重組禽流感病毒的雞胚生產(chǎn)工藝控制要點(diǎn)

陳金仙

廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356

1 雞胚的選取

雞胚生產(chǎn)重組禽流感病毒工藝最大的缺點(diǎn)是容易受雞胚來(lái)源、質(zhì)量及自身不穩(wěn)定性的影響，造成疫苗批間質(zhì)量差異顯著。所以雞胚的選取是重組禽流感病毒液生產(chǎn)的基石，對(duì)能否生產(chǎn)出高品質(zhì)的重組禽流感病毒液有著至關(guān)重要的作用。選取優(yōu)質(zhì)的雞胚則從種蛋的選取開(kāi)始。雞蛋主要是由蛋殼、蛋殼膜、氣室、蛋白、蛋黃及胚珠等部分構(gòu)成，受精后的種蛋經(jīng)孵化后成為雞胚。種蛋的選取要考慮種蛋的來(lái)源、大小和形狀、蛋殼、清潔度、新鮮度、保存過(guò)的環(huán)境等因素。

1.1 種蛋的來(lái)源要求

高致病性禽流感滅活疫苗的抗原主要為H5N1亞 型 Re-11 株、H5N1 亞型 Re-12 株 和H7N9 亞 型H7-Re3 株的重組禽流感病毒液。如選取的雞胚具有相對(duì)應(yīng)亞型的母源性抗體，則所接種的重組禽流感病毒將不能在雞胚內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，病毒的繁殖便掐然而止。因此所選取的雞胚不能有抑制所接種病毒繁殖的母源抗體。一般選擇來(lái)自健康無(wú)病雞群或SPF 雞群的新鮮受精蛋，即選取非免疫雞胚或SPF 雞胚。

1.2 種蛋的大小和形狀要求

雞胚的孵化在孵化機(jī)內(nèi)進(jìn)行，過(guò)小的雞蛋孵化翻蛋的過(guò)程中容易被晃動(dòng)弄破，而且會(huì)導(dǎo)致后期機(jī)器接種不上或是導(dǎo)致尿囊液的收獲量大大減少等，因此所選取的雞胚不能過(guò)小。過(guò)大的雞蛋則很難擠進(jìn)蛋托，也容易在蛋托里被擠破。過(guò)大的蛋不僅孵化率低而且胚胎的占比大也會(huì)導(dǎo)致尿囊液收獲量的減少，因此所選取的種蛋不能過(guò)大。形狀過(guò)長(zhǎng)、過(guò)圓、腰鼓形、橄欖形（兩頭尖）、扁形、錐形（一頭尖）等畸形的蛋也會(huì)降低孵化率，因此種蛋的形狀應(yīng)當(dāng)為正常的橢圓形（氣室頭稍大）且蛋形指數(shù)（蛋的縱徑與橫徑的比值）在1.30 ～1.35 最好。綜上，應(yīng)選取重量約為55 ～65 g 正常蛋形的種蛋，有利于孵化、接種和收獲。

1.3 種蛋蛋殼要求

蛋殼過(guò)薄或表面粗糙的雞胚，在孵化的過(guò)程中容易破損。白殼蛋在照蛋的過(guò)程中比較容易觀(guān)察，沙殼蛋則不利于照蛋觀(guān)察。所以選取的種蛋的蛋殼應(yīng)該是致密均勻、厚度適宜、沒(méi)有破裂、且容易觀(guān)察，沒(méi)有沙殼的白殼蛋。

1.4 種蛋的清潔度要求

種蛋的表面經(jīng)常會(huì)沾有雞糞、塵土、霉斑、破蛋液等污物，從而容易滋生細(xì)菌，甚至是堵塞蛋殼的氣孔影響雞胚的氣體交換，導(dǎo)致雞胚在孵化的過(guò)程中死去，降低孵化率。而且污染的蛋殼如消毒不當(dāng)則容易污染收獲的病毒液，或是間接造成生產(chǎn)出的病毒液內(nèi)毒素偏高，嚴(yán)重影響病毒液的質(zhì)量甚至是導(dǎo)致大批次的混合病毒液報(bào)廢，造成不可逆的經(jīng)濟(jì)損失。所以選取的種蛋表面清潔程度要好，或者在入孵前要對(duì)污染不嚴(yán)重的種蛋進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和消毒，保證入孵的種蛋有良好的清潔度。

