人參皂苷Rb1對(duì)增生性瘢痕影響的研究

李昕珊，岳毅剛*，張克勤，孫瑞軍，陳乃玲

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科，桂林 541000;2 桂林市南溪山醫(yī)院整形外科，桂林 541000;3河北聯(lián)合大學(xué)，唐山 063000

瘢痕組織是人體創(chuàng)傷修復(fù)過程中的一種必然產(chǎn)物，防治增生性瘢痕的方法有很多如藥物、放射［3］、壓力和手術(shù)等方法。根據(jù)已知的增生性瘢痕的可能機(jī)制和發(fā)病原因［6］已形成了從抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原代謝的水平尋找治療和預(yù)防瘢痕增生的方法。

傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)瘢痕的治療累積了豐富的經(jīng)驗(yàn)，且有較顯著療效［13］。人參皂苷Rb1為人參中提取的單體成分，劉鶴松等［12］已對(duì)人參皂苷Rg3抑制增生性瘢痕的效果做了闡述，認(rèn)為有效。對(duì)本研究選用更為經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的Rb1成分同樣以兔耳增生性瘢痕為研究對(duì)象，通過VG 特異性膠原染色，和免疫組織化學(xué)相關(guān)因子的檢測(cè)和原位雜交檢測(cè)膠原I mRNA，同樣認(rèn)為人參皂苷Rb1有抑制增生性瘢痕發(fā)展的作用。

通過建立增生性瘢痕的動(dòng)物模型對(duì)瘢痕的外部形態(tài)和顯微鏡下的微觀結(jié)構(gòu)的觀察和測(cè)量等方式，對(duì)瘢痕的動(dòng)態(tài)發(fā)展和應(yīng)用藥物干預(yù)的發(fā)展變化做闡述。應(yīng)用原位雜交方法檢測(cè)膠原I 型mRNA 的表達(dá)，從分子的角度進(jìn)一步說明了人參皂苷Rb1有抑制增生性瘢痕進(jìn)一步發(fā)展的可能。

1 材料與儀器

新西蘭大耳白兔15 只，雌雄不限，體重2.6～3.5 kg，單籠飼養(yǎng)，由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。人參皂苷Rb1純品(純度≥98%)，天津?yàn)笊锟萍加邢薰咎峁脽o菌注射用水配制成濃度分別為0.2、0.4、1.0 mg/mL;膠原I 型蛋白(bs-0578R)，Caspase 3 試劑盒(bs-0081R);兔二步法檢測(cè)試劑盒(PV-6001);DAB 及DAB 增強(qiáng)劑(ZLI-9034)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司;VG 染色試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司);原位雜交膠原I 型mRNA 試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司提供)，含公司設(shè)計(jì)的成品陽性探針和陰性探針。防脫片及無DNA 和RNA 酶處理的氨基酸載玻片(中國醫(yī)學(xué)科技院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供)，DEPC，光學(xué)顯微鏡，圖像分析軟件Motic 等由河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 增生性瘢痕動(dòng)物模型的建立

實(shí)驗(yàn)兔子適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，根據(jù)李薈元［1］等建立的增生性瘢痕動(dòng)物模型法，嚴(yán)格無菌操作下，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉3.0 mL/kg。分別于兔耳腹側(cè)面中段的內(nèi)、外、中部(避開可見血管)用直徑約為1.0 cm 的打孔器各形成一個(gè)圓形標(biāo)記，每只耳朵2～3 處，間隔≥1.0 cm，建立兔耳增生性瘢痕模型。術(shù)中嚴(yán)格無菌操作切除圓形標(biāo)記范圍內(nèi)除包括軟骨膜在內(nèi)的全層皮膚至軟骨膜表面，保留軟骨，壓迫止血，不予包扎。術(shù)后7 d 嚴(yán)格無菌操作下去除創(chuàng)面新生的肉芽組織和血痂，不包扎，任其愈合。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組、標(biāo)本取材固定

每只兔子耳5 處創(chuàng)面分別為空白對(duì)照組(a):術(shù)后不進(jìn)行任何處理;生理鹽水對(duì)照組(b):上皮化后(即26 d 后)在兔耳創(chuàng)面周圍皮下注射生理鹽水;治療組上皮化(約26 d)后兔耳創(chuàng)面周圍皮下注射不同濃度的人參皂苷Rb1(0.2 mg/mL，c)、(0.4 mg/mL，d)、(1.0 mg/mL，e)。每處創(chuàng)面注射劑量約為0.3 mL，每3 d 一次，共三次。大體觀察創(chuàng)面愈合和增生性瘢痕情況。

