類器官在腫瘤中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景*

高婷 郭瑢 黃勝 陳德滇

惡性腫瘤一直以來都是威脅人類健康的重大疾病，備受關(guān)注。目前，用于研究惡性腫瘤的臨床前模型主要是細胞系和患者源性的腫瘤異種移植。盡管其為腫瘤的研究做出貢獻，但仍有缺陷。近年來，一個新興起的領(lǐng)域—類器官，為腫瘤的研究提供了新的平臺。類器官能夠在體外高度重現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的原始特征，在藥物研究、預(yù)測患者對治療的反應(yīng)以及為患者提供個性化醫(yī)療方案方面，擁有廣闊的前景。目前，已經(jīng)成功培養(yǎng)出如胃腸［1］、肝［2］、前列腺［3］和乳腺［4］等多種類器官。類器官的出現(xiàn)，無疑給腫瘤的研究提供了更多的可能。本文將對類器官的研究現(xiàn)狀及其在腫瘤研究中的應(yīng)用前景進行綜述。

1 現(xiàn)有的腫瘤研究模型

人類腫瘤較為復(fù)雜，不同的腫瘤患者對相同的臨床治療反應(yīng)可能存在很大差異。目前，腫瘤進展的機制以及藥物療效和耐藥的產(chǎn)生機制仍不明確［5］。大量通過Ⅰ期藥物安全性測試的抗癌藥物在Ⅱ、Ⅲ期的療效測試中被淘汰［6］。因此，需要優(yōu)化臨床前療效模型來改進對臨床治療反應(yīng)的預(yù)測，降低臨床試驗的失敗率。目前，正在使用的幾種人類臨床前模型包括細胞系（cell lines）、患者源性的腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenografts，PDTX）和患者源性的腫瘤類器官（patientderived tumor organoid，PDTO）［5］。

1.1 細胞系

細胞系可能是這些技術(shù)中最常見和最完善的。與大多數(shù)其他體外模型相比，細胞系操作起來更容易，成本更低，且易于進行基因修飾。細胞系還能夠在短時間內(nèi)對多種藥物和化合物進行高通量篩選［7］。但細胞系通常來源于單個細胞，而腫瘤通常由多種不同的細胞類型組成，可能具有不同的治療敏感性，因此細胞系不能完整的概括腫瘤多樣性［8］。傳統(tǒng)的細胞系模型缺乏許多關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導因子，這些因子對細胞的增殖、分化和存活起重要作用。因此，利用傳統(tǒng)的細胞系模型在體外條件下預(yù)測患者對治療的體內(nèi)反應(yīng)，可能不夠準確［7］。此外，細胞系培養(yǎng)的細胞是單一的，不能模擬體內(nèi)腫瘤細胞與其他細胞（如基質(zhì)細胞、免疫細胞和神經(jīng)細胞）的相互作用［9］。

1.2 PDTX

PDTX 是將癌細胞或組織移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)建成的臨床前模型［7］。目前，多種癌癥類型已經(jīng)建立了PDTX 模型，包括結(jié)直腸癌［10］、胰腺癌［11］和胃癌［12］。PDTX 模型允許移植細胞或組織在具有脈管系統(tǒng)的腫瘤結(jié)構(gòu)和環(huán)境中生長［13］。有研究利用原發(fā)性非小細胞肺癌的PDTX模型與供體組織相比較，發(fā)現(xiàn)供體組織中檢測到的突變總數(shù)，僅43%突變出現(xiàn)在相應(yīng)的PDTX 模型中，4 個原發(fā)腫瘤中不存在的突變出現(xiàn)在PDTX 模型的早期傳代中［14］。由此可見，PDTX 模型無法完全還原原始腫瘤的基因特性。此外，其還具有諸如耗資耗力、培養(yǎng)周期長、效率低和難以開展高通量藥物篩選工作等局限性［9］。

