CRISPR/Cas9系統(tǒng)在魚類上的研究及應(yīng)用進(jìn)展

許丁凡 衛(wèi)福磊

【摘? 要】CRISPR/Cas9 技術(shù)是一種由gRNA引導(dǎo)的Cas9核酸內(nèi)切酶靶向編輯技術(shù)，已廣泛用于基因的敲除、敲入和敲降，其操作簡(jiǎn)便快速，成本低，已成為人們探究基因功能、修復(fù)受損基因、沉默有害基因以及改良經(jīng)濟(jì)物種種質(zhì)性狀的重要工具。魚類是脊椎動(dòng)物中最大的類群，許多物種對(duì)科學(xué)研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖都有價(jià)值。這篇綜述著重介紹了新一代基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9在魚類中的最新進(jìn)展和應(yīng)用，特別強(qiáng)調(diào)了它們?cè)谛詣e決定和生殖功能方面的應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】CRISPR/Cas9;性別決定;疾病模型;水產(chǎn)養(yǎng)殖

引言

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種由gRNA引導(dǎo)的Cas9核酸內(nèi)切酶靶向編輯技術(shù)，已廣泛用于基因的敲除、敲入和敲降，已成為人們探究基因功能、修復(fù)受損基因、沉默有害基因以及改良經(jīng)濟(jì)物種種質(zhì)性狀的重要工具?；蚪M編輯是基因功能反向遺傳學(xué)研究的有力工具。魚類具有多種多樣的生殖方式，養(yǎng)殖的苗種主要靠人工繁殖，因此控制性別是水產(chǎn)養(yǎng)殖增加產(chǎn)量的有效途徑。還有其他的目的需要控制魚類的性別，性別控制技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一些種類得到了應(yīng)用，它是建立在魚類性別決定與分化的生物學(xué)基礎(chǔ)上開展的。這些新出現(xiàn)的基因組編輯技術(shù)首次允許在包括高效魚類在內(nèi)的多種物種中進(jìn)行基因定位或編輯。盡管基因敲除已成為模式魚的主要反向遺傳途徑，但它往往存在特異性低、毒性高的問題。本文就CRISPR/Cas9在魚類中的研究進(jìn)展和應(yīng)用作一綜述，重點(diǎn)介紹它們?cè)谛詣e決定和生殖基因功能研究中的應(yīng)用。

1.性別決定及其分子機(jī)制

魚類的雌雄個(gè)體在生長速度、個(gè)體大小、形態(tài)顏色方面具有明顯差異，掌握魚類性別決定和分化機(jī)制，可以調(diào)控魚類向某一單向性別發(fā)育，從而創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。許多養(yǎng)殖魚類生長具有明顯的性別二態(tài)性，尼羅羅非魚雄魚比雌魚生長快。研究中采用CRISP/Cas9對(duì)非模式生物羅非魚進(jìn)行基因敲除，說明Dmrt基因?qū)τ诰拥陌l(fā)育和成熟具有重要作用。類固醇生成因子I（SF-1/NR5A1），是核受體超家族中一個(gè)調(diào)控類固醇生成，對(duì)性腺發(fā)育，性別決定與分化不可缺少的轉(zhuǎn)錄因子。利用靶向基因敲除技術(shù)產(chǎn)生sf-1突變體，F(xiàn)0代導(dǎo)致性腺發(fā)育缺陷，肥滿度增加，甚至出現(xiàn)由雌向雄的性逆轉(zhuǎn)，為羅非魚的性別控制提供了理論依據(jù)。黃顙魚是我國一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，通過對(duì)XY和YY黃顙魚精巢進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較分析，揭示了miR-141/429和靶基因相互作用在精巢發(fā)育和精子生成過程中發(fā)揮著重要作用。性或性腺分化是一個(gè)復(fù)雜的事件，其機(jī)制在硬骨魚類中尚不清楚。盡管其復(fù)雜性和可塑性，卵巢分化過程被認(rèn)為涉及性腺芳香化酶。

2.魚類疾病模型的基因組編輯

斑馬魚有兩種形式的蛋白。最近利用CRISPR/Cas9在斑馬魚中對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了突變，這兩個(gè)突變體表現(xiàn)出了人類癲癇的典型癥狀，使其成為研究疾病機(jī)制和開發(fā)治療方法的絕佳動(dòng)物模型。最近的一項(xiàng)研究利用TALEN創(chuàng)建了一個(gè)馬賽克斑馬魚突變體，在部分體細(xì)胞中敲除了腫瘤抑制因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1，導(dǎo)致腫瘤最早在3.5個(gè)月內(nèi)發(fā)生，且多發(fā)生在大腦。骨質(zhì)疏松癥是老年人的主要健康問題。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了大量骨質(zhì)疏松癥的潛在遺傳因素，包括ATP6V1H，通過CRISPR/Cas9對(duì)斑馬魚ATP6V1H同源物進(jìn)行突變，產(chǎn)生了一個(gè)突變體，表現(xiàn)出與人類骨質(zhì)疏松癥相似的表型。用MMP9和MMP13的小分子抑制劑處理突變體魚，成功地挽救了atpovlh突變體的表型。這些研究證明了魚種和基因組編輯在人類疾病建模和治療開發(fā)方面的巨大潛力。

3.基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中潛在應(yīng)用

魚類的生殖發(fā)育一直是生命科學(xué)研究的重要研究課題之一，在品種改良上具有重要意義。盡管基因組編輯仍處于起步階段，但它將在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域得到巨大的應(yīng)用。許多在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要意義的性狀都可以成為基因組編輯改進(jìn)的目標(biāo)，包括生長和繁殖性能、抗病性、飼料轉(zhuǎn)化效率和對(duì)環(huán)境脅迫因素的耐受性。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，為了控制家魚和轉(zhuǎn)基因魚的逃逸，通常希望實(shí)現(xiàn)無菌化。研究表明，基因組編輯在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用于培育有價(jià)值性狀的新品種的潛力巨大。編碼黑色素產(chǎn)生酶酪氨酸酶的基因是該方法發(fā)展和評(píng)價(jià)的最初目標(biāo)。CRISPR極大地提高了我們直接研究小魚中基因功能的能力，為AOP的驗(yàn)證和開發(fā)提供了先進(jìn)的方法。

4.結(jié)語

隨著基因組編輯在模型魚種和具有重要經(jīng)濟(jì)意義的魚種中的高效應(yīng)用，我們現(xiàn)在正進(jìn)入一個(gè)時(shí)代，這些強(qiáng)大的技術(shù)將在廣泛的魚種中得到爆炸性的應(yīng)用，以研究基因功能或創(chuàng)造具有特殊特性的新的轉(zhuǎn)基因染色體?；蚪M編輯在魚類模型中越來越受歡迎，部分原因是由于魚類物種的生物學(xué)和技術(shù)優(yōu)勢(shì)。隨著這些技術(shù)在各種魚類模型上的成熟，預(yù)計(jì)它們將在水產(chǎn)養(yǎng)殖中找到更多的應(yīng)用，用于改善具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的性狀，如生長和抗病性，在環(huán)境科學(xué)中用于監(jiān)測(cè)干擾特定生理事件和途徑的污染物，以及在生物醫(yī)學(xué)中用于疾病建模和藥物篩選。作為生物多樣性最豐富的脊椎動(dòng)物群體，基因組編輯技術(shù)在魚類物種中的獲得和應(yīng)用將為基因功能及其在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化提供巨大的信息和啟示。

通訊作者：衛(wèi)福磊

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