花生分子育種研究進展

藺儒俠 郭鳳丹 王興軍 夏 晗 侯 蕾

（1山東師范大學生命科學學院，250014，山東濟南；2山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，250100，山東濟南）

花生是世界范圍內(nèi)重要的油料作物和經(jīng)濟作物。近年來，花生全基因組測序的完成促進了分子標記的開發(fā)利用和關(guān)鍵農(nóng)藝性狀連鎖QTL的鑒定，加速了轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良花生品種的進程，標志著分子育種已經(jīng)成為花生新品種培育的重要技術(shù)手段之一。本文概述了近年來花生分子育種的研究進展，并對現(xiàn)代分子生物學和生物技術(shù)在花生育種方面存在的主要問題和應用前景進行了討論。

1 花生分子標記的開發(fā)

分子標記是分子輔助選擇和設(shè)計育種的基礎(chǔ)，近年來花生中大量的分子標記被開發(fā)出來，為花生分子育種提供了便利條件。Zhao等[1]以二倍體野生種花生基因組為參考序列，分別從A和B基因組中鑒定出135 529和199 957個SSR位點，并分別構(gòu)建了花生A和B基因組的物理圖譜。Zhong等[2]對花生果針不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，挖掘出5058個SSR標記，利用其中的200個SSR標記對22個花生品種進行多態(tài)性分析，篩選出17個具有多態(tài)性的SSR標記。徐志軍等[3]根據(jù)花生栽培種RNA-Seq數(shù)據(jù)，鑒定出19 143個SSR位點，其中13 477個SSR位點可用于分子標記開發(fā)。

在高通量和低成本測序技術(shù)的推動下，包括測序基因分型（genotyping-by-sequencing，GBS）、限制性位點關(guān)聯(lián)的 DNA測序技術(shù)（restriction-site associated DNA，ddRAD-seq）和特異位點擴增片段測序（specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）等簡化基因組測序技術(shù)也逐漸應用到花生分子標記的開發(fā)中。有研究[4]對169份花生核心種質(zhì)進行GBS分析，從全基因組水平開發(fā)InDel標記，獲得了10 401個InDel標記，并對其進行功能分類和注釋，為進一步種質(zhì)遺傳資源研究和分子遺傳改良奠定基礎(chǔ)。Zhou等[5]以花生品種中花 5號和ICGV86699為親本構(gòu)建重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體，通過分析ddRAD-seq所得的序列，在親本中開發(fā)出53 257個SNP標記，從群體中開發(fā)出14 663個SNP標記。

2 花生遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

花生不同類型分子標記的大量開發(fā)，促進了高密度花生遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。Halward等[6]利用野生種群體構(gòu)建了第1張花生屬遺傳圖譜，該圖譜含有117個RFLP標記和11個連鎖群，總長度1063cM。Creste等[7]通過二倍體野生種種間雜交和再回交法組建群體，構(gòu)建了含有167個RAPD標記和39個RFLP標記的遺傳圖譜。Milla等[8]也利用二倍體野生種雜交后代群體構(gòu)建了一張含有78個AFLP標記的遺傳連鎖圖譜。另外，近年栽培種花生的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建也取得了很大進展。Varshney等[9]利用RIL群體構(gòu)建了首張基于SSR標記的栽培種花生遺傳圖譜，Ravi等[10]在該圖譜基礎(chǔ)上又增加了56個位點，構(gòu)建了包含191個SSR標記的遺傳圖譜，涵蓋22個連鎖群，全長1785.4cM，標記間平均距離9.3cM。Hong等[11]對栽培花生的3個RIL群體進行遺傳圖譜構(gòu)建，檢測到175個多態(tài)性SSR位點，涵蓋22個連鎖群，全長885.4cM。Zhou等[5]基于SNP測序構(gòu)建花生栽培種遺傳圖譜，包括1621個SNP標記和64個SSR標記，涵蓋20個連鎖群，全長1446.7cM。Khan等[12]構(gòu)建了具有1975個SNP位點和5022個SNP位點的2個高密度遺傳連鎖圖譜。Agarwal等[13]也開發(fā)了基于SNP標記的高密度遺傳圖譜，包括8869個SNP標記，涵蓋20個連鎖群，全長3120cM。