1.3 PDTO

類器官，來源于組織特異性干細胞的三維體外細胞結(jié)構(gòu)，具有自我組織形成類似于原始組織的“微型器官”的能力，可以彌補傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)在治療反應(yīng)預(yù)測方面的不足。有研究從乳腺癌患者切除的腫瘤中獲得腫瘤組織，通過機械破壞和酶解結(jié)合的方式去除正常組織并分離出乳腺癌細胞，在體外三維培養(yǎng)條件下，成功的建成了可長期培養(yǎng)的乳腺癌類器官［4］。與細胞系相比，PDTO 模型在細胞形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)方面，能更好地顯示與原始腫瘤的相似性。與PDTX 相比，類器官更容易進行基因修飾［15］，也更適合高通量藥物和治療測試。盡管PDTO 是一項相對較新的技術(shù)，但正常組織干細胞來源的類器官和癌癥干細胞來源的類器官已經(jīng)在癌癥生物學和個性化醫(yī)學領(lǐng)域做出巨大的貢獻［7］。來源于正常組織的類器官更加接近正常的生理狀態(tài)，可用來研究人體的生理過程，藥物研究時可用來測試藥物的內(nèi)臟毒性，期待未來可以建成用于器官移植的健康類器官。來源于腫瘤組織的類器官因其能夠高度還原原始腫瘤特性的特點，在為患者提供個性化醫(yī)療方面，具有很大的優(yōu)勢，同時也為腫瘤進展、侵襲和藥物反應(yīng)的研究提供了一個很好的平臺。然而，由于缺乏神經(jīng)支配、血管和免疫細胞，類器官的發(fā)展也受到一定的限制［9］。

2 類器官的應(yīng)用

類器官的應(yīng)用匯總，見圖1。

圖1 類器官的應(yīng)用

2.1 藥物研究

在過去的幾十年里，許多從傳統(tǒng)的細胞系篩選而來的抗癌藥物在臨床研究中均失敗。對于大多數(shù)細胞毒性藥物，在腫瘤細胞系中觀察到廣泛的活性，但對患者的臨床療效卻是有限的。有研究［16］曾評估體外細胞系在預(yù)測臨床療效方面是否可靠。應(yīng)用細胞系來預(yù)測針對乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌的細胞毒性抗癌藥物的藥物活性。結(jié)果表明，體外細胞系模型對結(jié)腸癌無預(yù)測作用，對其他3種癌具有預(yù)測作用。由于腫瘤類器官是接近生理的結(jié)構(gòu)，保留了母瘤的特定功能，并能準確地再現(xiàn)藥物反應(yīng)。因此，類器官技術(shù)填補了基于傳統(tǒng)細胞系的藥物篩選與臨床試驗之間的空白。研究表明，類器官可以作為評價癌癥患者特異性反應(yīng)的良好模型［17-18］。此外，還可用來探索耐藥性背后的詳細因果和遺傳改變。目前，一些癌癥的類器官生物庫已經(jīng)建立，用于識別和測試新藥物，而健康組織的類器官可以用于測試藥物毒理學［19］。

2.1.1 藥物篩選 PDTO 在高通量藥物篩選，為患者選擇合適有效的治療方案方面具有很大潛力。目前，已經(jīng)有研究將類器官應(yīng)用于藥物篩選［20］。有研究［21］通過對20例結(jié)直腸癌患者的腫瘤類器官進行藥物測試，證實腫瘤類器官適用于高通量藥物篩選，并可以檢測基因-藥物關(guān)聯(lián)性。Pauli 等［22］提到在藥物庫中篩選ER+乳腺癌患者源性病例和BRAF 突變黑色素瘤患者源性病例，發(fā)現(xiàn)他莫昔芬、BRAF 和MEK抑制劑為最佳推薦藥物，表明高通量篩選可以確定臨床已驗證的靶向藥物。該研究還認為僅基因組學信息不能夠為大多數(shù)晚期癌癥患者確定治療方案，因此使用PDTO進行高通量藥物篩選，以發(fā)現(xiàn)有效的治療方案。并通過分析2 例子宮惡性腫瘤和2 例結(jié)腸癌來源的腫瘤細胞，確定有效的藥物組合，并使用3-D 培養(yǎng)模型和PDTX 模型對其進行驗證。上述研究均表明，利用腫瘤類器官可進行高通量藥物篩選，檢測基因—藥物關(guān)聯(lián)性，為患者提供個性化的治療方案。

