茜素絡(luò)合物對青海湖裸鯉幼魚的耳石標(biāo)記研究

江華敏，吳金平，吳艷紅，祁洪芳，周衛(wèi)國，付生云，杜 浩，

(1.青海湖裸鯉救護(hù)中心，青海省青海湖裸鯉繁育與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810016；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430223)

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)屬鯉科、裂腹魚亞科、裸鯉屬，是青海湖中唯一的水生經(jīng)濟(jì)魚種，也是國家重點(diǎn)保護(hù)物種，在青海湖魚鳥共生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。由于生態(tài)環(huán)境的惡化以及過度捕撈等因素的影響，其種群構(gòu)成日益低齡化，資源面臨枯竭，已嚴(yán)重影響青海湖及周邊流域生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)(張金蘭等，1997；史建全等，2016)。因此，開展人工增殖放流活動(dòng)以恢復(fù)青海湖裸鯉種群數(shù)量與結(jié)構(gòu)就顯得尤為重要，截至2019年已累計(jì)放流青海湖裸鯉1齡魚種1.56億尾。與此相對應(yīng)，放流后進(jìn)行效果評價(jià)將具有重要意義。當(dāng)前，青海湖裸鯉資源量和增殖放流效果的評價(jià)主要是基于青海湖的水聲學(xué)調(diào)查來獲得青海湖裸鯉的資源量、密度分布特征和種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)特征等相關(guān)信息(張信，2005；楊君興等，2013)。標(biāo)志放流是對增殖放流效果進(jìn)行科學(xué)評估的重要手段之一(楊永宏等，2011；張雪等，2013)，但該方法在青海湖裸鯉相關(guān)的研究上仍沒有得到很好的應(yīng)用，尤其是青海湖裸鯉幼魚的耳石熒光物質(zhì)標(biāo)記方面的研究尚屬空白。

魚的常用標(biāo)記法有體外標(biāo)記法、體內(nèi)標(biāo)記法、自然標(biāo)記法、化學(xué)標(biāo)記法、生物遙測法、分子遺傳標(biāo)記法等，其中耳石熒光標(biāo)記屬體外標(biāo)記中的化學(xué)標(biāo)記，該標(biāo)記方法適合于大規(guī)模增殖放流(張雪等，2013)。1990年，Muncy等通過給魚浸泡、投喂或注射著色劑、染料、放射性同位素、稀土化合物、金屬元素和熒光化合物等無機(jī)物，探索化學(xué)標(biāo)記魚的有效方法，而今熒光標(biāo)記法中的常用物質(zhì)茜素絡(luò)合物使用廣且對于仔稚魚效果較好。熒光標(biāo)記尤其是ALC標(biāo)記具有操作簡單、成本低、對受標(biāo)記對象傷害小、保留率高與檢測直觀等優(yōu)點(diǎn)。但過高的染料浸泡及過長的浸泡時(shí)間等都可能對被標(biāo)記生物產(chǎn)生急性或慢性毒害作用，影響被標(biāo)記生物的生長、發(fā)育、行為，甚至?xí)斐伤劳?耿倩等，2016)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探索ALC對青海湖裸鯉放流魚種的耳石熒光標(biāo)記效果，探尋適宜浸泡濃度和浸泡時(shí)間，以便為后續(xù)開展增殖放流效果評估提供技術(shù)支撐。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)魚和養(yǎng)殖條件

本實(shí)驗(yàn)在青海省西寧市的青海湖裸鯉救護(hù)中心開展，實(shí)驗(yàn)所用青海湖裸鯉幼魚為中心2019年7月自行人工繁育的健康苗種(5月齡)。實(shí)驗(yàn)開始前，隨機(jī)挑選規(guī)格一致的幼魚[全長(7.0±0.7)厘米，個(gè)體重(3.0±1)克，總計(jì)1 800尾]作為實(shí)驗(yàn)魚，在清洗消毒后的亞力克魚缸(長32厘米×寬20厘米×高17厘米)內(nèi)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間連續(xù)曝氣，投喂粉狀飼料，每天投喂2次，換水量為養(yǎng)殖水體的1/4。2019年12月2日開始進(jìn)行ALC對青海湖裸鯉急性毒性致死性實(shí)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)曝氣，不喂食。根據(jù)急性毒性致死性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，于12月9日進(jìn)行標(biāo)記有效性實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記期間連續(xù)曝氣，不喂食，標(biāo)記后轉(zhuǎn)入循環(huán)水續(xù)養(yǎng)缸(長29厘米×寬4厘米×高9厘米)內(nèi)恢復(fù)養(yǎng)殖，續(xù)養(yǎng)時(shí)間60天，續(xù)養(yǎng)期間每天投喂2次，每周換水1次，換水量占總養(yǎng)殖水體的1/4。在暫養(yǎng)及整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，水溫18～20℃、pH≤8、溶氧4.83～5.18毫克/升，采用自然光照。

