AN04-2治療骨質(zhì)疏松的成藥性評價

宋燕 許元生 張時群 吳才梅 湯宇晴

廣州領(lǐng)晟醫(yī)療科技有限公司，廣東 廣州 10667

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨強度下降，脆性增加和易于骨折的代謝性骨病[1]。伴隨人口老齡化，骨質(zhì)疏松已成為全世界關(guān)注的老年疾病之一。研究表明，2016年中國60歲以上的老年人骨質(zhì)疏松癥患病率為36 %，其中男性為23 %，女性為49 %，骨質(zhì)疏松癥已成為我國面臨的重要公共衛(wèi)生問題[2]。骨質(zhì)疏松患者骨折發(fā)生率高，可引起和加重心腦血管疾病等，對患者的生理、心理健康危害極大，并大大降低生活質(zhì)量，也給社會帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[3]。

骨質(zhì)疏松治療藥物有很多，但絕大多數(shù)為骨吸收抑制劑(如雌激素受體調(diào)節(jié)劑[4]、雙膦酸鹽[5]、RANKL抑制劑[6]、降鈣素[7]等)，而骨形成促進劑(如甲狀旁腺素類似物[8]、阿巴帕肽[9]等)的種類卻非常少。從藥物的治療效果來看，局限在改善癥狀，延緩病情發(fā)展的水平，尚未達到疾病改善甚至治愈的效果，故而現(xiàn)有治療方式并不能滿足臨床需求。

AN04-2是新型的骨質(zhì)疏松治療藥物，為骨關(guān)節(jié)炎治療多肽LH021與人血白蛋白(HSA)的融合蛋白，具有促進骨形成和抑制骨吸收的雙重作用，有可能用于骨質(zhì)疏松的治療。本研究的目的是評價AN04-2治療骨質(zhì)疏松的成藥性，為進入臨床前研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型AB系斑馬魚，年齡為受精后3 d(3 dpf)，委托浙江杭州環(huán)特生物公司進行AN04-2治療斑馬魚骨質(zhì)疏松的研究；12周齡SD大鼠，雌性，購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，委托澎立生物醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司進行AN04-2治療大鼠骨質(zhì)疏松的研究。8周齡SD大鼠雌雄各半，體重180～220 g，購自中山大學(xué)試驗動物中心，委托廣州易沃路科技有限公司進行AN04-2單次給藥毒性研究。

1.2 試劑與藥品

重組人BMP-2 蛋白購自R&D公司，貨號為355-BM/CF；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒，購自碧云天生物，貨號為P0321；潑尼松，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為A1508012；鈣黃綠素(Calcein)，購自美國sigma公司，批號為C0875-5G；鹽酸依替膦酸二鈉水合物(簡稱依替膦酸二鈉)，批號為MFCD00152567，由東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)。特立帕肽注射液(PTH)，批號C879391D，生產(chǎn)廠家為法國Lilly，規(guī)格為2.4 mL/支。

1.3 AN04-2體外對人成骨細(xì)胞ALP表達的影響

方法參考文獻[10-11]并有所改變：人成骨細(xì)胞hFOB1.19復(fù)蘇后，加入MEM培養(yǎng)基，于5 %CO2、37 ℃、飽和濕度下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期的hFOB1.19細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*105個/mL，培養(yǎng)于96孔板，每孔100 μL，加入終濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的AN04-2進行處理，以同體積的PBS作為陰性對照，40 ng/mL的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)作為陽性對照，處理7 d后，以堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒檢測各組的ALP的表達。

1.4 AN04-2對斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的治療作用

方法參考文獻[12-14]并有所改變：隨機選取受精后3 d正常野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每組30尾，用潑尼松誘導(dǎo)斑馬魚建立骨質(zhì)疏松癥模型，分別注射給予不同劑量的AN04-2(5、15、50 ng/尾)，注射體積為10 nL。同時設(shè)置正常對照組(即未經(jīng)潑尼松誘導(dǎo)的斑馬魚)、模型對照組、陽性對照組，正常對照組與模型對照組均注射同體積的生理鹽水，陽性對照組水體給予150 μg/mL的依替膦酸二鈉，28 ℃培養(yǎng)箱孵育96 h后，用0.2 %鈣黃綠素進行染色，染色后進行拍照并采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計斑馬魚脊椎骨熒光強度，以有統(tǒng)計學(xué)意義評價供試品對潑尼松誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的治療作用。