1.5 種蛋的新鮮程度和氣室要求

雞胚接種重組禽流感病毒后，收獲的病毒液主要是雞胚的尿囊液。如果雞胚的氣室偏大，收獲的尿囊液也會(huì)大大減少，從而影響重組禽流感病毒液的產(chǎn)量。雞胚的氣室過(guò)大一般是由于保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致雞蛋里面的水分流失造成的。當(dāng)雞胚的氣室或是游移時(shí)會(huì)很不利于接種和收獲，所以選取的種蛋應(yīng)當(dāng)新鮮，保存的時(shí)間不宜超過(guò)7 d，且氣室大小和位置正常。

1.6 種蛋的保存要求

種蛋胚胎發(fā)育的臨界溫度為23.9 ℃，超過(guò)這個(gè)溫度的種蛋就會(huì)開(kāi)始發(fā)育，盡管可能發(fā)育程度小，但是由于細(xì)胞代謝可能導(dǎo)致雞胚衰老甚至是死亡，從而造成孵化率偏低；而且還會(huì)導(dǎo)致接種時(shí)的胚齡偏大影響病毒液的產(chǎn)量和效價(jià)。如種蛋保存的溫度過(guò)低，其孵化率也會(huì)受到影響，低于10 ℃會(huì)降低孵化率，低于0 ℃甚至?xí)軆龆シ趸芰Α７N蛋保存的濕度過(guò)低則容易造成蛋內(nèi)的水分通過(guò)氣孔向周?chē)沫h(huán)境中蒸發(fā)而導(dǎo)致氣室過(guò)大，濕度過(guò)高又容易導(dǎo)致種蛋表面長(zhǎng)菌或是發(fā)霉，所以選擇的種蛋自產(chǎn)出后在孵化前應(yīng)當(dāng)一直處在合適的溫濕度條件下進(jìn)行保存和運(yùn)輸。

1.7 其他

還有一些種蛋有可能是雙黃蛋，這種種蛋的蛋形往往會(huì)較普通的蛋大且長(zhǎng)，一般肉眼可分辨出來(lái)。這種蛋不適宜接種病毒，孵化前要予以剔除。

2 種蛋的消毒

種蛋產(chǎn)出后，其表面常常會(huì)受到污染導(dǎo)致微生物在蛋殼的表面大量繁殖，微生物有可能會(huì)通過(guò)氣孔進(jìn)入蛋內(nèi)，也有可能在接種后通過(guò)針孔污染雞胚，還有可能會(huì)在收獲后被帶到病毒液里面，造成污染或是內(nèi)毒素偏高。所以種蛋在入孵前要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的清洗和消毒。消毒方法一般有熏蒸消毒、浸泡消毒、噴霧消毒等。

2.1 熏蒸消毒

熏蒸消毒一般為福爾馬林（甲醛）熏蒸法，此法消毒效果最好?？蓪⒎N蛋放在專(zhuān)用的密閉消毒室或消毒箱內(nèi)，按每立方米容積30 mL 甲醛，15 g 高錳酸鉀配制消毒液。先調(diào)節(jié)消毒區(qū)的溫度在25 ～27 ℃，相對(duì)濕度為60%～80%，先用陶瓷類(lèi)的容器裝好高猛酸鉀放入消毒區(qū)，然后加入甲醛，讓種蛋在該密閉的空間熏蒸30 min 后，打開(kāi)密閉空間，排出甲醛氣體。由于甲醛和高錳酸鉀的反應(yīng)劇烈，而且腐蝕性強(qiáng)，容易傷及人的呼吸系統(tǒng)和眼睛等。而且甲醛屬于一類(lèi)致癌物，對(duì)環(huán)境的污染和工作人員的健康影響極大，一般不推薦用此法進(jìn)行種蛋消毒。

2.2 浸泡消毒

浸泡消毒是將種蛋放到消毒液進(jìn)行短暫的浸泡后取出晾干。最常見(jiàn)的是將種蛋浸入含有活性氯1.5%的漂白粉溶液中，3 min 后取出晾干，或是將種蛋置于0.1%的碘酊溶液內(nèi)浸泡0.5 ～1 min 取出晾干即可，消毒液浸泡一定數(shù)量的種蛋后要更換。浸泡消毒的消毒效果還是比較好的，但是操作不便且繁瑣，需要耗費(fèi)大量的消毒液，所以一般大規(guī)模的生產(chǎn)中很少采用。

