慢病毒載體系統(tǒng)研究及應(yīng)用進(jìn)展

張 慧，曹勝亮，劉思當(dāng)

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

慢病毒(lentivirus)是一種具有特殊性質(zhì)的病毒，致病過程緩慢，能將自身致病基因整合到宿主基因組中，且在宿主表現(xiàn)臨床癥狀前能潛伏感染數(shù)年之久?？蒲腥藛T利用這種天然優(yōu)勢，開發(fā)了慢病毒載體(lentiviral victors，LVs)。慢病毒載體是一種經(jīng)過基因改造的病毒載體，在剔除慢病毒致病因子的同時，保留其基因組能整合到宿主基因組的能力，可攜帶各種外源性基因或改造基因整合至宿主染色體中達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的目的[1]。最初慢病毒多感染淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，現(xiàn)經(jīng)改造后可感染神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、腦細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。目前，慢病毒載體作為生物疾病研究中的重要載體，被廣泛運用在腫瘤治療、基因調(diào)控、通路研究、免疫等各個領(lǐng)域。

1 慢病毒載體分類及結(jié)構(gòu)組成

1.1 慢病毒載體分類目前使用的慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族，包括早期的人Ⅰ型、Ⅱ 型免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ、HIV-Ⅱ)載體，以及后期不同種屬的猿類免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)載體、貓免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus,FIV)載體、馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)載體、山羊類關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)載體、牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency birus,BIV)載體等。不同種屬載體的出現(xiàn)意味著針對相應(yīng)動物疾病的研究增加了更多選擇，也能有效提高感染效率和成功率。

1.2 慢病毒基因組結(jié)構(gòu)慢病毒基因組結(jié)構(gòu)與逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)組成相同，包括gag、pol、env基因及3′和5′LTR，其中g(shù)ag編碼核心結(jié)構(gòu)蛋白，pol編碼整合到宿主細(xì)胞基因組過程中所需的酶，env編碼包膜蛋白，LTR包含順式作用元件及病毒包裝信號[2]。以應(yīng)用最早、最廣泛的HIV載體為例， HIV核心蛋白由gag和pol基因編碼，gag編碼病毒衣殼(CA)、病毒基質(zhì)(MA)、病毒核衣殼(NC)，pol編碼蛋白則水解成3種病毒酶：蛋白酶(PR)、病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和病毒整合酶(IN)，共同構(gòu)成病毒核心成分。env基因編碼gp160前體蛋白，被加工切割為gp120亞基和gp40三聚體，構(gòu)成病毒的脂質(zhì)外膜衣殼。在許多情況下，在載體中env基因編碼蛋白功能會被另一種蛋白質(zhì)取代，以擴(kuò)展載體的取向性。除此之外病毒基因組還編碼調(diào)節(jié)蛋白Tat和Rev，它們分別激活病毒轉(zhuǎn)錄并控制病毒轉(zhuǎn)錄物的剪接和核輸出[3]。另外4個基因編碼輔助蛋白Vif、Vpr、Vpu和Nef，這些產(chǎn)物是HIV在體內(nèi)感染所必需的[4]。

2 慢病毒載體發(fā)展歷程

慢病毒載體系統(tǒng)最初是通過提取人類免疫缺陷病毒(HIV)基因組，并在其中添加反式的HIV多蛋白來構(gòu)建的[5]，最早用于篩選HIV的治療藥物及靶向位點，后來在保證科研安全的前提下，被用于基因改造研究。該系統(tǒng)構(gòu)建的基本原則是刪除病毒的毒力基因，將負(fù)責(zé)病毒顆粒包裝的反式作用元件、病毒包裝信號等分離，并使其具有攜帶外源基因的能力。

