miRNA對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展

胡志剛，曹俊婷，張建勤，張慧林，劉小林

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

骨骼肌占脊椎動(dòng)物體質(zhì)量的40%～60%，對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)和代謝平衡很重要。肉類產(chǎn)量和質(zhì)量是畜禽養(yǎng)殖業(yè)考慮的重要因素。隨著人們對(duì)肉產(chǎn)品需求的不斷增加，畜禽的研究主要集中在提高肌肉生長(zhǎng)速度、肌肉質(zhì)量和產(chǎn)量等方面。除營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素外，畜禽的遺傳也是決定骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。在肌肉形成的過程中，肌源性前體細(xì)胞遷移到肌肉形成的適當(dāng)部位(如四肢)后開始增殖。之后肌肉前體細(xì)胞退出細(xì)胞周期，融合形成肌管進(jìn)而形成多核肌纖維。動(dòng)物肌肉產(chǎn)量在很大程度上取決于肌纖維的增生和肥大，而這些復(fù)雜的發(fā)育過程依賴于精確的時(shí)空網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)在多個(gè)水平上調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，包括mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和降解等。MicroRNA(miRNA)參與生物發(fā)育和代謝的各個(gè)方面，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡等發(fā)育調(diào)控機(jī)制。miRNA通過識(shí)別位于靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′ UTR)中的特異性互補(bǔ)序列，在很大程度上抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)(包括mRNA降解，抑制翻譯起始和延伸)[1]。

1 肌肉的形成機(jī)制

骨骼肌起源于哺乳動(dòng)物和鳥類的肌節(jié)。早期的胚胎肌纖維形成發(fā)生在不同的階段，即脊椎動(dòng)物要經(jīng)歷3次肌生成(胚胎期、胎兒期和成年期)，才能形成最終成熟的肌肉。胚胎期肌生成產(chǎn)生身體的第1個(gè)肌肉纖維(初級(jí)纖維)，其作用是定義肌肉的類型、形狀或位置，但不決定肌肉質(zhì)量。在胎兒期肌生成過程中，胎兒成肌細(xì)胞融合并產(chǎn)生圍繞初級(jí)纖維的次級(jí)纖維(胎兒纖維)。次級(jí)纖維的形成對(duì)成熟肌肉中肌纖維的數(shù)量有很大的影響[2]。成年期的肌發(fā)生過程與肌肉再生有關(guān)，即在沒有損傷的情況下，個(gè)體在出生后不會(huì)形成新的肌纖維，肌肉質(zhì)量的增加主要是由于肌纖維變粗變長(zhǎng)所致[3]。位于肌纖維基膜和質(zhì)膜之間的肌源性細(xì)胞，即衛(wèi)星細(xì)胞(satellite cells,SCs)，是動(dòng)物出生后影響肌肉肥大和再生的主要因素。

骨骼肌的形成和再生是一個(gè)復(fù)雜且受調(diào)控的過程，涉及肌肉前體細(xì)胞的激活、增殖和分化，并且肌生成過程受到生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子的時(shí)空調(diào)控。肌肉祖細(xì)胞定向分化為成肌細(xì)胞的過程，需要經(jīng)過增殖、分化并融合形成多核肌管，最終形成成熟的肌纖維。生肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)主要調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖和分化，最終形成成熟的骨骼肌細(xì)胞。在肌肉成熟后，肌肉祖細(xì)胞進(jìn)入靜止期，形成SCs。肌肉祖細(xì)胞的特征是表達(dá)Pax3(paired box 3)和Pax7(paired box 7)，其中Pax3調(diào)控MRFs的轉(zhuǎn)錄，并在胚胎發(fā)育早期促進(jìn)細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化[4]。Pax7是動(dòng)物出生后肌肉發(fā)育的標(biāo)記基因，通過與細(xì)胞生長(zhǎng)，黏附等相關(guān)的特定基因結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其分化。在胚胎期，Pax7參與SCs的增殖并將其融合為肌管，同時(shí)也促進(jìn)動(dòng)物出生后肌纖維的肥大。畜禽出生后肌纖維的數(shù)目不再增加，但肌纖維會(huì)變粗增長(zhǎng)，這是DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯增加的直接結(jié)果，即蛋白質(zhì)合成的增加。為了獲得更多蛋白質(zhì)合成，就要求細(xì)胞核數(shù)量增多，此時(shí)位于肌纖維細(xì)胞膜和基膜之間的SCs發(fā)揮了重要作用。SCs分裂后與相鄰的肌纖維相互融合，提供細(xì)胞核。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成率高于降解率時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致肌纖維的肥大，從而增加肌肉的產(chǎn)量。