2.3 噴霧消毒

噴霧消毒是通過(guò)噴霧劑將消毒液直接噴到種蛋的表面上。常用的消毒液有1:1 000 的新潔爾滅溶液（季胺鹽類(lèi)），1:500 的百毒殺溶液，1:500 的戊二醛溶液，1:500 的氯己定溶液（雙胍類(lèi)）、0.2%的過(guò)氧乙酸溶液等等。噴霧消毒的有效性雖然比不上前面兩種那么全面徹底，但是操作簡(jiǎn)單且成本低，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)往往采用此法。

3 雞胚的孵化

影響雞胚孵化的條件主要有溫度、濕度、通風(fēng)換氣、翻蛋和涼蛋等。種蛋在接種前需要經(jīng)過(guò)10 ～11 d 的孵化。接種后經(jīng)3 ～4 d 孵化后收獲。

3.1 孵化設(shè)備

雞胚的大規(guī)模孵化采用巷道式孵化機(jī)進(jìn)行。這種孵化機(jī)配備空氣攪拌和導(dǎo)熱系統(tǒng)，能夠很好地利用雞胚的代謝熱，箱體內(nèi)沒(méi)有死角，溫度均勻，不僅省電，而且孵化效果好。孵化機(jī)在入孵前要進(jìn)行熏蒸消毒。

3.2 孵化溫度的控制

雞胚在孵化的過(guò)程中，溫度是最重要的影響因素。它影響著胚胎的生長(zhǎng)、發(fā)育和活力，過(guò)高或過(guò)低的溫度都不利于雞胚的發(fā)育。溫度偏高會(huì)使雞胚發(fā)育快，雞胚的活力弱，一旦超過(guò)42 ℃，2 ～3 h后就會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡。溫度偏低會(huì)使雞胚的發(fā)育遲緩，若溫度低于24 ℃，30 h 后就會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡。雞胚孵化的最佳溫度與雞胚的品種、大小和胚齡、孵化的環(huán)境和季節(jié)等有很大的聯(lián)系。在生產(chǎn)實(shí)踐中，在不同的孵化時(shí)期，可以根據(jù)胚胎的發(fā)育狀態(tài)，給予合適的溫度。如胚胎發(fā)育偏快，說(shuō)明孵化的溫度偏高，應(yīng)適當(dāng)降低孵化溫度；如胚胎發(fā)育偏慢，說(shuō)明孵化溫度偏低，可適當(dāng)升高孵化溫度；如胚胎發(fā)育符合標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明孵化溫度合適。這就是根據(jù)雞胚的發(fā)育規(guī)律，“看胎施溫”的技術(shù)。這需要技術(shù)人員要有非常專(zhuān)業(yè)的判斷能力，才能正確地把控好這門(mén)技術(shù)。一般而言，1 ～3 日齡的雞胚最理想的孵化溫度為38.5 ℃，4 ～12 日齡的雞胚最理想的孵化溫度為37.8 ℃。

3.3 孵化濕度的控制

孵化機(jī)內(nèi)的濕度也對(duì)雞胚的發(fā)育有較大的影響。適宜的濕度在雞胚孵化的前期能使雞胚受熱均勻，后期有利于雞胚的散熱。濕度過(guò)高或是過(guò)低都會(huì)影響雞胚的正常物質(zhì)代謝。濕度過(guò)高，雞胚內(nèi)水分蒸發(fā)受阻，妨礙雞胚的氣體交換，影響雞胚發(fā)育，導(dǎo)致雞胚活力不強(qiáng)。濕度過(guò)低，雞胚內(nèi)水分蒸發(fā)過(guò)多，不僅導(dǎo)致雞胚的胚胎與殼膜黏連，而且也會(huì)間接導(dǎo)致最后收獲的病毒液的量大大減少。一般的情況下，1 ～7 日齡的雞胚在孵化時(shí)相對(duì)濕度為60%～65%有利于羊水和尿囊液的形成，7 日齡以后的相對(duì)濕度可調(diào)為50%～60%有利于排除羊水和尿囊液。