3 重要性狀的分子標記與QTL定位

鑒定重要性狀連鎖的分子標記是標記開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前開發(fā)的花生重要性狀的分子標記大多與抗病相關(guān)。夏友霖等[14]以AFLP分析結(jié)合BSA方法篩選到與晚斑病抗性連鎖較緊密的3個AFLP標記，與抗性間的遺傳距離分別為 7.40、7.40和8.67cM。Shoba等[15]和 Sukruth等[16]分別鑒定出 1個和3個與晚斑病抗性顯著相關(guān)的SSR標記。雷永等[17]采用AFLP技術(shù)和BSA分析方法，獲得了與花生黃曲霉菌侵染抗性連鎖的2個分子標記，與抗性間的遺傳距離分別為 8.8和 6.6cM。任小平等[18]采用AFLP技術(shù)和BSA分析方法，獲得2個與花生青枯病抗性基因連鎖的分子標記，與抗性間的遺傳距離分別為8.12和11.46cM。Herselman等[19]和肖洋等[20]采用BSA法獲得與花生矮化病毒病抗性基因連鎖的AFLP和SSR分子標記。黃莉等[21]通過篩選遠雜9102和中花5號雜交后代衍生的RIL群體，獲得了2個與花生含油量相關(guān)的SSR標記，其中標記2A5-250與低油特性的相關(guān)性為95.0%，標記2A5-240與高油特性的相關(guān)性為88.9%。有關(guān)花生關(guān)鍵性狀連鎖標記的開發(fā)仍然較少，在一定程度上限制了育種工作中分子標記輔助選擇的利用。

花生重要性狀關(guān)聯(lián)的 QTL和候選基因的定位為花生分子育種提供了有力的支撐。在抗病方面，Wang等[22]利用高抗青枯病品種遠雜9102構(gòu)建RIL群體，在B02染色體定位了4個與抗青枯病相關(guān)的QTL，其中QTL主效區(qū)域包含21個NBS-LRR基因。同樣，Luo等[23]基于測序QTL定位方法（QTL-seq），在B02染色體上定位了1個與青枯病相關(guān)的QTL，區(qū)間大小為 2.07Mb。在抗葉斑病方面，Agarwal等[13]利用Tifrunner和GT-C20構(gòu)建的RIL群體，定位了7個與早斑病抗性關(guān)聯(lián)的QTL、3個與晚斑病關(guān)聯(lián)的QTL和9個與番茄斑萎病關(guān)聯(lián)的QTL。Shirasawa等[24]利用感病品系 Tag24和抗病品系GPBD4建立RIL群體，分別將晚斑病和銹病關(guān)聯(lián)的候選QTL定位于A02和A03染色體1.4和2.7Mb基因組區(qū)間內(nèi)。Agarwal等[25]利用SunOleic 97R和NC94022構(gòu)建RIL群體，定位了3個與番茄斑萎病抗性相關(guān)的QTL，其中對表型變異貢獻率最大的QTL位于89.5kb的物理距離范圍內(nèi)，利用該 QTL連鎖的競爭性等位基因特異性 PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）標記能實現(xiàn)群體內(nèi)抗病和感病個體的快速分離。

在產(chǎn)量和品質(zhì)性狀方面，Wang等[26]利用 195份花生材料挖掘出13 435個高質(zhì)量的SNP位點，通過GWAS分析發(fā)現(xiàn)93個SNP與4個產(chǎn)量性狀連鎖。Zhang等[27]采用花育36號和種質(zhì)系6-3的RIL群體，鑒定出與百粒重、種子長度和種子寬度等性狀相關(guān)的27個QTL。Pandey等[28]利用SunOleic 97R×NC94022和 Tifrunner×GT-C20的RIL 群體，分別鑒定出6個和9個與控制含油量關(guān)聯(lián)的QTL。Liu等[29]以徐花13和中花6號的RIL為材料，檢測到7個控制含油量的QTL，將位于A08染色體上的主效QTL qOCA08.1定位在0.8Mb的物理區(qū)間內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)了2個調(diào)控油脂合成的基因。