慢病毒發(fā)展到今日共經(jīng)歷了4代轉(zhuǎn)變。第1代慢病毒以HIV為基礎(chǔ)，保留了基本基因結(jié)構(gòu)，為避免病毒粒子進(jìn)行自我包裝，將3′LTR、U3區(qū)的增強(qiáng)子和啟動子序列刪除，使病毒本身的LTR啟動子轉(zhuǎn)錄失活，但是不足之處是這種慢病毒滴度較低，且由于其識別位點受限主要侵襲CD4+細(xì)胞。第2代慢病毒載體將其包膜蛋白經(jīng)過改造，由水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白代替，能夠識別一種廣泛膜受體-低密度脂蛋白受體(LOL)，促進(jìn)病毒內(nèi)吞，使慢病毒能夠輕松進(jìn)入多種細(xì)胞中，同時病毒滴度可增至1 000 倍，擴(kuò)大了慢病毒的適用范圍。第3代慢病毒載體在第2代的基礎(chǔ)上刪除了輔助基因vif、vpr、vpu和nef，進(jìn)一步提高了安全系數(shù)。第4代慢病毒載體是目前應(yīng)用最廣、最成熟的慢病毒系統(tǒng)，組裝構(gòu)建過程分為四質(zhì)粒部分，其中慢病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒部分?jǐn)y帶需要轉(zhuǎn)入的基因片段，另外3個質(zhì)粒(pMDL、pRev和pVSVG)則負(fù)責(zé)提供包裝所需的反式作用因子。質(zhì)粒pMDL編碼Gag-Pol前體蛋白，最終被加工成整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和結(jié)構(gòu)蛋白；pRev與轉(zhuǎn)移載體中的順式作用元件(RRE)相互作用，增強(qiáng)未經(jīng)酶切的全長基因組轉(zhuǎn)錄本的輸出；在病毒包膜中存在VSVG使病毒顆粒具有轉(zhuǎn)化多種細(xì)胞類型的能力[6]。通過將這4個質(zhì)粒混合后轉(zhuǎn)入同一細(xì)胞表達(dá)株內(nèi)進(jìn)行包裝，最終獲得表達(dá)完整的慢病毒載體。同時該載體系統(tǒng)中進(jìn)一步剔除了活性 LTR、Tat 或輔助蛋白，長末端重復(fù)序列的增強(qiáng)子或啟動子也被刪除，轉(zhuǎn)而添加土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)，在顯著增加生物安全性的同時提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[7]。

3 慢病毒載體系統(tǒng)的應(yīng)用

將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中涵蓋多種方法，包括熱激、磷酸鈣、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、基因槍等，但這些方法都具有一定的局限性。慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，可攜帶的基因片段大(>9 kDa)，能夠感染分裂期與非分裂期的多種細(xì)胞，且能實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達(dá)[8]。隨著目前表達(dá)載體的多樣化及可改造性，在研究中得到了廣泛的應(yīng)用，為科研提供了便利。

3.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系慢病毒載體能侵染各類細(xì)胞，且可攜帶熒光標(biāo)記等信號，是構(gòu)建細(xì)胞系的常用有效載體。利用慢病毒作為載體，篩選出的細(xì)胞系除了為科研提供基礎(chǔ)試驗材料，也具有重要的臨床應(yīng)用價值。例如，可以分析基因的潛在功能，科研人員利用慢病毒載體將脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)導(dǎo)入小尾寒羊成纖維細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)該基因能夠顯著提高肉質(zhì)，可以作為轉(zhuǎn)基因肉羊候選基因[9]；可篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞并導(dǎo)入體內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記示蹤，追蹤細(xì)胞及胚胎發(fā)育分化過程，目前在人、豬、兔、馬屬動物等多種細(xì)胞中均有開展應(yīng)用[10-12]；使用人抗病毒基因MxA重組慢病毒感染的雞精原干細(xì)胞，移植至受體后能夠繼續(xù)分化為精子，最后利用體外授精技術(shù)可以進(jìn)一步獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因雞[13]。

