p54的重組痘苗病毒以及同時(shí)表達(dá)CD2v和p30的重組痘苗病毒，為ASFV重組病毒載體疫苗研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與展望

盡管ASFV現(xiàn)在在我國(guó)的流行得到了一定的控制，但想要從根本上控制或清除該病毒還需要很長(zhǎng)時(shí)間的努力。疫苗作為控制流行病的有效武器，在控制和凈化ASFV的工作中將扮演重要角色。想要制作出保護(hù)性良好的疫苗，必然需要病原學(xué)的深入研究作為基礎(chǔ)。在疫苗研究方面，亞單位疫苗有著便利性和安全性高等特點(diǎn)，但是目前看來(lái)，也許基因缺失的弱毒疫苗更具有應(yīng)用前景，而滅活苗可能不適用于作為ASFV的疫苗。新型重組病毒載體疫苗為應(yīng)對(duì)ASFV感染提供了新的研究思路，但是從本課題組對(duì)以羊痘病毒為載體的重組病毒疫苗的研究現(xiàn)狀來(lái)看，受制于病毒的重組效率低以及重組毒株的篩選難度大，重組病毒載體疫苗的研發(fā)及應(yīng)用可能面臨極大的挑戰(zhàn)。