分別于術(shù)后第2、4、6 周切去瘢痕組織標(biāo)本每次取4 只兔子，放于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 的多聚甲醛固定液中固定，24～72 h 石蠟包埋，沿組織橫切面進(jìn)行切片(從組織取材至切片凡是接觸組織的手術(shù)器械，固定液，切片刀片，盛放組織的玻璃瓶，塑料包埋盒，切片展片水等全部必須無酶處理，以免污染，操作人員數(shù)量盡量少，操作過程戴帽子口罩手套并少言少語，原位雜交用專用載玻片。)，進(jìn)行HE 染色及VG染色，膠原Ⅰ型蛋白和Caspase 3，圖像分析系統(tǒng)測(cè)量計(jì)算HI，膠原纖維密度，原位雜交測(cè)膠原Ⅰ型mRNA 的表達(dá)。

2.3 肉眼和顯微鏡下觀察和測(cè)量

創(chuàng)面愈合情況:術(shù)后26 d，肉眼觀察各組增生性瘢痕的硬度，色澤，形態(tài)。

鏡下觀察:常規(guī)HE 染色，紅色為胞漿成分，藍(lán)紫色顯示細(xì)胞核。VG 染色:膠原纖維染成紅色，肌纖維、神經(jīng)膠質(zhì)、紅細(xì)胞染黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色或棕藍(lán)色。

瘢痕指數(shù)測(cè)量:應(yīng)用Motic 軟件系統(tǒng)，HE 染色后鏡下觀察，低倍顯微鏡標(biāo)尺測(cè)量瘢痕厚度，測(cè)量三次取平均值。計(jì)算增生性瘢痕指數(shù)HI(用來測(cè)量真皮層增生程度的指標(biāo))［2］。

HI=瘢痕高度(SH)/健康皮膚高度(DH)。

膠原含量測(cè)定:VG 染色，×200 倍光鏡下，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算膠原面積［5］，結(jié)果取均數(shù)。

2.4 免疫組化(Collagen I，Caspase-3 蛋白的表達(dá))

Collagen I:應(yīng)用常規(guī)二步免疫組化法嚴(yán)格按試劑和說明書操作，以PBS 代替一抗為陰性對(duì)照，有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，在200 倍光鏡觀察下隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果取均數(shù)。

用免疫組化的方法進(jìn)行含量的測(cè)定，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次每次5 min，酒精浸洗無水、95%各兩次，每次5 min，后放入0.5Triton 15 min，3 %H2O210 min，水化5 min，用Super PAP Pen 沿組織周圍畫圈，點(diǎn)上質(zhì)量濃度為1 g/L 的消化酶37 ℃，20 min。放入PBSⅠ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，于濕盒中滴加一抗，4 ℃冰箱過夜(或37 ℃，1 h 30 min)，取出置常溫，PBS 沖洗3 次，5 min/次，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次，DAB 顯色，水沖＞30 min，蘇木素復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗＞30 min，95%、無水酒精各兩次，每次5 min，二甲苯兩次，15 min/次，中性樹膠封片，晾干。

Caspase-3:應(yīng)用常規(guī)二步免疫組化法嚴(yán)格按按試劑和說明書操作，以PBS 代替一抗為陰性對(duì)照，棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，在200 倍光鏡觀察下隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果取均數(shù)。

2.5 原位雜交測(cè)I 型膠原mRNA 的表達(dá)

探針濃度:8 μg/mL 雜交液。

Collagen 1 A 1 探針設(shè)計(jì)(試劑公司設(shè)計(jì)的成品探針):

NM_000088 5927 bp homo sapiens collagen，type Ⅰ，alpha 1 (COL1A1)，mRNA.

AY633663 524 bpOryctolaguscuniculus preproalpha-1 collagen type ⅠmRNA，

XM_001081230 5862 bpRattusnorvegicusprocollagen，type 1，alpha 1 (Col1a1)，mRNA.

NM _007742 4709 bpMusmusculusprocollagen，type Ⅰ，alpha 1 (Col1a1)，mRNA.

