DExD/H-box家族RNA解旋酶介導的宿主-病毒相互作用

金春梅，于龍政，李太元，李艷茹 (延邊大學 農學院，吉林 延吉133400)

DExD/H-box蛋白是SF2解旋酶超家族的主要成員，普遍存在于真核生物、細菌與古生菌中。其具有結合核苷酸、RNA及蛋白質的能力，能夠利用水解ATP產生的能量參與mRNA前體加工、翻譯起始、mRNA轉運、核糖體生成、RNA降解等生物過程[1]。DExD/H-box解旋酶可以在不涉及易位過程的情況下有效地分離短RNA雙鏈，這是多數(shù)DExD/H-box蛋白發(fā)揮解旋酶活性的基礎。此外，DExD/H-box解旋酶能夠定位到對應生理底物上，激活底物活性，促進RNA折疊和重排，加速RNA-蛋白質復合物重塑[1-2]。

DExD/H-box解旋酶包含8～9個保守基序(基序Q、基序Ⅰ、基序Ⅰa、基序Ⅰb、基序Ⅱ、基序Ⅲ、基序Ⅳ、基序Ⅴ、基序Ⅵ)，分別參與ATP結合、ATP水解、核酸結合和RNA解離[3]。這些保守基序包含在一個由2個柔性連接區(qū)連接的RecA樣球狀結構域組成的結構折疊中，這種結構折疊促進了與解旋酶活性相關的運動蛋白的功能。除了保守的功能核心外，大多數(shù)DExD/H-box解旋酶還包含可變的N-末端和C-末端延伸區(qū)域。這些延伸區(qū)可以調節(jié)酶活性，或者作為蛋白質相互作用的位點[4]。越來越多的研究表明，與免疫應答反應相關的DExD/H-box解旋酶在機體應對抗病毒感染的過程中發(fā)揮了重要作用。DExD/H-box解旋酶可以作為病毒核酸感受器，促進免疫反應下游信號轉導，進而調節(jié)宿主抗病毒免疫[5-12]。本文將針對DExD/H-box解旋酶介導的宿主-病毒相互作用的最新研究進展進行綜述。

1 DExD/H-box蛋白具有獨特的RNA解旋酶活性

DExD/H-box蛋白的核心性序列與其他RNA和DNA解旋酶家族相似，核心序列能夠有效地作用于短dsRNA或RNA-DNA雜交雙鏈，通過水解ATP供給能量解開螺旋鏈。這些核心序列是DExD/H-box蛋白多種功能的基礎，特別是涉及RNA結構變化的功能。盡管DExD/H-box蛋白的核心序列與傳統(tǒng)解旋酶相似，但是該酶的解旋機制與傳統(tǒng)的解旋酶不同。

1.1 解旋酶的效率隨螺旋長度或穩(wěn)定性的增加而下降傳統(tǒng)解旋酶在解旋過程中，首先與雙鏈的一端結合，然后利用ATP結合和水解的能量沿一條鏈進行定向移動或轉運。大多數(shù)SF1和SF2解旋酶沿3'→5'方向移位，少數(shù)解旋酶向3'端移動分離雙鏈。解旋酶在易位時緊緊結合其中一條鏈，導致另一條鏈移位。ATP水解、移位和鏈置換反復循環(huán)進行，最終導致螺旋完全解離。在每個循環(huán)中，解旋酶過早地從鏈上解離或突然結束解離反應的可能性極低，繼續(xù)前進而不是解離的特性決定了解旋酶進行反應的能力，能力越強的解旋酶繼續(xù)移位的可能性就越強[13]。研究人員通過評價成功解離事件的比例是如何隨著螺旋長度的增加而降低的，進而評價解旋酶的解旋能力。以這種方式進行評估時，DExD/H-box蛋白的解旋能力較差。評價解旋酶能力通常需要測量數(shù)百或數(shù)千個堿基對，但是，對于DExD/H-box蛋白而言，當螺旋長度超過10～15 bp時，DExD/H-box蛋白就失去了解旋能力，當螺旋長度超過20～25 bp時，檢測不到解離現(xiàn)象。DExD/H-box蛋白有效解離的雙鏈長度較短，單個蛋白質單體可以與大部分雙鏈結合。因此，DExD/H-box蛋白可能根本不需要任何移位過程就可以完成雙鏈解旋[14]；此外，DExD/H-box蛋白的解旋效率主要依賴于螺旋的穩(wěn)定性，而不僅僅依賴于螺旋的長度，但當DExD/H-box蛋白遇到更穩(wěn)定的結構時，其移動速度會更慢。例如：真核蛋白翻譯起始因子eIF4A(eukaryotic translation initiation factor 4A)是最早被發(fā)現(xiàn)的DEAD盒(DEAD-box)RNA解旋酶(RNA helicase)超家族成員，其在翻譯過程中與核糖體、tRNA、mRNA相互作用，使得蛋白翻譯有條不紊的進行，進而維持細胞正常的生命活動。eIF4A可以很容易解開某些短雙鏈，但對于富含G-C對的雙鏈來說解旋效率要低得多。