3.4 孵化時(shí)要經(jīng)常通風(fēng)換氣

雞胚在發(fā)育的過(guò)程中會(huì)進(jìn)行有氧呼吸，與外界進(jìn)行氣體交換，即吸入氧氣，排出二氧化碳。特別是隨著胚齡的增長(zhǎng)，有氧呼吸會(huì)逐漸增強(qiáng)，氣體交換量變大。這需要隨著胚齡的增加，逐漸加大通風(fēng)換氣量。隨著胚齡的增大，雞胚的產(chǎn)熱也會(huì)增強(qiáng)，如果散熱不好還會(huì)導(dǎo)致雞胚積熱致死，加強(qiáng)通風(fēng)換氣則能有利于雞胚散熱，提高孵化率。當(dāng)孵化機(jī)內(nèi)二氧化碳含量大于0.5%會(huì)使雞胚發(fā)育緩慢，產(chǎn)生畸形，甚至是死亡。正常的情況下，孵化機(jī)內(nèi)的空氣含氧量21%，二氧化碳0.03%是最合適雞胚孵化的。因此孵化的過(guò)程中要定時(shí)檢測(cè)孵化機(jī)內(nèi)的通風(fēng)換氣情況。

3.5 孵化過(guò)程中要翻蛋

種蛋的蛋黃含脂肪多，密度較小容易浮在蛋的上面。而胚胎在蛋黃之上，所以在孵化的過(guò)程中，雞胚長(zhǎng)時(shí)間不動(dòng)，胚胎容易與殼膜黏連。因此，雞胚孵化的過(guò)程中要定時(shí)進(jìn)行翻蛋。翻蛋能使雞胚各部受熱均勻，防止蛋白沾連，促進(jìn)羊膜運(yùn)動(dòng)和空氣流通，改善胎膜的血液循環(huán)，有助于胚胎發(fā)育。一般的情況下，翻蛋每2 h 進(jìn)行一次，角度在水平位置上前俯后仰各45°，且輕、穩(wěn)、慢。

3.6 孵化過(guò)程中要適時(shí)晾蛋

雞胚發(fā)育到中期以后，雞胚的物質(zhì)代謝會(huì)使孵化機(jī)內(nèi)產(chǎn)生大量的生理熱，此時(shí)適當(dāng)?shù)臎龅澳軌驇椭u胚散熱，促進(jìn)氣體代謝，提高雞胚的血液循環(huán)機(jī)能，增加雞胚的活力。涼蛋可以根據(jù)雞胚的發(fā)育情況靈活進(jìn)行。

3.7 孵化過(guò)程注意事項(xiàng)

雞胚在入孵前，必須都要大頭朝上（即氣室在上），這不僅有利于雞胚在孵化過(guò)程中的有氧呼吸，而且后面的接種和收獲也要求氣室朝上。如果倒立孵化容易造成接種位置不準(zhǔn)確而容易扎到雞胚的要害部位導(dǎo)致雞胚死亡，且會(huì)導(dǎo)致機(jī)器收獲的過(guò)程中吸入大量的蛋黃。雖然現(xiàn)在的孵化機(jī)有著智能化的控制系統(tǒng)，但是生產(chǎn)技術(shù)人員還是得定時(shí)檢測(cè)孵化機(jī)內(nèi)的溫度、相對(duì)濕度、通風(fēng)情況和翻蛋是否正常。在雞胚接種前，至少要用照蛋燈觀(guān)察雞胚兩次，及時(shí)地剔除無(wú)精蛋、死胚蛋和弱胚蛋等。