HRM1304-1277 TGTCCATCAGCACCAGGGTTTCCAGCAG

HRM1358-1325 AAGCCAGGAGCACCAGCAATACCAGGAGCACCAT

HRM3431-3402 TGTTCGCCTGTCTCACCCTTGTCACCACGG

R369-336 CGTGCTTCTTCTCCTTGGGGTTCTTGCTGATGTA

R481-456 TCGGTGGACATGAGGCGCAGGAACGT

5'-TCTTC TCCTT GGGGT TCTTG CTGAT GTA

5'-CGGT GGACA TGAGG CGCAG GAACG T

烤片后脫蠟，0.5%曲拉通洗滌，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3的過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 洗滌后復(fù)合消化，洗滌后滴加預(yù)雜交工作液，再次洗滌滴加小鼠抗地高辛孵育(在此之前所有的操作均應(yīng)在無酶環(huán)境中進(jìn)行，所有用品包括藥物和器材均做無酶處理)，洗滌后滴加高敏過氧化物酶鏈親和復(fù)合物孵育，洗滌后滴加DAB 及其增強(qiáng)劑顯色，復(fù)染蘇木素，脫水封片。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肉眼觀察

各組創(chuàng)面均愈合良好，未見感染不愈，各組愈合時(shí)間約為26 d，外觀粗略觀察各組間無顯著差別。瘢痕增生隆起突出于周圍正常皮膚表面，但未超出創(chuàng)傷范圍，可見a、b 組形成的增生性瘢痕最顯著，瘢痕呈圓形，范圍未能超出造模時(shí)打孔器的標(biāo)記范圍，中央呈“小丘樣”或“乳頭樣”凸起，質(zhì)硬;c～e 組與前兩組比較，瘢痕增生程度較輕，表面較平坦，質(zhì)略軟，色淺(圖1)。

11月8日起，美國加州北部及南部爆發(fā)山火并迅速蔓延，大火范圍達(dá)近4.5萬公頃，山火造成31人死亡，此外還有228人失聯(lián)。此次山火已成為加州歷史上最具破壞性的一次火災(zāi)，估計(jì)死亡人數(shù)將進(jìn)一步上升。

圖1 動(dòng)物模型制作結(jié)果Fig.1 Images of animal model of hypertrophic scar at different stages

3.2 組織學(xué)變化

常規(guī)HE 染色:正常組織表皮細(xì)胞層數(shù)少，細(xì)胞排列整齊，膠原排列整齊幾乎成平行狀態(tài)，間隙分明，條理性明顯，細(xì)胞成分少，少見血管組織。a、b組差別不大，表皮細(xì)胞層數(shù)明顯增多，細(xì)胞排列雜亂，體積變大，膠原增生明顯，膠原纖維排列雜亂扭曲難以看到整體形態(tài)，間隙不明顯，常見膠原結(jié)節(jié)出現(xiàn)和漩渦狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞成分明顯增多，細(xì)胞體積變大，血管組織數(shù)量較正常組增多。c、d、e 組隨著藥物濃度的增加膠原排列越顯整齊數(shù)量減少，觀察到的細(xì)胞成分減少，并且可見到趨于水平排列的多層膠原纖維束，新生血管和膠原結(jié)節(jié)的數(shù)量也相應(yīng)減少(圖2)。

圖2 各組瘢痕HE 染色結(jié)果Fig.2 Images of HE staining of hypertrophic scar

VG 染色:膠原纖維染成紅色，肌纖維、神經(jīng)膠質(zhì)、紅細(xì)胞染黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色或棕藍(lán)色。各組變化如HE 表現(xiàn)(如上)，見圖3。

圖3 各組VG 染色結(jié)果Fig.3 Images of VG staining of hypertrophic scar

瘢痕增生指數(shù)HI 結(jié)果見表1:a、b 組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，c～e 組的HI 指數(shù)相比a、b組降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，c、d 組比e 組的HI 指數(shù)高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高濃度1.0 mg/mL 人參皂苷Rb1有效抑制瘢痕增生。

膠原纖維密度，含量測(cè)定，結(jié)果見表2:a、b 組之間膠原纖維密度無顯著性差異(P ＞0.05)，c、d、e 組的膠原密度相比a、b 組下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，c、d組比e 組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

Collagen I 分布特征:主要分布在真皮的細(xì)胞間質(zhì)，成纖維細(xì)胞、血管壁亦見少量的陽性信號(hào)。Ⅰ型膠原蛋白的陽性表現(xiàn)見棕黃色顆粒，略粗，密度高，排列不規(guī)則，可呈旋渦狀(如圖4)。a、b 組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，c～e 組Collagen I 的陽性表達(dá)相比a、b 組降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，e 組比c、d 組的Collagen I 陽性表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 CollagenⅠ組織化學(xué)Fig.4 Collagen Iimmunohistochemical of hypertrophic scar