1.2 DExD/H-box蛋白通過延伸增強解離能力大多數(shù)RNA解旋酶都通過識別單鏈結構，在RNA復制過程中催化RNA解旋。RNA延伸可以提供一個與解旋酶相互作用的初始位點，解旋酶可以從這個位點開始易位到螺旋中。延伸部分需要具有一定的極性，以便定向移位將解旋酶核心移動到螺旋中，而不是移動到延伸部分的自由端。大多數(shù)解旋酶沿3'→5'方向移位，它們要求延伸部分包括一個自由的3'端。DExD/H-box蛋白與大多數(shù)SF1和SF2解旋酶截然不同，一些DExD/H-box蛋白分離鈍端螺旋鏈與分離相同的帶延伸的螺旋同樣有效。DExD/H-box蛋白可以通過接觸雙鏈區(qū)域來啟動解離，解離可以在雙鏈內部開始。從雙鏈內部開始解離的機制對于解離較長雙鏈是不可能成功的，因此，許多DExD/H-box蛋白通過延伸來增強解離能力。但是，與傳統(tǒng)解旋酶不同，無論極性如何，延伸都有利于解旋[15]。這種非極性激活與傳統(tǒng)解旋酶需要定向移位的機制不同。

1.3 DExD/H-box蛋白識別RNA或RNA-protein的分子基礎DExD/H-box家族蛋白是一類RNA解旋酶，廣泛存在于真核生物和大多數(shù)原核生物中。該家族蛋白通常含有8～9個保守的基序，分別為基序Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ與Q，其中基序Q為DEAD-box亞家族所特有。多數(shù)DExD/H-box蛋白通過解旋酶核心內特定的環(huán)(或表面)或者附近的輔助結構域低特異性或無特異性地與特定的RNA或RNA-protein(RNPs)的螺旋延伸結合并發(fā)生相互作用，進而發(fā)揮特殊的功能。近年來，通過對一系列解旋酶或與ssRNA結合的核苷酸類似物的晶體結構進行分析，研究人員解析了DExD/H-box蛋白分離RNA鏈的分子機制。DExD/H-box與RNA或RNPs結合時，結合配體與解旋酶核心的所有基序排列在2個域之間的界面上，并形成RNA和腺苷酸結合位點。結合的RNA位于一個跨越2個結構域的基本縫隙中，包含來自結構域1以及結構域2的部分基序[14]。

2 DExD/H-box蛋白參與調節(jié)宿主免疫應答

許多DExD/H-box解旋酶與抗病毒免疫有關，視黃酸誘導基因蛋白-I(RIG-I)樣解旋酶、黑色素瘤分化相關抗原5(MDA5)和遺傳學生理學實驗室蛋白2(LGP2)是重要的RNA病毒胞內模式識別受體[12]。RIG樣解旋酶或其他抗病毒模式識別受體識別病毒核酸后誘導Ⅰ型干擾素(IFN)和促炎細胞因子產生[11]。最近，DExD/H-box解旋酶被證實具有病毒核酸的胞液傳感器功能。然而，也有研究表明，有一些DExD/H-box解旋酶可能在模式識別受體信號通路的下游發(fā)揮了更多功能，如作為信號適配器或轉錄調節(jié)因子。此外，許多DExD/H-box解旋酶參與了不同病毒復制，是病毒復制必須的宿主因子，病毒為了自身復制“劫持”了DExD/H-box蛋白的RNA解旋酶活性。因此，DExD/H-box解旋酶可能是病毒和宿主免系統(tǒng)之間“軍備競賽”的競爭目標。

