基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析ANO1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義*

張 喆，陳俊杰，武冠廷，支 尹，陳國(guó)梁，董曉強(qiáng)，何宋兵

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科,江蘇蘇州 215006

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,在所有癌癥相關(guān)病死率中的排名僅次于肺癌[1],特別是已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期患者，5年生存率更是不足10%，且近年來(lái)發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[2]。結(jié)腸癌具有高度異質(zhì)性的特點(diǎn)，即使同一類型具有相似特征的腫瘤也會(huì)出現(xiàn)不同的生物學(xué)行為。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代下全基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,傳統(tǒng)的診療手段已經(jīng)不能滿足人們個(gè)體化治療的需求。因此從分子水平區(qū)分個(gè)體差異,探索腸癌相關(guān)特異性基因，是完善結(jié)腸癌診療及預(yù)后評(píng)估體系的重要途徑。

ANO1也被稱為跨膜蛋白16A(TMEM16 A)，是鈣激活的氯離子通道的分子基礎(chǔ)，該基因定位于染色體11q13，編碼具有8個(gè)結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白[3]。ANO1在體內(nèi)各組織中廣泛存在,參與不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖、平滑肌收縮、神經(jīng)和心臟興奮性等多種生理功能[4]，近年來(lái)其在前列腺癌[5]、頭頸鱗癌[6]、食管鱗癌[7]、乳腺癌[8]等多類腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮作用也已有證實(shí)[9-10]。ANO1在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)中的顯著表達(dá)，被作為GIST臨床診斷的特異性標(biāo)志[11]，而有關(guān)ANO1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義的報(bào)道相對(duì)少見(jiàn)。本課題組利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)研究了ANO1在結(jié)腸癌中的差異表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響，旨在探討ANO1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，以期為精準(zhǔn)醫(yī)療下結(jié)腸癌的個(gè)體化診療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)材料收集 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址：https://portal.gdc.cancer.gov/)下載結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)RNA-seq數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，得到RNA-seq研究樣本共437例，納入相關(guān)臨床樣本385例。

1.2數(shù)據(jù)整理和基因差異分析 整理RNA-seq樣本并使用R語(yǔ)言進(jìn)行歸一化處理，同時(shí)對(duì)患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和整理，刪除臨床資料中失訪及目標(biāo)信息不完整的病例。提取ANO1單基因樣本及相對(duì)應(yīng)的臨床資料樣本，利用R語(yǔ)言Wilcox.Test方法鑒別目標(biāo)基因在腫瘤和癌旁組織的表達(dá)差異。

1.3ANO1與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性分析 根據(jù)ANO1表達(dá)數(shù)據(jù)由低至高排列，以表達(dá)量中位數(shù)為界限分別定義高、低表達(dá)組，研究ANO1表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。將各樣本ANO1表達(dá)量和生存信息結(jié)合，利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步驗(yàn)證ANO1的預(yù)后價(jià)值。

1.4基因集富集分析(GSEA) 使用GSEA 3.0版軟件對(duì)應(yīng)分析ANO1高表達(dá)組和低表達(dá)組對(duì)相關(guān)基因集的影響。選用GSEA中c2.cp.kegg.V7.0.symbols.gmt 規(guī)范化基因集，運(yùn)用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法，每次分析對(duì)基因組進(jìn)行1 000次排列。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用R3.6.1版本軟件。對(duì)ANO1基因在腫瘤組織和癌旁組織中表達(dá)量的差異分析采用R語(yǔ)言Wilcox.Test方法。采用Kruskal.Test和Logistic回歸方法分析基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。結(jié)腸癌患者生存分析采用Kaplan-Meier曲線聯(lián)合Log-rank 檢驗(yàn)，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GSEA中將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05且P<0.05作為顯著性富集的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1ANO1在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá) 對(duì)TCGA中ANO1在結(jié)腸癌癌旁組織(39例)和結(jié)腸癌腫瘤組織(398例)中的相對(duì)表達(dá)量分析顯示，在腫瘤組織中，ANO1的表達(dá)量明顯增高(P<0.01)，提示ANO1表達(dá)上調(diào)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。見(jiàn)圖1。

圖1 ANO1在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2ANO1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理因素的相關(guān)性 將398例結(jié)腸癌腫瘤樣本ANO1 mRNA表達(dá)情況與相對(duì)應(yīng)的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ANO1的表達(dá)與N分期即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，隨著N分期的升高ANO1相對(duì)表達(dá)量遞增(P<0.05)，見(jiàn)圖2。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，ANO1的表達(dá)量與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、分期，以及腫瘤是否突破肌層、是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖2 ANO1相對(duì)表達(dá)量與N分期的相關(guān)性

表1 ANO1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理因素的相關(guān)性分析

2.3ANO1 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響 以ANO1相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為界將結(jié)腸癌患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組，生存分析結(jié)果顯示，ANO1高表達(dá)和低表達(dá)患者1、3、5年生存率分別為0.83、0.70、0.52和0.90、0.82、0.70，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示ANO1高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的不良預(yù)后有關(guān)，見(jiàn)圖3。單因素Cox分析結(jié)果提示，年齡、T分期、N分期、M分期及ANO1表達(dá)量能夠影響患者總體生存時(shí)間(P<0.05)，而性別對(duì)預(yù)后情況并無(wú)明顯影響。將以上因素納入Cox回歸模型進(jìn)行多變量分析，結(jié)果顯示，除年齡外，只有ANO1表達(dá)量是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(HR=1.03，95%CI：1.00～1.06，P=0.047)。見(jiàn)表2。