Caspase-3:陽性表達(dá)為棕黃色顆粒信號(hào)，見局灶性分布或彌漫分布細(xì)胞和組織中，主要表達(dá)于表皮基底層細(xì)胞的胞漿內(nèi)(如圖5)。a、b 組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，c～e 組的Caspase-3 陽性表達(dá)相比a、b 組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，e 組比c、d 組的陽性表高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖5 Caspase-3 組織化學(xué)Fig.5 Caspase-3 immunohistochemical of hypertrophic scar

圖6 原位雜交染色collagen I mRNAFig.6 collagen I mRNA staining of hypertrophic scar

3.4 原位雜交的染色觀察結(jié)果

陽性表達(dá)為棕黑色顆粒(使用DAB 增強(qiáng)顯色作用)，纖維結(jié)節(jié)處多見。圖像分析結(jié)果顯示Collagen I mRNA 的表達(dá)隨藥物濃度增高而減少，對(duì)照組a、b無差別，相比實(shí)驗(yàn)組屬于高表達(dá)(如圖6)。

4 討論

瘢痕有正常瘢痕和病理性瘢痕兩大類，病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成是由于創(chuàng)傷愈合過程成纖維細(xì)胞合成膠原能力增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(FCM)增多和過度沉積，膠原為其主要成分。增生性瘢痕(HS)是皮膚真皮損傷愈合后遺留的高出周圍正常皮膚、發(fā)紅、堅(jiān)硬的病理結(jié)構(gòu)，可以出現(xiàn)瘙癢、疼痛等不適癥狀，而且在不同形成階段有不同的臨床表現(xiàn)和發(fā)展趨勢(shì)，不僅嚴(yán)重影響外貌和功能，也會(huì)對(duì)患者心理造成影響。

表1 HI 測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=75，)Table 1 The measurement results of HI (n=75，)

表2 膠原含量測(cè)定統(tǒng)計(jì)結(jié)果，collagen I、Caspase-3 陽性細(xì)胞反應(yīng)統(tǒng)計(jì)，原位雜交染色統(tǒng)計(jì)(用藥后第6 w)Table 2 The determination results ofcollagen content，collagenI，Caspase-3 positive cells reaction，in situ hybridization statistics(week 6)

增生性瘢痕的治療方法有:藥物治療、壓迫治療、按摩治療、放射治療、激光［3］、生物治療、基因及手術(shù)治療等。然而至今還沒有發(fā)現(xiàn)非常令人滿意的特別有效的防治策略?，F(xiàn)有方法在療效上都存在有一定的局限性，新方法還在不斷探索中。

中藥治療瘢痕有悠久的歷史，對(duì)瘢痕的認(rèn)識(shí)有著獨(dú)特的觀點(diǎn)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為瘢痕形成主要由氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)所致，或相輔相成。治療上亦多采用活血化瘀、攻毒散結(jié)之品。只要方法有內(nèi)治法、外治法和內(nèi)外兼治。以往資料對(duì)人參皂苷單體的藥理作用，以及作用機(jī)制已經(jīng)很深入，很多已進(jìn)入分子、蛋白、基因組水平，人參皂苷單體抗細(xì)胞纖維化，促血管生成與抑制TGF-β1 的刺激膠原增生的作用均提示人參皂苷有效成分具有促進(jìn)傷口愈合預(yù)防增生性瘢痕的產(chǎn)生的作用。Kimura Y［4］，將低濃度人參皂甙Rb1應(yīng)用與燒傷創(chuàng)面的小鼠，發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1有強(qiáng)大的促進(jìn)創(chuàng)面愈合能力。亦有研究認(rèn)為人參皂甙Rb1抑制ECM 分泌的作用［5］。趙自然［6］等認(rèn)為人參皂苷Rg3能夠抑制病理性瘢痕的增生，但價(jià)格昂貴。至此對(duì)人參皂甙Rb1的研究主要在神經(jīng)和心血管方面［7，8］，而在瘢痕的研究還屬少見。但李俊飛［9］認(rèn)為Rb1能增加正常人成纖維細(xì)胞的增殖水平，所以對(duì)Rb1對(duì)增生性瘢痕的治療效果還要從用藥時(shí)機(jī)、濃度和方式等多方面進(jìn)行深入探討。

現(xiàn)在常用于病理性瘢痕的研究途徑主要有①人體瘢痕組織體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞;②觀察記錄臨床病例和研究術(shù)后標(biāo)本;③制作動(dòng)物模型。