2.1 DExD/H-box蛋白作為天然免疫的正調控因子RIG-I是DExD/H-box RNA解旋酶家族的成員，能夠識別細胞質中的病毒RNA，進而激活線粒體抗病毒信號蛋白分子(IPS-1)形成類似朊病毒的聚集體， 進一步激活下游信號通路，最終激活干擾素調節(jié)因子3(IRF3)和核因子-κB(NF-κB)并誘導細胞表達IFN-β[16-17]。細胞內通常含有微量的RIG-I，因此，在感染的最初階段，其他RNA結合蛋白可能參與將病毒RNA傳遞到線粒體抗病毒信號途徑中[18]。OSHIUMI等[19]用酵母雙雜交技術發(fā)現(xiàn)了與人IPS-1偶聯(lián)的DEAD BOX(Asp-Glu-Ala-Asp)解旋酶DDX3(DEAD/H BOX3)。DDX3可以與病毒RNA結合，進一步使其與IPS-1復合物結合。與RIG-I不同，DDX3在細胞中呈組成型表達的狀態(tài)，部分DDX3片段與IPS-1共存于線粒體周圍。DDX3 C-末端區(qū)域(第622～662位氨基酸)直接與IPS-1的半胱天冬酶招募結構域(CARD)結合，整個DDX3蛋白也與RIG-I受體(RLR)相關。DDX3能夠協(xié)助IPS-1增強IFN-β啟動子的激活，通過小干擾RNA(siRNA)下調DDX3表達導致IFN-β表達水平降低。轉染TANK結合激酶1(TBK1)或I-kappa-B激酶-ε(IKKε)后DDX3誘導的IFN-β啟動子活性僅略微增強。過表達DDX3增強了病毒介導的IFN-β誘導表達和宿主細胞對病毒感染的保護作用。因此，DDX3是一種抗病毒IPS-1的增強劑。

NF-κB在促進炎癥和抵抗損傷治療方面發(fā)揮著重要作用。SZYMURA等[11]通過篩選鑒定出與κB DNA探針發(fā)生作用的細胞因子-DexD/H-box RNA解旋酶(DDX39B)，并證實DDX39B通過與模式識別受體(PRR)LGP2相互作用抑制p65磷酸化進而抑制NF-κB的活性[11，20]。DDX39B蛋白豐度受到位點特異性SUMO化的調節(jié)，從而促進其泛素化和降解[21]。全基因組分析表明，DDX39B通常并不抑制干擾素刺激的基因表達，而是減弱與細胞外基質、細胞遷移和血管生成相關因子的表達。因此，DDX39B是一種RNA結合蛋白，可以阻斷一部分炎癥反應，在mRNA剪接和核輸出過程中發(fā)揮重要功能。

2.2 DExD/H-box蛋白作為天然免疫的負調控因子TBK1是Ⅰ型IFN合成過程中最為關鍵的蛋白激酶，在抗病毒固有免疫應答中發(fā)揮重要作用。TBK1和IKKε能同時激活轉錄因子IRF3、IRF7和NF-κB，進而促進Ⅰ型IFN的表達[22]。DExD/H-box解旋酶是識別病毒核酸的關鍵受體，它們調節(jié)RIG-I樣受體介導的Ⅰ型IFN的產生。ZHANG等[23]證明DExD/H-box RNA解旋酶19(DDX1)是Ⅰ型IFN產生的負調控因子。過表達DDX19抑制了聚poly(I：C)和仙臺病毒誘導的Ⅰ型IFN的產生，下調表達DDX19則促進了Ⅰ型IFN的產生。DDX19能夠影響TBK1或IKKε與IRF3之間的相互作用，抑制TBK1和IKKε激酶介導的IRF3磷酸化。此外，DDX19還招募了Lamtor2，形成了TBK1-IKKε-Lamtor2-DDX19-IRF3復合物，促進TBK1和IKKε的降解進而抑制IFN產生。小鼠敲除DDX19基因后，產生的Ⅰ型IFN增加，抑制了腦心肌炎病毒的復制。因此，DDX19負調控RLR介導的Ⅰ型IFN產生。