2.1.2 藥代動力學研究 類器官技術(shù)可以應(yīng)用于藥代動力學測試，這是藥物開發(fā)的關(guān)鍵［19］。有研究發(fā)現(xiàn)［23］，由人類誘導多能干細胞生成的腸類器官，具有藥代動力學功能。并發(fā)現(xiàn)在一些小分子化合物的作用下，類器官中可檢測到藥物轉(zhuǎn)運蛋白、通過AB?CB1/MDR1 的外排轉(zhuǎn)運活性以及核受體配體對藥物代謝酶CYP3A4的誘導作用。由此可看出，運用類器官技術(shù)，可以進行藥代動力學研究。

2.1.3 藥物毒理學研究 在藥物開發(fā)中，類器官技術(shù)的另一個主要優(yōu)勢是可以生成和利用正常的類器官來篩選僅針對腫瘤細胞而不傷害健康細胞的藥物［19］。在臨床試驗中，不可耐受不良反應(yīng)是導致藥物失敗的主要原因，包括肝臟毒性、心臟毒性和腎臟毒性［19］。肝類器官可以用于測試藥物的肝毒性［24］。藥物相關(guān)的肝毒性主要是通過細胞色素P450酶介導的，肝類器官能夠接近生理水平觀察到細胞色素P450酶的作用［25］。心臟毒性反應(yīng)如心律失常和心功能降低也可以在類器官中測試［26］。此外，腎類器官也被用于藥物毒理學研究［27］。將類器官技術(shù)應(yīng)用于藥物臨床前的毒理學研究，有助于降低藥物臨床試驗的失敗率，減少藥物臨床試驗階段不良事件的發(fā)生（圖2）。

圖2 用類器官進行藥物篩選

2.2 腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究

類器官通?？梢詮恼５娜祟惿掀ぜ毎蝎@取，可在體外對所有階段的惡性腫瘤進行突變建模。有研究提示［28］，在體外培養(yǎng)各種類型的癌前結(jié)腸瘤具有可行性。基因突變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。為此，多個研究團隊通過對類器官進行基因修飾，來研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制。有研究認為［29］，Kras突變或p53缺失的小鼠胰腺和胃類器官，會導致其發(fā)育異常和過度增生，將這些類器官移植到小鼠體內(nèi)后可形成腫瘤。有研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)將4種通常在結(jié)直腸癌中發(fā)生突變的基因（KRAS、TP53、SMAD4 和APC）引入到人類腸道組織干細胞中［30-31］。Drost 等［31］通過從培養(yǎng)基中去除單個生長因子來選擇突變體，并將其移植到小鼠體內(nèi)，可生長為具有浸潤性癌特征的腫瘤。Matano 等［30］在四突變體的基礎(chǔ)上引入另外一個突變—PIK3CA，并將此五突變體移植到小鼠的腎囊中，同樣可以形成腫瘤。隨后，Drost 等［32］又利用CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除人類結(jié)腸類器官中關(guān)鍵的DNA 修復(fù)基因，并對其進行全基因組測序。該研究還發(fā)現(xiàn)，錯配修復(fù)基因MLH1缺失的類器官可以準確地模擬錯配修復(fù)缺失的結(jié)直腸癌中觀察到的突變譜。有學者通過胰腺類器官研究證實KRAS突變可誘導巨噬細胞成瘤表型，從而促進腫瘤生長［33］。上述研究均闡明了類器官的能力，可用于揭示癌癥基因組的復(fù)雜性以及基因突變在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，有助于癌癥精準治療的藥物靶點的發(fā)現(xiàn)。