目前應(yīng)用于建立增生性瘢痕動(dòng)物模型的主要有新西蘭白兔、日本大耳白兔、裸鼠、杜洛克雌豬等。裸鼠模型引起免疫系統(tǒng)缺失可將增生性瘢痕組織移植至此，進(jìn)行一系列的研究分析，但由于此種瘢痕并不是物種本身所產(chǎn)生，所以無法細(xì)致的觀測(cè)到增生性瘢痕的動(dòng)態(tài)發(fā)展變化，同途徑①、②，雌性杜洛克豬由于其來源和成本問題難以普遍推廣。Morris［2］等首先在兔耳腹側(cè)的創(chuàng)面上發(fā)現(xiàn)真皮過度增生現(xiàn)象與人類增生性瘢痕樣改變相似。國內(nèi)學(xué)者在兔耳腹側(cè)成功建立了增生性瘢痕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并從多個(gè)側(cè)面驗(yàn)證了兔耳增生塊與人類瘢痕的相似性。兔耳的增生性瘢痕因?yàn)槭莿?dòng)物自身產(chǎn)生，研究者可對(duì)瘢痕的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察，又介于來源廣泛成本問題等，成為目前研究的常用動(dòng)物。

由檢測(cè)結(jié)果得知HI 和膠原密度隨藥物濃度的增加而下降，從外觀上明顯觀察到瘢痕增生的抑制作用。而c、d 組的組間差異不明顯，懷疑與應(yīng)用的藥物濃度有關(guān)，還需以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步的探討藥物濃度的選擇。

瘢痕組織中基質(zhì)成分包括膠原纖維、結(jié)構(gòu)性蛋白及蛋白多糖等，其中膠原纖維是瘢痕組織的主要成分，其中又以Ⅰ型膠原纖維居多，I 型膠原粗、僵硬，瘢痕質(zhì)地硬，彈性差。膠原的合成與降解是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，主要涉及蛋白質(zhì)的翻譯、翻譯后的修飾、剪接，在這個(gè)過程中，多種生物活性酶如氧化酶、蛋白酶、膠原酶和金屬蛋白酶等參與其中［10］。正常情況下，膠原合成與分解呈動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)這種平衡被打破，導(dǎo)致成纖維、肌纖維母細(xì)胞合成膠原增多，分解減少，合成速度遠(yuǎn)大于膠原分解，最終導(dǎo)致了膠原沉積，從而形成瘢痕組織。成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生膠原的主要細(xì)胞，所以抑制成纖維細(xì)胞的增殖和調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成可能是治療增生瘢痕的有效途徑。

增生性瘢痕以Ⅰ型膠原為主，所以Ⅰ型膠原量的變化可以直接顯示增生性瘢痕的增生狀態(tài)。如此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨人參皂苷藥物濃度的提高，免疫組化結(jié)果中Ⅰ型膠原的陽性表達(dá)越低，也就是說人參皂苷Rb1有抑制增生性瘢痕的趨勢(shì)。

Caspase-3 為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine requiringaspartateprnteaseaspase)家族成員。Caspase 蛋白酶家族，是近年凋亡調(diào)控機(jī)制的研究熱點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)的十幾個(gè)家族成員，他們參與轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)或直接作為凋亡效應(yīng)分子，促進(jìn)細(xì)胞骨架降解和DNA 片斷化。許多影響細(xì)胞凋亡的基因，如p53、bcl-2、Fas、Rb 等細(xì)胞因子和藥物都能通過調(diào)節(jié)caspase 活化發(fā)揮作用。

Caspase-3 作為關(guān)鍵分子在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。膠原的分解速度趕不上合成的速度以至于發(fā)生沉積，推測(cè)因?yàn)槌衫w維細(xì)胞的凋亡不足，過度的增殖分泌大量膠原蛋白，Caspase-3 正常以酶原的形式存在于胞核(漿)中，在凋亡的早期階段被激活后作用于其底物。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)增生瘢痕中Caspase-3 表達(dá)降低［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組a、b 中Caspase-3 相比于用藥組c、d、e的表達(dá)明顯較弱，作者認(rèn)為人參皂苷激發(fā)Caspase-3活性，促進(jìn)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡以達(dá)到治療增生性瘢痕的作用。