株型和脫殼率等重要農(nóng)藝性狀與花生的產(chǎn)量、抗病性和機械化收獲息息相關(guān)。Li等[30]以直立型花生品種冀花5號和匍匐型品種M130的雜交群體為材料，通過SLAF-seq技術(shù)檢測到39個與生長習性相關(guān)的QTL，其中有12個QTL在B05號染色體上0.17Mb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間多數(shù)基因與光和激素信號相關(guān)。Luo等[31]利用QTL-seq方法在遠雜9102和徐州68-4雜交的RIL群體中發(fā)現(xiàn)2個與調(diào)控脫殼率相關(guān)的QTL，分別位于A09（2.75Mb）和B02（1.1Mb）染色體上，在這2個區(qū)段上包含9個與脫殼率相關(guān)的候選基因。

4 利用分子標記輔助選擇培育高油酸花生

分子標記輔助育種與傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合能夠加速育種的進程。高油酸花生品質(zhì)穩(wěn)定，營養(yǎng)價值高，國內(nèi)多家單位開展花生高油酸分子標記輔助育種，是迄今為止花生分子標記輔助選擇技術(shù)應用到育種中最成功的例子?；ㄉ哂退嵝誀钪饕?個主效基因FAD2A和FAD2B控制，針對這2個主效基因突變位點已經(jīng)開發(fā)的檢測方法包括CAPS標記、KASP標記、等位基因特異PCR和PCR產(chǎn)物測序等[32-34]。趙術(shù)珍等[35]以花育23號和花育31號為母本，以高油酸花生品種Sunoleic95R、DF12和開農(nóng)176為父本，利用優(yōu)化的CAPS標記和PCR產(chǎn)物測序法以及FAD2基因KASP檢測方法，對自交和回交后代進行檢測，獲得一批高油酸花生材料。Bera等[36]利用分子標記輔助回交技術(shù)，將高油酸種質(zhì)SunOleic95R的2個FAD2突變等位基因?qū)敫哂退峄ㄉN系ICGV06100，輪回親本油酸含量提高 97%，亞油酸含量降低 92%，油酸/亞油酸（O/L）比值增加到 25。潘雷雷等[37]以魯花 11號為母本、開農(nóng)1715為父本，利用PCR產(chǎn)物測序法和系譜法篩選出油酸含量 80.40%、亞油酸含量2.50%、O/L比值 32.16的高油酸花生新品種宇花91。以大面積推廣的4個不同類型花生品種為輪回親本，利用FAD2標記輔助回交選擇，定向獲得了24個穩(wěn)定的高油酸改良材料[38-39]。Chu等[40]利用CAPS標記輔助選擇技術(shù)對線蟲抗性品種 Tifguard油酸含量進行改良，育成油酸含量高的抗線蟲新材料。

5 花生轉(zhuǎn)基因研究

近年來，利用基因工程將外源基因?qū)牖ㄉ?，獲得了一些優(yōu)質(zhì)的花生轉(zhuǎn)基因品系，為花生育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供了另一個選擇。目前，用于花生基因轉(zhuǎn)化的主要有油脂合成相關(guān)基因、過敏原基因和抗性基因等。

5.1 油脂合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化

花生作為重要的油料作物，其脂肪酸含量和種類一直是受關(guān)注的問題。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在脂肪酸合成過程中起著非常關(guān)鍵的作用。將AhPEPC基因反義表達載體轉(zhuǎn)入花生，通過抑制花生中AhPEPC基因的表達，可提高轉(zhuǎn)基因種子含油量 5.7%～10.3%[41]。AtLEC1參與調(diào)節(jié)種子或其他器官中貯藏脂類的生物合成與積累。Tang等[42]利用種胚特異啟動子將AtLEC1基因轉(zhuǎn)入花生，轉(zhuǎn)基因花生種子含油量提高4.42%～15.89%，硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸含量在不同品系間也發(fā)生了顯著變化。利用種子特異啟動子Lectin和組成型啟動子CaMV35S構(gòu)建AhFAD2基因的RNAi干擾載體，分別轉(zhuǎn)化豐花1號和花育23號獲得轉(zhuǎn)基因花生純合體株系，各轉(zhuǎn)基因株系中AhFAD2基因的轉(zhuǎn)錄水平普遍下調(diào)，后代株系種子的油酸含量顯著提高，豐花1號和花育23號的轉(zhuǎn)基因后代分別提高15.09%和36.40%[43]。與組成型啟動子CaMV35S相比，Lectin啟動子對AhFAD2基因表達的抑制效果更明顯。