1.5 AN04-2對大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療作用

方法參考文獻[15-18]并有所改變：12周齡雌性SD大鼠隨機分為6組，每組10只。動物以1.5 %～3.0 %異氟烷麻醉后，碘伏消毒皮膚，在下腹中線作縱行切口，鈍性分離皮下組織暴露腹正中線，在腹白線切開腹膜，鈍性游離出一側(cè)卵巢，沿卵巢基底部鉗夾骨盆漏斗韌帶血管、系膜及卵巢固有韌帶，完整切除卵巢，交叉貫穿縫合殘端，同樣的方式切除另一側(cè)卵巢。檢查有無活動出血，無出血，連續(xù)縫合創(chuàng)面，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組不切除卵巢，以卵巢周圍部分脂肪替代，其他操作相同。所有動物術(shù)后連續(xù)3 d給予一定量的鎮(zhèn)痛劑痛立定，每日一次。所有動物手術(shù)結(jié)束后給予一定量的抗生素。麻醉恢復(fù)期動物允許自由的活動及完全負(fù)重，動物實驗人員在麻醉恢復(fù)期須密切監(jiān)控所有動物。

手術(shù)后第2天開始給藥治療，AN04-2低、中、高劑量組分別給予0.06、0.6、6 m/kg的AN04-2，假手術(shù)組與模型對照組給予生理鹽水，給藥體積為1 mL/kg，給藥方式為每周1次皮下注射；陽性對照組給予市售的特立帕肽注射液(PTH，Lily)，劑量為10 μg/kg，給藥方式為每日1次皮下注射。

分別于實驗開始前、實驗中每周1次，及實驗結(jié)束時測量記錄稱重。治療12周后，處死動物，取材腰椎L5及右股骨，采用DXA骨密度儀(Hologic Discovery Wi，USA；Hologic APEX 3.1.2軟件)檢測松質(zhì)骨面積骨密度(BMD)。

1.6 安全性初步評價

180～220 g的SD大鼠30只，按體重隨機分為3組，每組10只，雌雄各半，分別為溶媒對照組、AN04-2低、高劑量組。AN04-2低、高劑量組分別給予50、100 mg/kg的AN04-2，給藥方式為靜脈單次注射，給藥體積為5 mL/kg，溶媒對照組給予相同體積的生理鹽水。給藥后持續(xù)觀察動物的反應(yīng)情況，給藥后第1、3、5、7、14天分別稱重1次，連續(xù)觀察14 d，記錄一般狀態(tài)及體重等[19]。

給藥后立即觀察動物的反應(yīng)情況，并持續(xù)觀察12 h，觀察內(nèi)容包括動物體重、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等變化，記錄動物的死亡情況、中毒癥狀及中毒反應(yīng)的起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間等。

給藥后第 14 天，麻醉動物并安樂死，進行大體解剖檢查，肉眼觀察各器官和組織的變化，并記錄出現(xiàn)異常的組織和器官。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

利用GraphPad Prism (GraphPad Software,Inc.) 進行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析法分析組間平均值。若差異較大，則采用Dunnett’s校驗法進一步分析。當(dāng)P<0.05時為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AN04-2體外對人成骨細(xì)胞的作用

與模型對照組(生理鹽水)相比，0.3～10 μmol/L濃度的AN04-2可顯著促進人成骨細(xì)胞HFOB1.1的ALP的表達(P<0.01)，且量效關(guān)系明顯(圖1)，提示AN04-2具有促進成骨的作用。

圖1 AN04-2對人成骨細(xì)胞ALP表達的影響Fig.1 Effect of AN04-2 on ALP expression in human osteoblasts

圖2 AN04-2對斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的治療作用(拍照)Fig.2 Therapeutic effect of AN04-2 on zebrafish osteoporosis model