2.3 臨床治療的研究

2.3.1 個性化醫(yī)療 個性化醫(yī)療，也稱為精準醫(yī)療，旨在通過在分子和藥物基因組學水平上更好地描述疾病特征，為每個患者制定有效的治療策略［19］。類器官在為患者制定個性化治療方案上具有巨大的潛力。如測量來自囊性纖維化患者的直腸類器官中囊性纖維化跨膜電導調(diào)節(jié)器的功能，可以確定哪些人將受益于囊性纖維化跨膜電導調(diào)節(jié)器矯正治療［34］。為了證實原發(fā)腫瘤的遺傳基因組學特征能否在類器官中被保留下來，有研究［35］對來自14 例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的類器官的1 977 個癌癥相關(guān)基因進行了基因分析。結(jié)果表明，90%的體細胞突變在來自同一患者的類器官和活檢標本中是相同的，并且類器官和相應(yīng)的原始腫瘤的DNA拷貝數(shù)圖譜的相關(guān)系數(shù)為0.89。表明類器官可以很好的捕獲原始腫瘤的遺傳特性，為類器官在個性化醫(yī)療中的應(yīng)用提供有力的證據(jù)。盡管目前類器官技術(shù)在個性化醫(yī)療中還處于不成熟階段，但更深入的研究將完善該模型，拓寬個性化醫(yī)療的視野，替代傳統(tǒng)的“一刀切”治療方式［19］。

2.3.2 預(yù)測患者對治療的反應(yīng) 預(yù)測患者對治療的反應(yīng)是類器官技術(shù)的另一潛在應(yīng)用。可以通過在體外對患者源性類器官進行一些治療操作，以此類器官對治療的反應(yīng)來預(yù)測提供活檢組織的患者對治療的反應(yīng)，以便為患者選擇最合適的治療方案。Hubre?cht 類器官技術(shù)基金會進行了一項關(guān)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌和非小細胞肺癌的大型多中心隊列研究［36］。在該項研究中，來源于轉(zhuǎn)移病灶活檢的腫瘤類器官的藥物反應(yīng)與患者的臨床反應(yīng)呈正相關(guān)。但患者實際治療方案與體外藥物篩選方案中藥物劑量的差異，是需要進一步去探索的難題。目前，已有學者用轉(zhuǎn)移性胃腸癌的類器官來預(yù)測患者對治療的反應(yīng)，并比較了類器官和基于患者源性類器官的原位小鼠腫瘤異種移植模型對抗癌藥物的體外反應(yīng)和臨床試驗中患者的反應(yīng)，陽性預(yù)測值（預(yù)測某一特定藥物有效）為88%，陰性預(yù)測值（預(yù)測某一特定藥物無效）為100%［17］。提示患者來源的類器官能夠在體外條件下預(yù)測患者對治療的反應(yīng)，為個性化醫(yī)療提供指導。

2.3.3 免疫治療 免疫治療是一種新穎而有前景的腫瘤治療策略，利用患者自身的免疫系統(tǒng)來殺死腫瘤細胞。免疫治療的先決條件是惡性細胞表現(xiàn)出足夠的免疫原性來觸發(fā)足夠的免疫反應(yīng)。癌細胞的突變狀態(tài)，有助于新抗原的產(chǎn)生，激活免疫反應(yīng)。然而，由癌細胞新抗原引起的免疫反應(yīng)強度不足，可以通過在體外激活和擴增免疫細胞，應(yīng)用于患者體內(nèi)來解決［19］。多項研究為類器官技術(shù)在免疫治療中的應(yīng)用帶來新的希望。如上皮內(nèi)淋巴細胞在含有白介素-2、白介素-7 和白介素-15 的培養(yǎng)液中，與小鼠腸道類器官共培養(yǎng)，可維持增殖狀態(tài)［37］；有研究成功的進行T淋巴細胞與人原代乳腺上皮類器官的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些T 淋巴細胞可以有效地清除三陰性乳腺癌的癌細胞［38］。這表明，來自健康獻血者的T淋巴細胞可以被類器官在體外擴大和激活，之后用于體內(nèi)治療患者，且可使健康獻血者來源的T細胞對患者來源的類腫瘤細胞的細胞毒性效應(yīng)在體外測試成為可能［19］。將類器官與免疫細胞進行體外共培養(yǎng)，可以擴增免疫細胞，增強免疫反應(yīng)，為后續(xù)的免疫治療提供強而有力的保障。此外，研究腫瘤微環(huán)境也離不開類器官與免疫細胞及其他細胞的共培養(yǎng)技術(shù)。