3.7.1 雞胚孵化后第一次照蛋

第一次照蛋在入孵后5 ～6 d 進(jìn)行，此次照蛋主要是剔除無(wú)精蛋、死胚蛋、弱胚蛋和破殼蛋，提高蛋盤(pán)的利用率和觀(guān)察雞胚的發(fā)育水平是否符合胚齡。有些無(wú)精蛋或死胚蛋在孵化機(jī)內(nèi)如果沒(méi)有及時(shí)地剔除，在孵化的過(guò)程中，雞蛋內(nèi)部會(huì)代謝產(chǎn)生大量的氣體（如硫化氫、氨氣等），甚至?xí)?dǎo)致雞蛋發(fā)生“爆炸”，把大量的污染的蛋液噴射到其他的種蛋上，從而影響其他雞胚的發(fā)育甚至是造成二次污染。如發(fā)現(xiàn)有已經(jīng)“爆炸”的蛋，則必須及時(shí)清理和消毒。如照蛋的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)大頭（氣室）向下的蛋也要及時(shí)地糾正。此次照蛋的活胚蛋處于起珠、雙珠階段，主要特征是氣室邊緣明顯，胚胎上浮，隱約可見(jiàn)胚體彎曲，頭部大，有明顯黑點(diǎn)，軀體彎，有血管向四周擴(kuò)張，分布如蜘蛛狀，可見(jiàn)明顯胚動(dòng)。弱胚蛋則胚體小，血管色淺且纖細(xì)，擴(kuò)張面小。死胚蛋的氣室邊緣界線(xiàn)模糊，血管昏暗模糊，無(wú)胚動(dòng)。無(wú)精蛋則蛋內(nèi)透明，沒(méi)用任何的血管或血絲，可見(jiàn)模糊的卵黃陰影，氣室邊緣界線(xiàn)不明顯。在照蛋過(guò)程中要將挑出來(lái)的破殼蛋、無(wú)精蛋、死胚蛋和弱胚蛋嚴(yán)格的按照相應(yīng)的操作規(guī)程處理，避免造成環(huán)境污染。

3.7.2 雞胚孵化后第二次照蛋

第二次照蛋的胚齡在10 ～11 d，此次照蛋主要是剔除死胚蛋、弱胚蛋和發(fā)育不正常的雞胚。保證接種的雞胚是活力足夠好、胚齡符合要求、且氣室位置正常的種蛋。此次照蛋的活胚蛋處于合攏階段，蛋內(nèi)氣室增大，邊界明顯，血管紅潤(rùn)粗大，尿囊血管明顯向尖端（蛋的小頭）“合攏”，還可觀(guān)察到雞胚明顯的胚動(dòng)。弱胚蛋則尿囊血管未向蛋小頭合攏，蛋小頭色淡透明，血管明顯色淺纖細(xì)。死胚蛋則氣室明顯增大，邊界不明顯，蛋內(nèi)半透明無(wú)血管分布或是血管萎縮。此次照蛋完畢后的活雞胚即可送入病毒接種區(qū)，用配制好的重組禽流感病毒液進(jìn)行尿囊腔接種。

4 重組禽流感病毒的接種

與接種有關(guān)的器具在接種前都要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌和消毒，避免造成污染。

4.1 雞胚的手工接種

接種前，利用記號(hào)筆通過(guò)照蛋燈勾出氣室，于氣室稍下方胚胎活躍且血管明顯的區(qū)域中，在血管之間的間隙（避開(kāi)大血管區(qū)域），在胚胎面與氣室交界之邊緣1 mm 畫(huà)上一點(diǎn)作為記號(hào)，此點(diǎn)作為接種點(diǎn)。先配制好重組禽流感病毒稀釋液放一旁待用。再用5%的碘酊棉以接種點(diǎn)為中心進(jìn)行消毒，隨后用75%的酒精棉進(jìn)行脫碘。然后用滅菌的打孔器在接種點(diǎn)打一小孔，最好不損傷殼膜。接著用吸取有重組禽流感病毒液稀釋液的注射器垂直或稍斜插入氣室，刺入尿囊，刺入深度大約15 mm，向尿囊腔內(nèi)注入0.1 mL 病毒液。注射完畢后后，用熔化的石蠟進(jìn)行封口。病毒被注射到尿囊腔后，將會(huì)進(jìn)入內(nèi)胚層細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，繁殖后又會(huì)被釋放到尿囊液中。