病毒RNA是RNA病毒在宿主細胞復制過程中產生的，可被RIG-I樣受體識別，激活相關信號通路，合成Ⅰ型IFN，并以旁分泌或自分泌的方式轉錄產生大量的IFN刺激基因(ISGs)[24-25]。然而，不受控制的先天免疫反應也可能導致有害宿主的炎癥反應。因此，維持宿主先天免疫的動態(tài)平衡至關重要[26]。RIG-I樣受體信號通路受到正負調控因子的嚴格調控，F(xiàn)as相關死亡結構域(FADD)和受體相互作用蛋白1(RIP1)促進信號轉導，是凋亡和炎癥信號通路的關鍵角色。DDX24是一種解旋酶，具有負調控ISG的作用。DDX24在RLR依賴的信號轉導中發(fā)揮負調控作用，是調控天然免疫的重要基因。DDX24在宿主細胞中劫持接頭蛋白FADD和RIP1，抑制病毒RNA依賴的IFN的產生，并促進RNA病毒在某些細胞中的復制。DDX24缺陷的小鼠胚胎早期致死，這表明該解旋酶除了調節(jié)RLR信號外，可能還發(fā)揮其他重要作用。此外，F(xiàn)ENG等[5]報道DDX25是Ⅰ型IFN通路的負調控因子，可促進RNA病毒感染。在登革熱病毒(DENV)感染初期，細胞內DDX25 mRNA和蛋白的水平均上調。在DENV感染期間，沉默DDX25后細胞內病毒載量顯著降低，而DDX25過表達細胞內病毒載量顯著升高。與此同時，在病毒感染過程中，DDX25 siRNA處理的細胞中Ⅰ型IFN的表達水平升高。DDX25轉基因小鼠對致命性水皰性口炎病毒(VSV)感染的敏感性增加，病毒血癥明顯升高，而抗病毒細胞因子水平較低。DDX25調制RIG-I信號通路和阻塞IFN-β生產，阻斷IRF3和NF-κB激活。因此，DDX25是一種新的IFN通路負調控因子，有利于RNA病毒的感染。

2.3 DExD/H-box蛋白作為細胞內抗病毒“哨兵”宿主細胞識別病毒DNA是其啟動抗病毒反應的關鍵。ZHANG等[27]證明DDX41是髓系樹突狀細胞(mDCs)內的DNA傳感器，DDX41是DExD/H-box解旋酶家族的一員。RNA干擾敲低DDX41表達，阻斷了mDCs表達Ⅰ型IFN和細胞因子的能力。過表達DDX41和接頭分子STING在促進IFN-β啟動子活性方面具有協(xié)同作用。DDX41結合了病毒DNA和STING，并與STING一起定位在胞漿中。下調表達DDX41阻斷了TBK1和轉錄因子NF-κB與IRF3的激活。因此，DDX41是一種附加的DNA傳感器，其依靠STING檢測病毒DNA。

OSHIUMI等[28]證明DDX60是細胞質抗病毒天然免疫反應的哨兵。RIG-I介導的Ⅰ型IFN的產生和核酸酶介導的病毒RNA降解是抗病毒先天免疫反應所必需的[29-30]。DDX60是IFN誘導的胞質解旋酶，DDX60作為RIG-I激活的哨兵以配體特異性的方式作用于RIG-I的上游，激活RIG-I信號。DDX60基因敲除可減弱RIG-I信號，并顯著減少體內Ⅰ型IFN的產生。OSHIUMI等[28]還發(fā)現(xiàn)DDX60參與了非RIG-I依賴的病毒RNA的降解。丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和其他熱病毒可以激活表皮生長因子受體(EGFR)[31]，這些病毒通過EGFR誘導DDX60磷酸化，導致DDX60抗病毒活性減弱。因此，DDX60是胞質抗病毒反應的哨兵，但是這種反應可被EGFR的激活所抵消。