前膠原是膠原蛋白的前體和胞內(nèi)形式。前膠原基因是由多個(gè)外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成的斷裂基因，它的過度表達(dá)使膠原合成異常增加，易導(dǎo)致瘢痕的形成，抑制基因的表達(dá)將有助于減少膠原的合成從而防治瘢痕。增生性瘢痕組織的主要成分是Ⅰ型膠原，Ⅰ型前膠原在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外基質(zhì)，通過內(nèi)切肽酶等的作用，再通過聚合形成膠原纖維。故Ⅰ型前膠原的轉(zhuǎn)錄及合成水平可以代表細(xì)胞的膠原合成能力。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，a、b 組的表達(dá)最高無差異，c、d、e 組的陽性表達(dá)與人參皂苷濃度成反比。

本研究建立動(dòng)物模型，對(duì)瘢痕用藥干預(yù)，通過外觀形態(tài)，組織切片染色，免疫組化方法研究膠原量和細(xì)胞凋亡的變化趨勢(shì)，并應(yīng)用原位雜交的方法從基因的角度深入的印證人參皂苷對(duì)增生性瘢痕的治療效果，認(rèn)為有效。中藥應(yīng)用于增生性瘢痕期待有更升入全面的探索，從患者的安全性和依從性上考慮，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在病理性瘢痕的治療的優(yōu)勢(shì)上不可小覷。

1 Li HY(李薈元)，Liu JB(劉建波)，Xia W(夏煒)，et al.Establishment and application of experimental animal model for hypertrophic scar.J Fourth Milit Med Univ (第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào))，1998，19:655-657.

2 Morris DE，Wu L，Zhao LL，et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring:quantitative studies.PlastReconstr Surg，1997，100:674-681

3 De CarvalhoPde T，da Silva IS，Reis FA，et al.Influence of ingaalp laser (660 nm)on the healing of skin wounds in diabetic rats.Acta Cir Bras，2010，25:71-79.

4 Kimura Y，Sumiyoshi M，Kawahira K，et al.Effects of ginseng saponins isolated from red ginseng roots on burn wound healing in mice.Br J Pharm，2006，148:860-870.

5 Xie XS(謝席勝)，Liu HC(劉衡川)，F(xiàn)an JM(樊均明)，et al.Effects of ginsenoside Rb1on TGF-β1 induced p47phox expression and extracelluarmatrix accumulation in rat rental tubular epithelialcells.J Sichuan Univ，Med Sci Edi(四川大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2009，1:106-110.

6 Liu HS(劉鶴松)，Zhao ZR(趙自然)，Lan SS(蘭珊珊)，et al.Research on the effect of ginsenoside-Rg3on human fibroblasts proliferation and apoptosis.Chin J Labor Diag(中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué))，2010，14:1697-1700.

7 Kong HL(孔宏亮)，Li ZQ(李占全)，Yuan L(袁龍).Nitric oxide synthase inhibition effect on myocardial cell hypertrophyenzyme/nitric oxide mediated by ginsenoside Rb1.Guangdong Med J (廣東醫(yī)學(xué))，2012，33:167-169.

8 Li YQ(李玉倩)，Wang F(王芳)，Chen JG(陳建國).Antidepressant-like effect of ginsenoside Rb1on behavior of animals.Henan Med Res (河南醫(yī)學(xué)研究)，2011，20:257-263.

9 Li JF(李俊飛)，Zhou DX(周大興)，Hong XY(洪先業(yè))，et al.Ginsenoside Rg1，the role of human skin collagen metabolism of Rb1and Re.J Tongji Univ，Med Sci(同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2011，32(3):28-32.

10 Peters T，SindrilaruA，HuberR，et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase in human dermal fibroblasts enhances the contraction of free floating collagen lattice:implications for ageing and hyperplastic scar formation.Arch Derma Res，2009，30:273-287.

11 Chen W(陳偉)，F(xiàn)u XB(付小兵)，Sun TZ(孫同柱)，et al.Effects of Fas，F(xiàn)as-L and Caspase-3 expression in hypertrophic scar and the scar formation.Med J Chin People's Liber Army(解放軍醫(yī)學(xué)雜志)，2002，7:580-581.

12 Liu HS(劉鶴松)，Wang F(王芳)，Wu J(吳杰)，et al.Effect of ginsenoside Rg3on the expression of caspase-3，cytochrome C in rabbit ear hypertrophic scar.Chin J Gerontol(中國老年學(xué)雜志)，2011，16:3106-3107.

13 Zhao LK(趙連魁)，Gu TM(谷廷敏)，Liu JC(劉建春)，et al.The effect of Weixiongscar cream on bFGF and FN in hypertrophic scar.Chin J Prac Aesthe Plas Sur(中國實(shí)用美容整形外科雜志)，2004，15:249-250.