不同實驗動物模型的建立對miRNA調(diào)控脂代謝影響的研究進(jìn)展

張馨心,李林星,夏廣軍*

1.延邊大學(xué)融合學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；3.圖們市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，吉林圖們 133100

MicroRNA(miRNA)最早是在1993年于秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，屬一類不編碼蛋白質(zhì)、大小為20～24個堿基、廣泛存在于動植物體內(nèi)的單鏈小分子RNA。miRNA是一類機(jī)體的發(fā)育和生理過程的重要的調(diào)節(jié)因子，參與能量代謝，細(xì)胞分化，胰腺β細(xì)胞的發(fā)育，脂質(zhì)代謝等過程的機(jī)體發(fā)育和生理過程的重要調(diào)節(jié)因子。建造動物體內(nèi)模型可以有意識地將動物按照研究者的意愿對其已有性狀進(jìn)行控制或篩選，而針對miRNA對脂代謝的調(diào)控上構(gòu)建的動物模型是一種對已在細(xì)胞層面上進(jìn)行實驗的miRNA所具有調(diào)控作用或形成的通路的基礎(chǔ)上加以驗證的有效實驗手段。因此本文主要針對目前在動物模型上miRNA對脂代謝的調(diào)控，以及在miRNA調(diào)控脂代謝時采取基因編輯技術(shù)的應(yīng)用加以陳述，旨在完善miRNA調(diào)控脂代謝通路的研究方法，為從分子水平調(diào)控提高畜牧產(chǎn)品質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 miRNA通過靶向關(guān)系對脂代謝的調(diào)控

miRNA通過與靶mRNA序列的3’-UTR區(qū)或編碼區(qū)堿基配對結(jié)合，令靶mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的合成，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的蛋白表達(dá)。最早證明miRNA能夠具有調(diào)控生物體脂代謝作用是在果蠅中，Xu等人的實驗發(fā)現(xiàn)了miR-14的缺失導(dǎo)致了果蠅體內(nèi)三?；视秃投；视秃康脑黾?。隨后Lin等人的實驗證明了在3T3L1前脂肪細(xì)胞成脂分化過程中存在著miR-27基因家族的下調(diào)的情況，并觀察到脂肪細(xì)胞中存在著miR-27的靶基因。He等人確定了miR-199a/214簇直接靶向PRDM16和過氧化物酶體PGC-1α來抑制褐色脂肪細(xì)胞的分化和米色脂肪的發(fā)育。得出miR-199a/214簇是棕色和米色脂肪發(fā)育和生熱的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子的結(jié)論，因此不難推測出，下調(diào)miR-199a/214簇有利于脂肪的沉積以及促進(jìn)脂代謝的形成。Fang等人的實驗發(fā)現(xiàn)了miR-30b/c靶向RIP140的3'非翻譯區(qū)，并且過表達(dá)的miR-30b/c會降低RIP140的表達(dá)。而RIP140作為一種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，在缺失RIP140小鼠中存在控制胰島素非依賴性葡萄糖攝取的信號通路,從而揭示了miR-30b/c在棕色脂肪細(xì)胞分化過程中顯著上調(diào),存在著促進(jìn)脂肪組織發(fā)育的作用機(jī)制。

然而，在miRNA與靶基因的靶向關(guān)系中，miRNA對脂代謝的調(diào)節(jié)并不只存在促進(jìn)作用，同樣存在著抑制作用。Fang等人通過雙熒光素酶報告實驗驗證了GPAM是miR-223的直接靶標(biāo)，并根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗得出miR-223通過靶向GPAM抑制肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的實驗結(jié)論。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α基因（C/EBPα）,對脂肪細(xì)胞分化具有重要的調(diào)控作用。C/EBPα作為miR-124-3p的靶基因，miR-124-3p可以靶向C/EBPa的3’-UTR抑制SVF脂滴的形成，從而影響綿羊SVFs的成脂分化。又有Chen等人證明了MST1是miR-183的靶點，得出miR-183通過靶向山羊乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的MST1基因來抑制乳脂代謝的結(jié)論。

miRNA并不是單一的對某一種靶基因起調(diào)控作用，而可能是多個miRNA可共同調(diào)節(jié)一個mRNA，同時一種miRNA也可調(diào)控多種mRNA。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-24會增加PPAR-γ和SREBP1的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)滴形成和甘油三酸酯積累，得出miR-24過表達(dá)會促進(jìn)3T3-L1的脂肪形成的結(jié)論，并證明了miR-24是通過直接抑制MAPK信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。而在Wang等人的實驗中，肥胖誘導(dǎo)的miR-24通過靶向SR-B1來抑制高密度脂蛋白攝取，類固醇激素合成和脂質(zhì)代謝。

2 miRNA調(diào)控脂代謝在構(gòu)建動物模型上的應(yīng)用

2.1 鼠

鼠作為一類繁殖能力強(qiáng)且生殖周期短、能夠相對穩(wěn)定地標(biāo)準(zhǔn)展示出所研究的生理或病理活動的經(jīng)濟(jì)型實驗動物，在研究基因修飾、基因組改造等方面常被選作為實驗動物模型。