LU等[32]發(fā)現(xiàn)DHX15是髓系樹突狀細胞中重要的RNA感受器。阻斷DHX15表達可有效降低髓系樹突狀細胞產生IFN-β、IL-6和TNF-α的能力。DHX15能與poly I：C特異性結合，但不能與聚脫氧鳥苷酸-脫氧胞苷酸(PolydG：dC)特異性結合。DHX15以MAVS依賴的方式誘導Ⅰ型IFN和促炎細胞因子的產生，以應答dsRNA和RNA病毒感染。在RNA呼腸孤病毒感染過程中，DHX15還需要激活IRF3磷酸化、NF-κB和MAPK信號。PATTABHI等[33]證實DHX15是RLR信號的協(xié)同受體，可促進抗RNA病毒感染的抗病毒防御。DHX15的敲除增加了宿主對不同種屬RNA病毒感染的敏感性，包括副黏病毒科、橫紋病毒科和小核糖核酸病毒科。DHX15過表達增強了RNA病毒感染后的先天免疫信號。DHX15通過其氨基末端與RIG-I半胱氨酸蛋白酶和招募結構域相關聯(lián)形成復合物，該復合物在病毒感染時被招募到MAVS中。

2.4 病毒利用宿主DExD/H-box蛋白干擾宿主的免疫反應RNA解旋酶除了在抗病毒免疫中發(fā)揮作用外，還被病毒主動招募以促進其復制周期。雖然原核和真核基因組都含有RNA解旋酶基因，但許多病毒不能編碼RNA解旋酶[34]。病毒在很大程度上依賴宿主RNA解旋酶重塑基因組RNA和復制中間產物，或者將其基因組RNA包裝成病毒粒子[35]。一些DExD/H-box解旋酶似乎具有雙重功能，既是天然免疫介質，又是病毒復制的輔助因子。

DDX3在抗病毒天然免疫中的功能，它可以抑制Ⅰ型IFN的產生。但是，DDX3也是幾種病毒復制的重要宿主因子，尤其是獲得性免疫缺陷綜合征病毒(HIV)和丙型肝炎病毒[36-37]。HIV 能夠產生一種叫做Rev的蛋白，用于從細胞核中轉運長的、未剪輯的RNA。這些病毒RNA含有能夠被Rev識別的REV反應元件(RRE)，REV富含亮氨酸的核輸出信號(NES)，并與核轉運信號蛋白1(CRM1)結合，組裝形成REV-RRE-RNA復合物，介導含有NES的蛋白的輸出。但是Rev和CRM1不足以完成復雜的RNA剪切過程。宿主細胞核的過程中利用了DDX3。與DDX3類似，DDX1已被證明有助于REV依賴的HIV RNA的核輸出過程[38]。DDX1在REV-RRE-RNA復合物的組裝中發(fā)揮作用，可能為它們通過CRM1途徑有效輸出做好準備。以上研究表明DExD/H-box解旋酶似乎位于病毒和宿主免疫系統(tǒng)之間進化軍備競賽的前線。

3 總結與展望

近年來，雖然DExD/H-box解旋酶介導的宿主-病毒相互作用的研究取得了令人矚目的進展，但仍存在許多未知的環(huán)節(jié)。例如：如果“感知”病毒核酸是DExD/H-box解旋酶的主要作用，它們如何準確地區(qū)分細胞核酸和病毒核酸；DExD/H-box解旋酶是否在抗病毒先天免疫過程中作為輔助受體或具有額外的下游作用；DExD/H-box解旋酶與病毒RNA相互作用時，它們的亞細胞定位發(fā)生了變化，即從細胞核定位到細胞質的病毒復制位點，定位的變化是否是導致其功能發(fā)生變化的關鍵因素；在細胞質內，DExD/H-box解旋酶是否進化為參與抗病毒免疫的解旋酶，同時擾亂抗病毒免疫反應。因此，有必要對DExD/H-box解旋酶進行系統(tǒng)的研究，進一步分析其基因的功能與作用機制，明確DExD/H-box解旋酶在病毒感染過程中的生物學功能，從而為預防和治療病毒感染提供潛在的藥物靶點。