圖3 ANO1表達(dá)量與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

表2 影響預(yù)后參數(shù)的單因素和多因素分析

2.4ANO1相關(guān)富集基因集 GSEA結(jié)果顯示，ANO1高表達(dá)樣本富集至鈣離子信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、WNT、JAK/STAT、HEDGEHOG、NOTCH 腸癌相關(guān)信號(hào)通路等基因集；同時(shí)，ANO1對(duì)胰腺癌、前列腺癌等多個(gè)癌癥通路的激活亦有促進(jìn)作用，提示ANO1高表達(dá)可能與腸癌發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 GSEA中ANO1相關(guān)富集基因集

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)多基因共同參與的多階段復(fù)雜過(guò)程，涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)相關(guān)分子表達(dá)的改變，具有高度異質(zhì)性[12]。結(jié)腸癌起病隱匿，多數(shù)患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)機(jī)。精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代背景下，醫(yī)學(xué)研究者對(duì)于疾病的轉(zhuǎn)歸需要有更深層次的認(rèn)識(shí)，因此，從基因水平研究結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，以期獲得更有效的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，是近年來(lái)結(jié)腸癌的研究熱點(diǎn)。

2008年，CAPUTO等[13]研究證實(shí)ANO1是經(jīng)典的鈣激活氯離子通道蛋白家族中的一員，腫瘤細(xì)胞內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運(yùn)的異常對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等活動(dòng)有重要影響，上皮細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)被破壞及細(xì)胞膜表面離子通道表達(dá)異常是誘導(dǎo)癌癥進(jìn)展的原因之一[14]。ANO1所位于的人類染色體11q13 區(qū)域，其在多種上皮組織來(lái)源癌癥中發(fā)生擴(kuò)增和該區(qū)域部分基因在相關(guān)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，已引起眾多學(xué)者的關(guān)注。

ANO1通過(guò)其氯離子通道蛋白活性參與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，影響相關(guān)腫瘤的進(jìn)展[15]。LIU等[16]在前列腺癌的研究中，通過(guò)不同方法沉默內(nèi)源性ANO1可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，證明了ANO1在前列腺癌腫瘤中過(guò)表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞增殖及高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為前列腺癌診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。一項(xiàng)關(guān)于頭頸鱗癌的研究表明，ANO1可作為頭頸鱗癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，是影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期分期的因素之一[17]。此外，ANO1在乳腺癌[8]、肺癌[18]等腫瘤中的促癌作用已被證實(shí)，ANO1過(guò)表達(dá)有望成為腫瘤不良預(yù)后的標(biāo)志物[19]。SUI等[20]關(guān)于ANO1與結(jié)腸癌關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，敲除大腸癌ANO1后可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證了ANO1在結(jié)腸癌中的表達(dá)對(duì)預(yù)后生存的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中ANO1表達(dá)明顯高于癌旁組織，ANO1高表達(dá)可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與N分期相關(guān)。本研究結(jié)果與AYOUB等[17]和RODRIGO等[21]的結(jié)論相似。ANO1過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而增加患者不良預(yù)后的可能性。在進(jìn)一步的生存和預(yù)后分析中可以看到，ANO1高表達(dá)結(jié)腸癌患者的遠(yuǎn)期生存率顯著下降，是不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素，進(jìn)一步說(shuō)明ANO1基因可作為評(píng)價(jià)結(jié)腸癌患者臨床預(yù)后的指標(biāo)。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往受特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響，鈣離子和氯離子通路參與細(xì)胞凋亡，在癌癥發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用[22-23]。MAPK信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要意義。通過(guò)自身氯離子通道活性來(lái)激活和影響MAPK細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路可能是ANO1參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的另一條重要途徑[24]。此外，ANO1還可通過(guò)干擾CAMK、HEDGEHOG、EGFR等其他信號(hào)通路的活動(dòng)來(lái)影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[19]，部分結(jié)果在本研究中也得到了驗(yàn)證。GSEA結(jié)果顯示，ANO1高表達(dá)樣本除了在鈣離子信號(hào)通路高度富集，同時(shí)也富集至MAPK、WNT、JAK/STAT、HEDGEHOG、NOTCH 等腸癌相關(guān)通路等基因集，不僅如此，ANO1對(duì)前列腺癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌對(duì)多個(gè)癌癥通路的激活亦有促進(jìn)作用。由此可以推測(cè)ANO1可以通過(guò)對(duì)多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)影響多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步證實(shí)了ANO1基因在結(jié)腸癌中高表達(dá)且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的標(biāo)志物，補(bǔ)充了結(jié)腸癌的診療和預(yù)后體系。另外，ANO1參與調(diào)節(jié)多條癌癥相關(guān)信號(hào)通路有可能成為結(jié)腸癌靶向治療的新藥物靶點(diǎn)，為精準(zhǔn)時(shí)代下個(gè)體化診療提供方向。本研究選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)樣本量較大，數(shù)據(jù)庫(kù)的可信度較高，但仍存在不足之處，因TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的數(shù)據(jù)均為mRNA水平，并不能完全反映ANO1在蛋白水平的實(shí)際表達(dá)情況，后續(xù)本課題組將結(jié)合病理免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步研究和探討ANO1在結(jié)腸癌中的臨床意義及其相關(guān)分子機(jī)制。