2 miRNA作用機(jī)制

miRNA是單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA最初由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的初級(jí)pri-miRNA轉(zhuǎn)錄物，然后通過包含Drosha和DGCR8/Pasha的多蛋白復(fù)合物處理形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體pre-miRNA。pre-miRNA被核輸出因子Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，由RNase Dicer裂解成約22 nt的雙鏈miRNA中介體。隨后其中1條鏈在解旋酶的作用下解鏈，最終形成單鏈的miRNA。miRNA分子與Argonaute蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，沉默特定的miRNA靶基因。基因沉默是由堿基配對(duì)產(chǎn)生的，即miRNA與靶基因的作用大多是靶向作用在目標(biāo)基因的3′UTR上，引起下游基因的翻譯抑制(不完全匹配)或使靶mRNA降解(完全配對(duì))[5]。

3 miRNA對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控

在胚胎期肌生成過程中，Dicer的特異性失活會(huì)引起圍產(chǎn)期致死率、肌肉質(zhì)量降低和肌纖維形態(tài)異常，這使得miRNA成為胚胎肌肉發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]。3種肌肉特異性miRNA：miR-1、miR-133和miR-206在調(diào)節(jié)肌生成過程中起著關(guān)鍵作用。miR-1和miR-133聚集在同一個(gè)染色體位點(diǎn)上并一起轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步加工會(huì)產(chǎn)生2個(gè)獨(dú)立成熟的miRNA，但它們?cè)诠趋兰≡鲋澈头只械淖饔媒厝徊煌iR-133通過抑制血清反應(yīng)因子(SRF)促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，而miR-1通過靶向抑制組蛋白去乙?；?(HDAC4)促進(jìn)肌生成[7]。miR-206還通過靶向抑制DNA聚合酶α亞基(Pola1)、連接蛋白43(Cx43)、卵泡抑素樣1(Fstl1)和促性腺激素(Utrn)的表達(dá)來抑制DNA的合成，促進(jìn)細(xì)胞周期的退出和最終肌細(xì)胞的分化[8-10]。miR-181通過靶向成肌細(xì)胞終末分化的抑制因子Hox-A11，參與MyoD的誘導(dǎo)和肌肉標(biāo)志物的表達(dá)[11]。此外，miR-214、miR-208、miR-195和miR-29等在肌肉中特異性、非特異性或暫時(shí)性表達(dá)，并參與骨骼肌或心肌細(xì)胞的增殖或分化[12-15]。同樣，miR-26a、miR-322、miR-424、miR-378、miR-486和miR-503能加速成肌細(xì)胞肌管的形成和肌源性標(biāo)記物的表達(dá)。目前，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的畜禽骨骼肌miRNA及其下游靶基因被鑒定出來，并從個(gè)體或細(xì)胞水平研究其功能。

3.1 miRNA調(diào)控家畜肌肉生長(zhǎng)發(fā)育miR-133和miR-206作為最常見的調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的miRNA，其調(diào)控作用已在牛肌肉中得到證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)miR-133b能促進(jìn)牛骨骼肌SCs的增殖[16]，而miR-206對(duì)牛骨骼肌SCs有促進(jìn)分化的作用[17]。在多種組織中都廣泛表達(dá)的miR-181a能促進(jìn)牛骨骼肌SCs的分化[18]。miR-2425靶向調(diào)節(jié)RAD9A和MYOG，進(jìn)而促進(jìn)牛骨骼肌SCs的增殖，并抑制其分化[19]。此外，魏雪峰[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-378a-3p通過靶向HDAC4來調(diào)控牛肌細(xì)胞的增殖、分化及凋亡；miR-107通過調(diào)控靶基因Wnt3a來抑制牛肌細(xì)胞的增殖和分化。張偉偉[21]構(gòu)建了不同階段牛骨骼肌SCs分化的差異miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控MyoG基因的miRNA有65個(gè)，其中miR-2400是牛中特異表達(dá)的miRNA，其負(fù)調(diào)節(jié)MyoG的表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌SCs的增殖。王軼敏[22]篩選得到15個(gè)牛肌肉SCs成肌分化過程中顯著差異表達(dá)的miRNA，其中miR-1、miR-206、miR-128、miR-133a、miR-133b、miR-143、miR-145、miR-193b、miR-139、miR-378、miR-378b、miR-378c上調(diào)表達(dá)，miR-222、mi R-335和miR-376e下調(diào)表達(dá)。孫加節(jié)[23]利用深度測(cè)序的方法鑒定了胚胎期90，200 d，出生后5 d，12月齡及24月齡秦川牛背部肌肉miRNA表達(dá)規(guī)律，共發(fā)現(xiàn)510個(gè)miRNA，其中有263個(gè)miRNA在5個(gè)時(shí)期都表達(dá)；同時(shí)在秦川牛肌肉組織中共預(yù)測(cè)得到125個(gè)新的miRNA，其中4個(gè)在5個(gè)時(shí)期中都表達(dá)。有14個(gè)miRNA在出生后肌肉組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，而有22個(gè)miRNA在出生前肌肉組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。