Hanin等人的實驗通過將小鼠miR-132前體克隆到pTRE緊密質(zhì)粒中而產(chǎn)生的誘導(dǎo)型miR-132轉(zhuǎn)基因小鼠。驗證了由于miR-132的過表達(dá)導(dǎo)致代謝率降低以及脂解作用增強(qiáng)，導(dǎo)致肝臟異位脂肪積聚。Wu等人為研究miR-130a-3p在調(diào)節(jié)脂肪組織糖/脂代謝中的作用，構(gòu)建了miR-130a-3p敲除小鼠，同時在體外，將3T3-L1細(xì)胞用miR-130a-3p模擬物、抑制物進(jìn)行處理。實驗結(jié)果表明miR-130a敲除降低了體內(nèi)的葡萄糖耐量和胰島素敏感性，與體外細(xì)胞實驗結(jié)果保持一致。Luo等人驗證了腺病毒介導(dǎo)的miR-21的過表達(dá)降低了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表達(dá)，并抑制了原代小鼠肝細(xì)胞中葡萄糖的產(chǎn)生。實驗通過對小鼠尾靜脈注射編碼加擾序列、miR-21或miR-21海綿(Ad-spmiR-21)的腺病毒構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)模型，證明miR-21是肝臟糖異生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對于肝臟糖脂代謝轉(zhuǎn)化具有一定的參考價值。miR-320分別影響細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的不同靶基因，共同導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)超載。隨后，Zhan通過使用rAAV系統(tǒng)構(gòu)建miR-320轉(zhuǎn)基因小鼠成功抑制肝臟中的miR-320表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制miR-320可降低細(xì)胞溶膠中的miR-320水平，增加瘦素受體的翻譯，并減少新生脂肪的生成。

2.2 魚

魚類具有個體小、胚胎發(fā)育迅速、產(chǎn)卵周期短、單次產(chǎn)卵量大等特點，因此是作為體內(nèi)驗證的良好的動物模型。

Hsu等人通過產(chǎn)生表達(dá)miR-27b-SP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，使得miR-27b的表達(dá)被整體消除。實驗過程中發(fā)現(xiàn)miR-27b的缺失可以誘導(dǎo)斑馬魚幼蟲體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)的積累，從而證明了miR-27b是調(diào)節(jié)斑馬魚脂肪形成的重要脂肪生成因子。Tao等人通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和熒光素酶報告分析驗證了miR-205-5p和ACACβ基因之間的相互作用，并通過向魚的尾靜脈注射miR-205-5p拮抗劑，發(fā)現(xiàn)沉默miR-205-5p除了刺激ACACβ基因的表達(dá)，還可以影響脂肪酸合酶(FAS)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα）基因水平。而FAS、PPARα作為參與脂肪酸代謝的重要調(diào)節(jié)因子，可以通過對FAS和PPARα基因表達(dá)量的分析，研究其在脂代謝通路上的作用，從而影響甘油三酯的合成以及脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程。

2.3 兔

實驗兔是一類草食性的恒溫動物，平均壽命約8年，平均體溫為39.0 ℃，對溫度敏感，因此常被應(yīng)用于熱原試驗、生殖生理、膽固醇代謝和動脈粥樣硬化癥等研究。

Kang等人通過向患有呼吸窘迫綜合征的新生兔體內(nèi)注射慢病毒包裝的miR-200a，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-200a可以降低肺系數(shù)，并通過分別檢測過表達(dá)和抑制miR-200a的患有呼吸窘迫綜合征新生兔的β-連環(huán)蛋白和白介素-10的基因和蛋白表達(dá)水平，證明了miR-200a是通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路調(diào)節(jié)新生兔呼吸窘迫綜合征。而在Zhang等人的研究中，使用qRT-PCR分析驗證了miR-200a增加了參與脂肪生成轉(zhuǎn)錄、脂肪酸合成和脂肪酸轉(zhuǎn)運的脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，證明了miRNA-200a在促進(jìn)牦牛脂肪細(xì)胞分化中起重要作用，并推測是通過抑制非經(jīng)典Wnt信號通路發(fā)揮作用的。

3 總結(jié)和展望

文中針對miRNA調(diào)控脂代謝在構(gòu)建動物模型上的應(yīng)用僅選取了鼠、魚、兔這三類動物進(jìn)行闡述，現(xiàn)階段其余動物模型少有使用，并缺乏一定普遍性和適應(yīng)性，因此未來有望選取更多模式動物進(jìn)行驗證。除此之外在對于miRNA通路的驗證上，多數(shù)實驗是在細(xì)胞水平進(jìn)行驗證，并沒有選取合適的實驗動物進(jìn)一步驗證其分子功能，是因為實驗成本過高，實驗難度較大，故而多采用小鼠模型進(jìn)行驗證。在后續(xù)的實驗研究中仍需進(jìn)一步明確，針對性的選用家禽家畜等動物的靶向關(guān)系，以期在動物模型中驗證miRNA對靶基因的上調(diào)或者下調(diào)，從而可以對家禽家畜脂肪沉積的調(diào)控進(jìn)行驗證，有望為畜牧產(chǎn)業(yè)改善肉質(zhì)水平提供參考。

參考文獻(xiàn)：略