3.2 疾病治療

3.2.1RNA干擾技術(shù) RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是一種小分子雙鏈RNA介導(dǎo)的分子沉默機(jī)制，可以高效下調(diào)目的基因表達(dá)，是抗病毒治療的新手段。慢病毒載體作為RNAi研究的有效輔助手段，可以感染各種分裂時期細(xì)胞并實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。在了解病毒毒力蛋白的基礎(chǔ)上，以慢病毒為載體構(gòu)建靶向某個病毒致病基因位點的shRNA 進(jìn)行細(xì)胞試驗或動物回歸試驗，通過檢測mRNA復(fù)制水平及病毒滴度測定等方法可以確定基因沉默效果及對病毒復(fù)制能力的抑制情況。楊少華等[14]在雞胚成纖維細(xì)胞和SPF雞胚中進(jìn)行干擾試驗，確定了抑制 NDV增殖的shRNA 靶點RNAi-341和RNAi-671；齊興才等[15]以O(shè)N株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作為靶基因，初步篩選了2個最佳抑制位點能夠降低口蹄疫病毒的復(fù)制效率。

3.2.2靶基因及通路篩選 病毒侵襲宿主需要特定受體位點識別，并與靶基因相互作用激活信號傳遞、物質(zhì)代謝、周期調(diào)控等復(fù)雜信號通路，利于病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制生存，因此找到靶基因可為病毒疾病治療提供了一條新思路。慢病毒載體體系表達(dá)率高，可攜帶基因片段較長，極少誘發(fā)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，是篩選靶基因的理想表達(dá)載體。例如在腫瘤疾病研究中，信號靶點是研究熱點，利用慢病毒體系進(jìn)行信號靶點的篩選省時省力。張名媛等[16]構(gòu)建以廣西巴馬小型豬為模型動物的miR-148b慢病毒表達(dá)載體，利用軟件輔助對其作用靶基因及相關(guān)通路進(jìn)行了預(yù)測分析，為后續(xù)的功能研究及miRNA腫瘤治療藥物開發(fā)等提供理論指導(dǎo)。

3.2.3基因治療 基因治療是指將外源基因?qū)爰?xì)胞中，糾正或彌補(bǔ)由于基因缺陷所造成的疾病。導(dǎo)入的外源基因主要分為正?；?、治療基因和“自殺基因”[17]。轉(zhuǎn)入正常基因或是能夠發(fā)揮正常功能的該基因片段，可以彌補(bǔ)先天性的基因缺失從而發(fā)揮治療作用，主要用于各類遺傳病的治療；而治療基因主要是指轉(zhuǎn)入對疾病具有明顯治療效果的靶基因，例如在小鼠慢性糖尿病疾病模型中，利用慢病毒載體在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入攜帶熱休克蛋白90α功能性F-5基因，可以減少慢性創(chuàng)面愈合時間，加快組織修復(fù)[18]；“自殺基因”主要指胞嘧啶脫氨酶基因(CD)和編碼胸苷激酶的基因(TK)，可催化無毒的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒物質(zhì)，殺死受體細(xì)胞。家婷等[19]構(gòu)建HSV-TK/CD20雙自殺基因系統(tǒng)慢病毒載體，靶向誘導(dǎo)人外周血T細(xì)胞實現(xiàn)自我清除，為消除過度免疫治療產(chǎn)生的不良反應(yīng)提供可控性。

3.3 疫苗研發(fā)當(dāng)疾病發(fā)生時，疫苗免疫防控是避免其大規(guī)模流行的有效方式，在人及動物傳染病預(yù)防治療中均發(fā)揮重要作用。早期，研究人員發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒具有基因組整合能力，都是有效的病毒載體，相比之下，慢病毒載體能感染非分裂細(xì)胞，也無需直接靶向致病性抗原，可用于抑制自身免疫性疾病，是更加理想的載體[20]。成功接種疫苗的一個標(biāo)志是誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的記憶性T細(xì)胞反應(yīng)，慢病毒載體具有持續(xù)高水平的抗原表達(dá)能力，產(chǎn)生大量功能分化的效應(yīng)記憶T細(xì)胞，更利于控制類似HIV等早期感染病毒[21]。與廣泛使用的腺病毒載體相比，剔除整合特性的缺陷型整合慢病毒載體主要的靶細(xì)胞是不分裂樹突狀細(xì)胞(DC)的，規(guī)避了插入突變的安全性問題，為治療性疫苗接種提供了巨大的潛力，提示在大規(guī)模預(yù)防性疫苗接種中使用的可能性[22]。國外針對猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)及人艾滋病(AIDS)等已都進(jìn)行了成熟的慢病毒疫苗研發(fā)及機(jī)制研究[23-25]。馬傳染性貧血病毒(EIAV)減毒疫苗是國內(nèi)首次成功應(yīng)用的慢病毒疫苗，通過對減毒活疫苗株多個基因的多重突變減弱其致病力，使用該疫苗進(jìn)行的大規(guī)模免疫接種對中國馬傳染性貧血疾病的預(yù)防和控制做出了巨大貢獻(xiàn)[26]。