4.2 用接毒機(jī)對(duì)雞胚進(jìn)行接種

在大規(guī)模生產(chǎn)中往往采用全自動(dòng)的接毒機(jī)對(duì)雞胚進(jìn)行接種。使用接毒機(jī)進(jìn)行接種主要控制的要點(diǎn)是：①接毒機(jī)在接毒前要進(jìn)行徹底的消毒滅菌處理，防止造成污染，特別是安裝接毒機(jī)頭和種毒瓶等重要的操作要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的要求進(jìn)行。②接毒的雞胚最好能夠大小均勻，接毒深度要調(diào)節(jié)好，保證接毒到位。若雞胚偏大容易造成接毒部位扎得過(guò)深，雞胚容易物理致死；若雞胚偏小容易造成接毒不到位，病毒無(wú)法繁殖，則前功盡棄。③接毒量要準(zhǔn)確，要定時(shí)檢測(cè)接毒針頭的出液量是否符合要求，若出液量不準(zhǔn)，及時(shí)調(diào)整。④要時(shí)時(shí)觀(guān)察雞胚接毒機(jī)的打孔情況。避免打孔針在接毒的過(guò)程中彎曲造成接毒孔過(guò)大或是沒(méi)有完成打孔等，因?yàn)檫@會(huì)加大對(duì)雞胚的物理傷害或是導(dǎo)致沒(méi)有接種成功。⑤接毒的過(guò)程中要定時(shí)對(duì)接毒針頭進(jìn)行消毒，防止交叉污染的發(fā)生。⑥在接毒的過(guò)程中也要時(shí)時(shí)觀(guān)察消毒裝置是否正常。

5 接種后孵化

接種完畢后，將雞胚置于溫度為36 ～37 ℃，相對(duì)濕度45%～55%的孵化機(jī)內(nèi)進(jìn)行繼續(xù)孵化，不必進(jìn)行翻蛋。由于雞胚在接種時(shí)受到了物理創(chuàng)傷，接種后孵化的溫度過(guò)高會(huì)很容易致使雞胚死亡，溫度過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致雞胚發(fā)育緩慢，不利于病毒的大量繁殖；濕度過(guò)高則容易造成雞胚水分蒸發(fā)受阻，影響雞胚進(jìn)行氣體交換，會(huì)降低雞胚的活力，病毒的復(fù)制也會(huì)遲緩。濕度過(guò)低則容易造成雞胚水分蒸發(fā)嚴(yán)重，從而導(dǎo)致收獲的病毒液大大減少。由于接毒后的雞胚胚齡已經(jīng)比較大，氣體交換也比接種前孵化時(shí)要多，所以接種后孵化對(duì)通風(fēng)換氣的要求更高，良好的通風(fēng)換氣能使雞胚保持好的活力。病毒的復(fù)制與雞胚的活力成正相關(guān)關(guān)系，雞胚的活力越好則病毒的繁殖越旺盛。因此在孵化的過(guò)程中對(duì)溫濕度和通風(fēng)換氣的控制非常地重要。所以要定時(shí)檢查孵化機(jī)內(nèi)的溫濕度和通風(fēng)換氣是否正常。良好的培養(yǎng)條件能夠提高收獲病毒液的HA 效價(jià)。

雞胚接種后孵化的過(guò)程中，每日要對(duì)雞胚進(jìn)行照蛋兩次，24 h 前死亡的雞胚全部丟棄。一般24 h內(nèi)死亡的胚多因創(chuàng)傷或細(xì)菌污染所致，且病毒還沒(méi)有大量繁殖，故棄去不用。24 h 以后死亡的雞胚隨時(shí)取出放置于2 ～8 ℃冷庫(kù)冷凍12 ～24 h，當(dāng)中如有胚體發(fā)黑的死胚也棄去不要，因?yàn)檫@些雞胚往往可能是內(nèi)部發(fā)生了污染而致死。接種后的死胚通過(guò)照蛋燈可觀(guān)察到蛋體發(fā)白、發(fā)亮，血管很少、斷裂或是消失，依稀可見(jiàn)的血管也很纖細(xì)?；钆邉t胚體發(fā)紅，蛋體布滿(mǎn)血管，還可見(jiàn)到胚動(dòng)。照蛋的照蛋燈要消毒，使用時(shí)動(dòng)作要輕盈，避免弄破蛋殼，如有蛋殼破裂嚴(yán)重的也棄之不要。照完蛋后，要及時(shí)地將活胚蛋運(yùn)回孵化機(jī)內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行孵育，至72 h后，將所有死胚與活胚分別標(biāo)記，全部氣室向上直立，放置于2 ～8 ℃冷庫(kù)冷凍12 ～24 h。冷凍能夠使雞胚被凍死，使血管萎縮，利于尿囊液的收取，且避免收獲時(shí)流出的血液與尿囊液發(fā)生凝集，造成收獲的重組禽流感病毒液的效價(jià)變低。