2.實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)的茜素絡(luò)合物為上海邁坤化工有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為1克/瓶。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，第1階段為茜素絡(luò)合物對青海湖裸鯉急性毒性實(shí)驗(yàn)，參考羅穎等(2019)的氨氮對青海湖裸鯉急性毒性實(shí)驗(yàn)。使用ALC對青海湖裸鯉幼魚進(jìn)行96小時(shí)靜水式急性實(shí)驗(yàn)，濃度分別為0、20、25、40、50、80、100、150、160、320毫克/升，并設(shè)置對照組，各組隨機(jī)選擇10尾魚。持續(xù)觀察96小時(shí)，及時(shí)打撈死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)中在12、24、36、48、60、72、84、96小時(shí)分別記錄標(biāo)記缸中實(shí)驗(yàn)魚的個(gè)體急性死亡數(shù)量，獲得24、48、72和96小時(shí)的半致死濃度，計(jì)算獲得96小時(shí)的安全濃度。

第2階段為茜素絡(luò)合物對青海湖裸鯉標(biāo)記效果實(shí)驗(yàn)，依據(jù)ALC對青海湖裸鯉幼魚的安全浸泡濃度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組及標(biāo)記組(30、50、70、80、90、100、130毫克/升)，每組隨機(jī)選擇70尾魚進(jìn)行浸泡實(shí)驗(yàn)，在6、12、24小時(shí)分別取樣20尾分組續(xù)養(yǎng)。續(xù)養(yǎng)階段在3天和60天兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)測量體重、全長，每組取樣5尾解剖取出微耳石，觀察標(biāo)記留存率。對空白組和最高濃度組(浸泡濃度130毫克/升、時(shí)間24小時(shí)的標(biāo)記組)在3、30、60天3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)測量體重和全長，通過擬合線性方程判斷生長差異。

3.耳石的提取、制備及檢測

將測量體重、全長后的魚苗置于雙筒解剖鏡下，剖開魚苗的聽囊，用鑷子取出最易于分辨拾取的微耳石，用去離子水清除耳石表面的薄膜及雜質(zhì)，再用無水乙醇脫水、干燥，避光保存至EP管中。使用尼康倒置熒光顯微鏡ti2-U的可見光、藍(lán)色激發(fā)光、綠色激發(fā)光和紫外線光對耳石進(jìn)行觀察，比較最適光源，并利用顯微鏡自帶的軟件NIS-Elements AR進(jìn)行圖像處理。

二、結(jié)果

1.茜素絡(luò)合物對青海湖裸鯉急性毒性濃度

在不同濃度的茜素絡(luò)合物溶液浸泡下，根據(jù)浸泡96小時(shí)內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚死亡情況，使用寇氏法計(jì)算茜素絡(luò)合物在24、48、72、96小時(shí)對青海湖裸鯉的半致死濃度(LC50)，同時(shí)計(jì)算出24～96小時(shí)的置信區(qū)間，再使用Turubell公式計(jì)算安全濃度(SC)。

24小時(shí)的LC50為205.35毫克/升，置信區(qū)間為140.61～300.61毫克/升；48時(shí)的LC50為175.79毫克/升，置信區(qū)間為133.65～231.21毫克/升；72小 時(shí) 的LC50為150.66毫 克/升，置 信 區(qū) 間 為113.24～200.45毫 克/升；96小 時(shí) 的LC50為138.04毫克/升，置信區(qū)間為81.47～274.79毫克/升。SC為38.78毫克/升。

2.茜素絡(luò)合物對青海湖裸鯉幼魚的標(biāo)記效果

(1)ALC在青海湖裸鯉微耳石上的印跡形態(tài)。在熒光顯微鏡下觀察耳石上的標(biāo)記效果，發(fā)現(xiàn)未用ALC染色組在綠色、藍(lán)色和紫色激發(fā)光下分別呈現(xiàn)純黃、純綠和純藍(lán)顏色的耳石顏色。ALC染色組在綠色激發(fā)光下未能看見明顯不同，整個(gè)耳石顏色仍然呈現(xiàn)為純黃色。ALC染色組在藍(lán)色激發(fā)光下，染色耳石核心部與邊緣部分出現(xiàn)明顯差異，未染色耳石邊緣部仍然是純綠，染色耳石部為藍(lán)綠色。ALC染色組在紫色激發(fā)光下，染色耳石核心部與邊緣部分也出現(xiàn)明顯差異，未染色耳石邊緣部為淺藍(lán)色，染色成功的耳石部為淡白色。對比90毫克/升浸泡12小時(shí)后，在浸泡后3天和60天取樣，可以明顯看到耳石的增長，原有染色標(biāo)記在60天后仍能有很好的留存。相比較而言，藍(lán)色激發(fā)光下對耳石標(biāo)志的檢測效果最好。