3.4 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物是分子生物學(xué)的拓展研究領(lǐng)域，也是生命科學(xué)研究領(lǐng)域重要的輔助科研手段。1978年美國科學(xué)家利用胚胎注射技術(shù)將生長激素導(dǎo)入小鼠受精卵獲得了世界首例轉(zhuǎn)基因動物，之后體細(xì)胞移植法生產(chǎn)的克隆羊“多利”使轉(zhuǎn)基因動物走進(jìn)了大眾視野。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展至今已有顯微注射技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、體細(xì)胞核移植法等多種成熟的技術(shù)方法[27]，其中以慢病毒作為載體，利用顯微注射技術(shù)將外源基因?qū)雱游锱咛ブ锌梢燥@著提高目的基因穩(wěn)定表達(dá)率，甚至可以實現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳性狀，降低轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)成本，吸引科研學(xué)者在豬、牛、羊等多種動物體中開展以該方法為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因動物試驗。鼠是人類疾病研究的首選模型動物，借助慢病毒載體生產(chǎn)特定組織轉(zhuǎn)基因鼠也是最常見的技術(shù)手段。對于鼠、豬、牛等哺乳動物，通過向未發(fā)育的受精卵卵周隙注射慢病毒載體顆粒再植入代孕母體子宮的方法，最終能夠獲取需要的轉(zhuǎn)基因動物[28]。而禽類技術(shù)相對較復(fù)雜，需要在卵殼膜氣室上面開1 m3小窗，將病毒液直接注射到卵黃上、下膜層之間，將卵殼膜使用透氣膠帶封口，放入孵化箱至破殼孵出[29]。一般注射使用的慢病毒表達(dá)載體會攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等標(biāo)記物便于后期進(jìn)行陽性動物篩選。

3.5 生物反應(yīng)器在漫長的生物研究中，人們發(fā)現(xiàn)可以利用生物載體自身的代謝和繁殖系統(tǒng)來大量生產(chǎn)需要的蛋白產(chǎn)物，所利用的生物載體被稱為“生物反應(yīng)器”。最初人們利用細(xì)菌和細(xì)胞作為反應(yīng)器，但細(xì)菌生產(chǎn)的蛋白不具有生物活性，而細(xì)胞培養(yǎng)成本較高，使應(yīng)用受限。隨著轉(zhuǎn)基因動物的研究，人們發(fā)現(xiàn)動物飼養(yǎng)成本低，并且能產(chǎn)生大量具有活性的目的蛋白，是理想的生物反應(yīng)器。因此，衍生出乳腺、血液、雞輸卵管等相關(guān)生物反應(yīng)器[30-32]。慢病毒載體以其穩(wěn)定性、高效率、基因整合的天然優(yōu)勢成為構(gòu)建生物反應(yīng)器的首選工具，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物還能夠形成穩(wěn)定的后代遺傳性狀，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 展望

慢病毒載體系統(tǒng)的出現(xiàn)，推動了疾病研究進(jìn)展，也加速了優(yōu)良畜禽的篩選進(jìn)程，推動了生物技術(shù)的發(fā)展。但目前慢病毒載體在轉(zhuǎn)染過程中仍存在病毒滴度過低，潛在的生物毒性等缺點，限制了臨床應(yīng)用。如何進(jìn)行優(yōu)化，使慢病毒載體更加穩(wěn)定，更好地與現(xiàn)有試驗技術(shù)相結(jié)合為動物研究服務(wù)將是日后關(guān)注的重點。