有研究表明，miR-1和miR-133在山羊心臟和背最長(zhǎng)肌中高表達(dá)，在其他組織中低表達(dá)。并且山羊骨骼肌中miR-1的表達(dá)隨著個(gè)體的發(fā)育開始減少，而miR-133的表達(dá)則顯著增加。此外，miR-1和miR-133通過負(fù)調(diào)控靶基因HDAC4和SRF對(duì)山羊骨骼肌發(fā)育進(jìn)行調(diào)控[24-25]。宋廣超等[26]研究了miR-133前體在不同綿羊骨骼肌中的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綿羊miR-133前體序列的SNP(g.54047535)位點(diǎn)可能影響miR-133前體的加工和成熟，從而影響綿羊的產(chǎn)肉性能。為研究綿羊骨骼肌中miRNA的表達(dá)情況，ZHAO等[27]在綿羊骨骼肌中檢測(cè)到2 396 個(gè)miRNA。其中，miR-192的過表達(dá)能顯著抑制SCs的肌源性分化，促進(jìn)SCs的增殖。相反，抑制miR-192的表達(dá)則促進(jìn)SCs的分化并抑制SCs的增殖。此外，miR-192靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1(RB1)起作用，而RB1是一種已知的肌生成調(diào)節(jié)因子。

楊雪梅等[28]探究miRNA與豬肌肉品質(zhì)的調(diào)控關(guān)系，研究結(jié)果表明miR-1、miR-27a、miR-369、miR-378在藏豬、成華豬、雅南豬、丫杈豬、青峪豬、內(nèi)江豬和烏金豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)相似，4種miRNA均正調(diào)控豬肉品質(zhì)，負(fù)調(diào)控豬胴體品質(zhì)。劉曉琴[29]研究發(fā)現(xiàn)miR-378通過抑制BMP2和MAPK1的表達(dá)來調(diào)控豬骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。王曉燕[30]的研究證實(shí)miR-499-5P能抑制Sox6的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)豬骨骼肌慢肌纖維的形成。與此相同的是，miR-208b和miR-499已被證實(shí)具有促進(jìn)氧化型肌纖維的形成，抑制酵解型肌纖維形成的作用[31]。王言等[32]研究了miRNA的表達(dá)與豬背最長(zhǎng)肌肉質(zhì)風(fēng)味的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-23a、miR-151與豬肉品質(zhì)正相關(guān)，而miR-199a、miR-299和miR-497與豬胴體品質(zhì)正相關(guān)。目前，通過高通量測(cè)序鑒定出越來越多豬肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA，不僅豐富了豬肌肉miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，也為深入了解其功能提供了研究基礎(chǔ)。不同豬種間miRNA的表達(dá)存在差異，SHENG等[33]分析了大白豬和民豬在出生后60，120，150，180 和210 d背最長(zhǎng)肌的miRNA，共鑒定出734個(gè)miRNA，包括308個(gè)有注釋的miRNA和426個(gè)新的miRNA，其中307個(gè)miRNA被認(rèn)為是豬特有的。孫瑞萍等[34]比較分析了1月齡五指山豬與長(zhǎng)白豬骨骼肌的miRNA，共獲得318個(gè)己知豬的miRNA，其中五指山豬鑒定出312個(gè)已知 miRNA和83 個(gè)新的miRNA，長(zhǎng)白豬鑒定出306個(gè)已知 miRNA和88個(gè)新的miRNA。此外，發(fā)現(xiàn)的17個(gè)差異顯著的miRNA中16個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，1個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。