(2)不同濃度ALC在青海湖裸鯉微耳石上的標(biāo)記效果及留存率。使用藍(lán)色激發(fā)光，觀察檢測不同標(biāo)記濃度續(xù)養(yǎng)3天的實(shí)驗(yàn)魚耳石，按“未見(0)”“微弱(1)”“可見(2)”“明顯(3)”和“強(qiáng)烈(4)”5個(gè)等級記錄，發(fā)現(xiàn)隨著ALC濃度和浸泡時(shí)間的增加，熒光標(biāo)記環(huán)標(biāo)記率和標(biāo)記強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢。再比較續(xù)養(yǎng)60天的實(shí)驗(yàn)魚的耳石，標(biāo)記效果與續(xù)養(yǎng)3天時(shí)取出的耳石相比，“強(qiáng)烈(4)”的標(biāo)記效果無減退現(xiàn)象，耳石邊緣因生長變寬而明顯外移，耳石自發(fā)的綠色熒光與ALC標(biāo)記環(huán)顏色對比更清晰。但低于“可見(2)”的，標(biāo)記環(huán)逐漸難以辨認(rèn)。在30～80毫克/升的標(biāo)記濃度下，標(biāo)記效果不明顯，并隨著續(xù)養(yǎng)時(shí)間加長而難以觀察；90毫克/升及以上的標(biāo)記濃度下標(biāo)記效果加強(qiáng)，隨著時(shí)間的加長、濃度的提高逐漸穩(wěn)定，且在浸泡于90毫克/升ALC中12小時(shí)效果穩(wěn)定于“強(qiáng)烈(4)”。

3.茜素絡(luò)合物標(biāo)記后對青海湖裸鯉生長的影響

對比標(biāo)記組和對照組裸鯉的體重、DWG、SGR、存活率，兩組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。標(biāo)記期間，所有標(biāo)記組和對照組實(shí)驗(yàn)魚死亡率均為0，游泳能力正常，無異常行為，說明ALC標(biāo)記對青海湖裸鯉產(chǎn)生的影響較小或者未產(chǎn)生影響。在共計(jì)60天的續(xù)養(yǎng)過程中，標(biāo)記組(染色時(shí)長24小時(shí)組)和對照組在魚體發(fā)育的成熟度上無明顯差異，攝食和游泳能力皆正常。

經(jīng)在3、30、60天3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)測量，濃度最高的標(biāo)記組(130毫克/升濃度、24小時(shí)，15尾)與空白組(無標(biāo)記，15尾)魚的生長差異不明顯，標(biāo)記組體重?cái)M合線性方程為W＝0.054x＋6.85(R2＝0.9908)，全長擬合線性方程為L＝0.0958x＋2.575(R2＝0.9694)；空白組體重?cái)M合線性方程為W＝0.05665x＋6.7783(R2＝0.9893)，全長擬合線性方程為L＝0.103x＋2.2233(R2＝0.9676)，兩組裸鯉體重和全長的a值相近。