2.4 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療過程中，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但目前的腫瘤類器官模型普遍缺乏完整的微環(huán)境。然而，最近的研究表明，類器官與TME細胞的共培養(yǎng)為研究TME 的某些特征提供了一種新的方法，如胰腺星狀細胞與胰腺癌類器官共培養(yǎng)產(chǎn)生了典型的胰腺癌間質(zhì)纖維增生，并直接導致了胰腺癌的癌相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）亞型的發(fā)現(xiàn)，其中包括分泌白介素-6 以支持類器官增殖的亞型［28］。另一關(guān)于PDTO-CAF 共培養(yǎng)的研究揭示了兩種不同CAF 亞型的生化途徑，以及在胰腺導管腺癌微環(huán)境中建立不同成纖維細胞群的機制，并闡明了選擇靶向支持腫瘤生長的CAF的方法［39］。盡管如此，這些共培養(yǎng)系統(tǒng)仍在開發(fā)中，目前尚未達到的目標是確定這種PDTO-CAF 共培養(yǎng)是否會對傳統(tǒng)和正在研究的藥物產(chǎn)生耐藥性，以及其是否可以用于優(yōu)化體內(nèi)外治療反應(yīng)［28］。為了在體外模擬糖尿病血管病變，最近的一項研究報道了從多能干細胞形成人血管類器官，這些多能干細胞自我組織成毛細血管網(wǎng)絡(luò)，包括內(nèi)皮細胞和外膜細胞，并被基底膜包圍［40］。該研究將這些類器官移植到小鼠體內(nèi)后，形成了一個穩(wěn)定灌注的血管樹，包括動脈、小動脈和小靜脈。人體血管類器官的建成，為研究TME 提供了新的可能。不僅可以采用PDTO與CAF、免疫細胞共培養(yǎng)，還可以實現(xiàn)PDTO 與血管類器官的共培養(yǎng)，來模擬更多的TME成分。

3 結(jié)語

綜上所述，來源于人體不同組織的類器官，可用于藥物的研究，有利于藥物的篩選和新藥的研發(fā)；也可對其進行基因編輯，來研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制；還可在體外預(yù)測患者對臨床治療的反應(yīng)，有利于為患者制定個性化的醫(yī)療方案。雖然類器官模型具有諸多優(yōu)勢但下述問題仍亟需解決：1）提高生成效率，縮短類器官模型的培養(yǎng)周期，降低培養(yǎng)成本［28］；2）目前的類器官主要來源于上皮細胞，需要進一步研究非上皮類器官的培養(yǎng)方式［19］；3）目前暫無一個具有類器官的最優(yōu)培養(yǎng)條件的標準化方案［9］；4）繼續(xù)完善除免疫細胞和成纖維細胞之外的TME成分與類器官的共培養(yǎng)［28］。腫瘤是個復(fù)雜的疾病，無論發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移機制，還是患者對治療的反應(yīng)和耐藥機制，均有很多尚未明確的問題亟需探索。未來的研究需要不斷完善對TME 的模擬，以創(chuàng)造更為接近原始腫瘤特性的腫瘤類器官模型，從而更為全面地了解惡性腫瘤。