3.2 miRNA對(duì)家禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控let-7在組織器官發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。岳孝亭等[35]發(fā)現(xiàn)let-7b通過靶向調(diào)控IGF2BP3的表達(dá)來影響IGF2的轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定和遷移，進(jìn)而影響雞成肌細(xì)胞的增殖。LUO等[36]研究結(jié)果表明miR-203在第10～16天(E10～E16)的雞胚骨骼肌中會(huì)短暫上調(diào)，而在E16之后miR-203的表達(dá)急劇下調(diào)甚至不表達(dá)。此外，miR-203的過表達(dá)會(huì)抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化，而其功能的喪失則促進(jìn)了成肌細(xì)胞的增殖和分化。c-JUN和MEF2C對(duì)細(xì)胞增殖和肌肉發(fā)育起重要作用，在肌生成過程中，miR-203可以靶向并抑制c-JUN和MEF2C的表達(dá)。有研究表明gga-miR-206在金茅黑雞肌肉發(fā)育中是顯著上調(diào)基因。婁秋宏[37]研究表明金茅黑雞腿肌中g(shù)ga-miR-206的表達(dá)呈先升后降的趨勢(shì)，在胚胎第16天時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，隨后開始下降并在出生后又有所回升；胸肌中g(shù)ga-miR-206的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在胚胎第10天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，并在第16天時(shí)出現(xiàn)一個(gè)小高峰。為進(jìn)一步探尋蛋雞和肉雞miRNA的表達(dá)差異，LI等[38]對(duì)肉雞和蛋雞骨骼肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定了33個(gè)新的和189個(gè)已知的雞miRNA。其中17個(gè)miRNA在肉雞和蛋雞之間存在差異表達(dá)，且這些miRNA的許多靶點(diǎn)與肌生成調(diào)控有關(guān)。WATCHARAPONG等[39]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(37.8℃)相比，在38.8℃條件下，胚胎期第7～10天雞胸肌中miR-133的上調(diào)以及腿肌中miR-199a-5p、miR-1915和miR-638的下調(diào)在功能上與肌生成和體型有關(guān)。雞胚胎期第10～13天，在36.8℃下孵化會(huì)導(dǎo)致與增殖和分化相關(guān)的let-7、miR-93和miR-130c的下調(diào)。高劍[40]發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)數(shù)目在藏雞胚胎期隨時(shí)間而逐漸遞減，出殼后miRNA的表達(dá)數(shù)目趨于平穩(wěn)。

不同生長(zhǎng)階段鴨肌肉的miRNA數(shù)量存在差異。GU等[41]分析了胚胎第13，19和27天北京鴨胸肌中miRNA的分布，共獲得382個(gè)miRNA，包括359個(gè)已鑒定的miRNA和23個(gè)新的miRNA，并且發(fā)現(xiàn)北京鴨miRNA高度保守。let-7參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，徐鐵山等[42]研究發(fā)現(xiàn)let-7-5p在北京鴨孵化第11～27天胸肌中的表達(dá)逐漸增加，其靶基因GO中的許多條目與骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)。李欣欣[43]的研究表明miR-33a能通過靶向調(diào)控IGF-1、FST和CCND1的表達(dá)以及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來抑制鴨成肌細(xì)胞增殖。吳寧昭[44]研究發(fā)現(xiàn)miR-1通過靶向調(diào)控HDAC4來促進(jìn)鴨成肌細(xì)胞的分化，miR-133則通過調(diào)節(jié)SRF、TGFBR1的表達(dá)來促進(jìn)鴨成肌細(xì)胞増殖。

3.3 miRNA對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控miRNA對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。miR-1和miR-133能促進(jìn)斑馬魚肌肉基因的表達(dá)并調(diào)節(jié)肌節(jié)肌動(dòng)蛋白[45]。DURAN等[46]的研究結(jié)果表明miR-1和miR-206調(diào)控Pacu(一種魚類)成肌細(xì)胞的分化，而miR-133調(diào)控這些細(xì)胞的增殖。miR-499在慢肌肌肉中高度表達(dá)，表明其參與了慢肌肌纖維表型的鑒定。YAN等[47]在鯉魚骨骼肌中鑒定出188個(gè)保守的miRNA和7個(gè)新的miRNA，其中miR-1、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-133a-3p、miR-206、miR-214和miR-222在鯉魚骨骼肌發(fā)育過程中差異表達(dá)。CHU等[48]和張方亮[49]從中國(guó)鱸魚和鱖魚慢肌和快肌中分別篩選得到199和59個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miR-103和miR-144分別負(fù)調(diào)控快肌和慢肌中SmyD1a和SmyD1b的表達(dá)，從而影響中國(guó)鱸魚和鱖魚肌肉的發(fā)育和性能。ZHAO等[50]研究發(fā)現(xiàn)miR-181b-5p通過降低羅非魚MSTNb的表達(dá)來促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)。

4 展望

miRNA可以通過介導(dǎo)mRNA的降解或抑制翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)，已成為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要參與者。在肌肉發(fā)育方面，miRNAs通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生物學(xué)的重要過程，包括細(xì)胞增殖、分化、干細(xì)胞更新和維持等。盡管在過去的十幾年中關(guān)于miRNA已經(jīng)取得了許多重要的發(fā)現(xiàn)，但是由于轉(zhuǎn)錄因子、miRNA和它們的靶基因之間存在多種可能的相互作用，目前對(duì)miRNA在動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的作用的認(rèn)識(shí)仍然相當(dāng)有限。未來的研究需要集中于鑒定、表征miRNA在脊椎動(dòng)物肌肉發(fā)育功能，預(yù)測(cè)和驗(yàn)證其下游的靶基因，研究其具體的作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路。隨著對(duì)miRNA研究的深入，對(duì)定向提高家養(yǎng)動(dòng)物肌肉產(chǎn)量、生長(zhǎng)發(fā)育速度和肉品質(zhì)質(zhì)量方面有著十分重要的意義。