三、討論

1.ALC對青海湖裸鯉幼魚的安全浸泡濃度的確定

熒光標(biāo)記方法因其成本低、對受試對象損傷小及標(biāo)記效果好而被廣泛應(yīng)用于魚的大規(guī)模標(biāo)記。但標(biāo)記過程中，藥物的選擇及適宜濃度的確定顯得尤為重要，因?yàn)椴煌~對于藥物的敏感度不一致，即使同種藥物對不同魚的耐受范圍差異也很大(潘建雄，2019)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水溫19℃、pH≤8、溶氧4.83～5.18毫克/升的條件下，5月齡青海湖裸鯉幼魚在100毫克/升的ALC中浸泡36小時(shí)，其死亡率為20%；150毫克/升的ALC中浸泡36小時(shí)，其死亡率為30%；320毫克/升的ALC中浸泡12小時(shí)，其死亡率為100%。存活率是衡量較適標(biāo)記的條件之一。經(jīng)寇式計(jì)算法計(jì)算急性毒性實(shí)驗(yàn)中的LC50及置信區(qū)間，本實(shí)驗(yàn)確定ALC濃度為90毫克/升時(shí)浸泡青海湖裸鯉幼魚12小時(shí)是安全的。但也有研究表明，ALC浸泡虹鱒濃度為20毫克/升時(shí)就會出現(xiàn)大量死亡，而300毫克/升的ALC浸泡日本牙鲆時(shí)還未發(fā)生死亡。靳建波等(2011)用120毫克/升ALC溶液浸泡秦嶺細(xì)鱗鮭仔魚12小時(shí)，其成活率為92.3%；徐永江等(2016)用150毫克/升ALC溶液浸泡半滑舌鰨魚苗36小時(shí)，其成活率為90%。這些研究結(jié)果與邱晨等(2019)使用100毫克/升的ALC浸泡48小時(shí)標(biāo)記14日齡鯉仔魚及100毫克/升的ALC浸泡5天標(biāo)記鯽幼魚，趙亞鵬等(2013)使用100毫克/升ALC浸泡標(biāo)記90日齡金線鲃稚魚24小時(shí)，何春林等(2008)使用300毫克/升的ALC浸泡12小時(shí)標(biāo)記8日齡重口裂腹魚仔魚的研究結(jié)果不一致。上述研究結(jié)果充分表明不同的受試對象對ALC溶液浸泡濃度的敏感性不一致，這可能與實(shí)驗(yàn)魚種類、規(guī)格及對茜素絡(luò)合物的敏感性等因素有關(guān)。因此，對每種魚適宜的ALC浸泡濃度與浸泡時(shí)間的確定是必要的。

2.茜素絡(luò)合物對青海湖裸鯉標(biāo)記效果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同浸泡濃度下浸泡時(shí)間越長，染色效果越好。綜合考慮存活率和標(biāo)記率，對于5月齡青海湖裸鯉幼魚最適標(biāo)記濃度為90毫克/升，標(biāo)記時(shí)長為12小時(shí)。該標(biāo)記濃度下存活率和耳石標(biāo)記率達(dá)100%，且顯示強(qiáng)度均能達(dá)到“強(qiáng)烈”。續(xù)養(yǎng)60天后，在熒光顯微鏡下仍能觀察到明顯的標(biāo)記環(huán)，且耳石自發(fā)的綠色熒光與ALC標(biāo)記環(huán)顏色對比更加清晰，更易于觀察到，這與鯉仔魚上的研究結(jié)果相似(邱晨等，2019)，可見ALC對青海湖裸鯉幼魚耳石的標(biāo)記效果較好。

3.茜素絡(luò)合物標(biāo)記后對青海湖裸鯉生長的影響

適宜的標(biāo)記行為對動(dòng)物的生長、繁殖、生活習(xí)性沒有明顯的影響，故而標(biāo)記放流后的回捕數(shù)據(jù)可用于對放流效果的追蹤評估(劉奇，2009；馬曉林等，2016)。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)ALC標(biāo)記處理的青海湖裸鯉幼魚活動(dòng)等行為與空白組無明顯區(qū)別，游泳能力正常。浸泡處理后，在60天的續(xù)養(yǎng)過程中，標(biāo)記組魚的活動(dòng)及攝食等行為與空白組無顯著差異。續(xù)養(yǎng)60天的過程中，對比標(biāo)記組和對照組的體重、DWG、SGR、存活率，方差分析表明青海湖裸鯉幼魚的生長指標(biāo)在標(biāo)記組和對照組間無顯著性差異(P＞0.05)。在續(xù)養(yǎng)的30天和60天的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，標(biāo)記組與空白組存活率均為100%，采用直線方程(L＝a·d＋b)擬合空白組和130毫克/升濃度浸泡24小時(shí)的標(biāo)記組，兩組魚體重和全長的a值相近，表明適宜濃度的ALC標(biāo)記對后續(xù)青海湖裸鯉的生長和存活沒有顯著影響，與朱亞華等(2019)的研究結(jié)果一致。

四、小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)條件下，青海湖裸鯉5月齡幼魚的最適ALC標(biāo)記濃度為90毫克/升，浸泡時(shí)間為12小時(shí)，耳石標(biāo)記在藍(lán)色激發(fā)光下均能達(dá)到“強(qiáng)烈”，同時(shí)續(xù)養(yǎng)60天后標(biāo)記仍清晰可見，且與耳石新生長的外延部分可形成明顯對比。本研究結(jié)果提供了一種青海湖裸鯉幼魚的增殖放流標(biāo)記方案，可用于后期青海湖裸鯉增殖放流效果的監(jiān)測。