2.2 AN04-2對斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的治療作用

潑尼松龍誘導(dǎo)，建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。與正常對照相比，模型對照組斑馬魚脊椎骨熒光強度顯著下降(P<0.001)，表明模型構(gòu)建成功。與模型對照組相比，陽性對照組斑馬魚脊椎骨熒光強度顯著升高(P<0.001)，表明試驗系統(tǒng)成立，可用于評價藥物對骨質(zhì)疏松的治療作用。

與模型對照組相比，劑量為15、50 ng/尾的AN04-2治療，斑馬魚脊椎骨熒光強度顯著升高(P<0.001)，骨密度分別比模型對照組增加74.58 %和62.88 %，劑量為5 ng/尾的AN04-2治療，斑馬魚脊椎骨熒光強度則沒有明顯的升高(P>0.05)(表1、圖3)，提示AN04-2對潑尼松誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松具有劑量依賴的治療作用。

表1 AN04-2對斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的治療作用Table 1 Therapeutic effect of AN04-2 on zebrafish osteoporosis

2.3 AN04-2對大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療作用

治療12周后，與假手術(shù)組相比，模型對照組第五腰椎(L5)和右股骨的BMD明顯降低(P<0.01)，顯示模型構(gòu)建成功。與模型對照組相比，陽性對照組(PTH治療)第五腰椎和右股骨的BMD明顯升高(P<0.01)，提示試驗系統(tǒng)成立，可以用于評價藥物對骨質(zhì)疏松的治療作用。

與模型對照組相比，1周1次皮下注射不同劑量的AN04-2，治療組第五腰椎和右股骨的BMD有升高的趨勢(表2)，但差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，顯示1周1次皮下注射AN04-2對于骨質(zhì)疏松雖有一定的治療作用，但治療作用較弱，與每日1次皮下注射的市售陽性藥物(PTH)相比，并沒有明顯的治療優(yōu)勢，可能提示AN04-2的半衰期不能支持1周1次的給藥周期。

表2 AN04-2對大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療作用Table 2 Therapeutic effect of AN04-2 on rat osteoporosis

2.4 安全性初步評價

給藥治療期間，各組大鼠均活動正常、毛發(fā)光滑，體重呈正常增長，未見明顯異常反應(yīng)，各組動物均無死亡。體重變化如表4所示。

表3 各組體重變化及死亡情況Table 3 Weight change and death in each treatment

AN04-2處理14 d后，處死各組大鼠，進行大體剖檢。各組大鼠臟器形態(tài)、重量均正常，未見明顯異常。

SD大鼠靜脈注射給予AN04-2高至100 mg/kg，未見明顯不良反應(yīng)。靜脈注射的最大耐受劑量(MTD)為100 mg/kg。

3 討論

AN04-2是新型的擬用于治療骨質(zhì)疏松的融合蛋白藥物，本文對其治療骨質(zhì)疏松的成藥性進行評價，以推動其盡快進入臨床前開發(fā)。

眾所周知，骨質(zhì)疏松目前的治療藥物很多，但絕大多數(shù)為骨吸收抑制劑(如雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽、RANKL抑制劑、降鈣素等)，而骨形成促進劑(如甲狀旁腺素類似物、阿巴帕肽等)的種類卻非常少。在體內(nèi)外試驗中，AN04-2可以顯著的促進成骨細(xì)胞ALP的表達，顯著提高斑馬魚脊椎骨的骨密度，屬于新型的骨形成促進劑，這是該藥物獨特的作用特點。

AN04-2對大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療作用則較弱，藥效不及市售藥物PTH。但需要注意的是，AN04-2為每周注射1次，而PTH為每日注射，AN04-2的給藥頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PTH，這可能影響了AN04-2的藥效作用。后續(xù)有必要考察AN04-2每周2次或者每日1次與PTH的藥效比較。

AN04-2的安全性非常好，大鼠靜脈注射高至100 mg/kg，無任何毒性反應(yīng)。良好的安全性，有利于保證其臨床應(yīng)用。

綜上所述，AN04-2可顯著提高骨質(zhì)疏松模型的骨密度，同時安全性好，具有較好的成藥性，后續(xù)優(yōu)化其給藥周期，則有希望開發(fā)為治療骨質(zhì)疏松的新型藥物。