6 重組禽流感病毒液的收獲

在收獲前，所有的器具也要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌和消毒，避免造成污染。重組禽流感病毒液的收獲主要是收取雞胚的尿囊液。

6.1 雞胚尿囊液的手工收獲

將已經(jīng)凍好的雞胚從冷庫(kù)中取出，用5%的碘酊擦拭蛋殼整個(gè)氣室部位，然后再用75%的酒精進(jìn)行脫碘。用消毒好的剪刀小心翼翼地剪去氣室部位的蛋殼。注意不要讓蛋殼掉入氣室中。氣室打開(kāi)后，用無(wú)菌眼科鑷子慢慢撕去卵殼膜，然后夾住絨毛尿囊膜輕輕提起，用吸管刺破絨毛尿膜直接吸取尿囊液。為防止羊膜堵住吸管口，可用鑷子輕輕壓下羊膜及胎膜，然后再吸。收獲完畢后，將收獲好的禽流感病毒液放置2 ～8 ℃的環(huán)境下保存，以備濃縮滅活用。剪蛋殼時(shí)盡可能保證氣室端的剪口平滑，且不要將殼膜剪破。挑取胚膜時(shí)，不能碰到雞胚或尿囊液。收獲時(shí)，如發(fā)現(xiàn)胎兒腐敗、胚液混濁及有可疑污染的，則不要收獲。收獲時(shí)的順序?yàn)閺淖蟮接?，從下往上，手及用具不能從已剪過(guò)蛋殼且未收獲的雞胚上方經(jīng)過(guò)。收獲尿囊液時(shí)不能刺破卵黃，避免吸取到卵黃和蛋清。收獲到合格的重組禽流感病毒液應(yīng)該是顏色橙黃清亮且無(wú)污染。

6.2 用收獲機(jī)對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行收獲

在大規(guī)模生產(chǎn)中往往采用全自動(dòng)的收獲機(jī)對(duì)雞胚里的尿囊液進(jìn)行收獲。使用全自動(dòng)收獲機(jī)進(jìn)行收獲主要控制的要點(diǎn)是：①收獲前消毒滅菌處理到位。②根據(jù)蛋的大小調(diào)節(jié)收獲機(jī)頭的高度。若收獲機(jī)頭高度過(guò)高容易造成收獲不干凈，造成浪費(fèi)，如若收獲機(jī)頭高度過(guò)低容易在收獲時(shí)吸取到大量的蛋黃液，嚴(yán)重影響病毒液的品質(zhì)。③要時(shí)時(shí)觀(guān)察收獲機(jī)頭是否插到位，蛋盤(pán)的位置是否到位。④蛋消毒裝置也要時(shí)時(shí)監(jiān)控，保證雞胚消毒到位。⑤收獲到的病毒液要及時(shí)地轉(zhuǎn)至2 ～8 ℃的環(huán)境中保存以備濃縮滅活用，⑥死胚蛋不適合用機(jī)器進(jìn)行收獲。

6.3 收獲后的雞胚無(wú)害化處理

由于收獲后的雞胚中仍然存在著大量的禽流感病毒，不可將其直接暴露到環(huán)境中，避免造成人員或是動(dòng)物的感染。所以收獲后的雞胚必須經(jīng)過(guò)高溫高壓進(jìn)行無(wú)害化處理。滅活后的廢胚經(jīng)檢測(cè)無(wú)菌無(wú)病毒后，才可移交給環(huán)保部門(mén)處理。

7 小結(jié)

用雞胚生產(chǎn)重組禽流感病毒的工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。主要的控制要點(diǎn)是雞胚的選取要優(yōu)質(zhì)合適、雞胚的消毒要到位徹底、雞胚的孵化條件要適宜雞胚健康發(fā)育、病毒的接種要準(zhǔn)確到位、接毒后孵化環(huán)境要利于重組禽流感病毒大量繁殖、病毒液的收獲要防污染。

參考文獻(xiàn)：略