5.2 過敏原基因的轉(zhuǎn)化

花生是重要的食物過敏原之一，在人體內(nèi)會引起lgE介導的超敏反應，嚴重時會導致死亡。通過構(gòu)建花生過敏原基因Arah2的敲除載體，轉(zhuǎn)化花生，使轉(zhuǎn)基因花生種子中Arah2基因表達量顯著降低，且未檢測到Arah2蛋白積累[44]。利用基因槍法用Arah2的RNAi載體轉(zhuǎn)化花生，在3個轉(zhuǎn)基因株系中Arah2的表達均受到顯著抑制，其中2個株系中Arah6的表達也顯著降低[45]。

5.3 抗性基因的轉(zhuǎn)化

在花生抗逆性方面，以抗蟲、抗病、抗旱和抗除草劑基因方面研究較多。將煙草條紋病毒的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入花生，對轉(zhuǎn)基因純合株系進行接種試驗，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對病毒侵染抗性明顯增強[46]。將豇豆胰蛋白抑制劑基因CtPI轉(zhuǎn)入花生，在成熟胚中定向表達，明顯提高了轉(zhuǎn)基因花生對棉鈴蟲的抗性[47]。通過轉(zhuǎn)化水稻幾丁質(zhì)酶基因，明顯提高了轉(zhuǎn)基因花生葉片中幾丁質(zhì)酶活性，比對照花生葉片高2～14倍，使轉(zhuǎn)基因花生葉片獲得對晚斑病、銹病和黃曲霉的抗性[48]。在抗旱基因方面，脫水響應元件轉(zhuǎn)錄因子 DREB是一類可以激活多個干旱響應基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，可提高作物抗旱性。王旭達等[49]將耐鹽作物獐毛中的AlDREB2A基因?qū)牖ㄉ?，提高了花生葉片相對含水量和脯氨酸含量，增強了植株的耐旱性。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）是細胞分裂素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。Qin等[50]用脅迫誘導啟動子驅(qū)動的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化花生，轉(zhuǎn)基因花生的耐旱性顯著提高。為了培育抗除草劑品種，Chu等[51]將Bcl-xL基因轉(zhuǎn)入花生后，檢測出1個T1代繼續(xù)表達中等水平BclxL的品系，經(jīng)5μmol/L百草枯處理后的葉綠素水平明顯高于對照，表現(xiàn)出對百草枯的耐受性。

6 問題與展望

花生全基因組測序、分子標記開發(fā)、圖譜構(gòu)建、QTL定位及轉(zhuǎn)基因工程等領(lǐng)域的發(fā)展為花生分子育種奠定了堅實的基礎(chǔ)。但與玉米、水稻等主要模式作物相比，花生分子育種研究明顯落后，許多問題亟待進一步研究和解決。

6.1 加強與花生關(guān)鍵農(nóng)藝性狀連鎖標記的開發(fā)

與花生抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)等重要農(nóng)藝性狀連鎖的標記數(shù)量少，大大限制了分子標記輔助選擇在育種中的應用。鑒定評價優(yōu)異種質(zhì)資源和突變體材料，解析更多關(guān)鍵農(nóng)藝性狀形成的分子機理，挖掘有用的基因和QTL，開發(fā)連鎖的分子標記，是促進花生分子育種的重要支撐。

6.2 提高花生轉(zhuǎn)基因效率

轉(zhuǎn)基因效率低會影響基因工程改良，限制花生育種工作的發(fā)展。提高花生轉(zhuǎn)基因效率是促進基因工程種質(zhì)創(chuàng)新、研究基因功能的基礎(chǔ)。

6.3 加大開發(fā)功能性分子標記

隨著全基因組測序的完成，花生基因組學和功能基因組學研究將不斷深入，利用高通量測序和 SNP芯片技術(shù)對不同種質(zhì)資源進行全面評價和解析，發(fā)掘更多有利用價值的基因和QTL，以及功能性分子標記，進而促進花生分子育種技術(shù)的發(fā)展和完善，分子育種將在花生精準改良中發(fā)揮更大的作用。