γ-Fe2O3納米材料與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對大豆生長及產(chǎn)量的協(xié)同促進機制

張辰弛，馬揚旸，曹雪松，王震宇

（環(huán)境過程與污染控制研究所/江南大學環(huán)境與土木工程學院，江蘇無錫 214122）

全球人口數(shù)量預計到2050年將達到97億，屆時為滿足全球人口需求，糧食產(chǎn)量需達到約148億t[1-2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織 (FAO) 統(tǒng)計，全球近三分之一的土地已用于農(nóng)耕[3]。在有限的耕地面積內(nèi)，為進一步滿足糧食需求，化肥的使用已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的手段之一，自20世紀60年代以來，全球化肥用量逐年攀升，預計至2030年全球化肥使用量將達到2.23億t[4]。然而傳統(tǒng)肥料約60%～90%未能被植物利用[5]，隨揮發(fā)、降雨或灌溉流失[1, 6]。進而引起一系列環(huán)境問題，如：土壤肥力的普遍退化[7]，水體富營養(yǎng)化[8]以及溫室氣體的大量排放[9]。因此，開發(fā)一種高效、綠色、可持續(xù)利用的新型肥料已經(jīng)成為當前亟待解決的問題。隨著納米技術的迅速發(fā)展，以納米材料為原料的納米肥料在解決以上問題中展現(xiàn)出巨大應用前景[10]。Kah等[1]利用Meta分析整合了79篇納米農(nóng)用的文章，結果發(fā)現(xiàn)納米肥料相對于傳統(tǒng)肥料增效20%～30%。

鐵是植物生長發(fā)育過程中的必需微量元素[11]，直接或間接參與植物體內(nèi)眾多的生理生化功能[12]。尤其值得注意的是鐵在植物葉綠素合成過程及光合作用的電子傳遞過程中扮演重要角色。植物缺鐵會降低作物光合作用效率，進而導致作物減產(chǎn)[13]。土壤中的鐵含量約為20～40 g/kg[14]，然而土壤溶液中有效鐵的總濃度約為10?10mol/L[15]，比植物最佳生長濃度低104～105倍，尤其在石灰性、pH高和重碳酸鹽含量高的土壤中，植物可利用鐵含量更低[16]，難以滿足作物正常生長的需求[17]。據(jù)統(tǒng)計，全世界約30%的耕地存在缺鐵現(xiàn)象[18]。關于納米鐵肥對種子萌發(fā)及作物生長的影響目前已有研究，Rui等[19]研究發(fā)現(xiàn)，土壤施用 2、10、1000 mg/kg γ-Fe2O3NPs后，花生葉片中葉綠素含量有一定提高；Hu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘幼苗經(jīng) 50 mg/L γ-Fe2O3NPs 處理后，葉綠素含量相較于對照組提升23.2%；Alidoust等[21]研究發(fā)現(xiàn)，葉面施用納米氧化鐵比土壤施用更加有效，對植物光合作用促進效果明顯。然而納米氧化鐵的葉際應用仍存在一定局限性，納米顆粒在葉面通過角質層間隙或氣孔進入植物體內(nèi)[22]，由于納米氧化鐵形成尺寸較大的團聚體，限制了其生物可利用性，因此，減少納米材料的團聚對提高其生物可利用性具有重大意義。當前研究有關葉面施用納米氧化鐵對植物生長促進作用機制較少，因此，氧化鐵納米材料對作物的促生效應與機制仍需進一步研究。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 (Bacillusmethylotrophicus)作為一種性能優(yōu)良的植物促生菌，對植物生長和增產(chǎn)有直接或間接促進作用[23]。Radhakrishnan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，芝麻葉面接種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌后，葉綠素含量提高約60%，籽粒蔗糖含量提高約50%，這可能與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌代謝物中的赤霉素與吲哚乙酸有關。同時，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中含有脂肽[25]。脂肽在納米顆粒的制備過程中作為生物表面活性劑展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和分散性[26]。葉際環(huán)境中水分和養(yǎng)分相對較少，微生物生長受到一定限制，因此制約了植物促生菌在農(nóng)業(yè)上的應用。納米氧化鐵由于自身高比表面積以及磁性能可以通過對微生物的固定作用[27]，提高其在葉面定殖能力。然而，目前關于納米氧化鐵與植物促生菌共同葉面施用，對作物生長的聯(lián)合作用效果研究較少，其影響機制尚不明確。

大豆作為世界性五大主栽作物之一，每年因缺鐵造成大豆減產(chǎn)的直接經(jīng)濟損失巨大[28]。本研究以大豆為受試植物，主要開展以下3方面研究內(nèi)容：1) γ-Fe2O3NMs促進作物生長、提高作物產(chǎn)量的最優(yōu)施用濃度及機制；2) γ-Fe2O3NMs 與植物促生菌 (甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌) 共施用對作物生長及產(chǎn)量的協(xié)同作用效能；3) γ-Fe2O3NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對作物協(xié)同作用機制。該研究旨在揭示納米材料與有益菌對作物的協(xié)同促生機制，為納米材料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用提供新思路及基礎理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氧化鐵納米材料 (γ-Fe2O3NMs)購自 US Research Nanomaterials (Houston，TX，USA)，純度大于99.9%。

供試大豆品種為‘中黃13’。盆栽試驗用土取自江蘇省無錫市江南大學，土壤pH 7.8，土壤懸液電導率為594.67 μS/cm，以二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 作為浸提液，測定土壤中有效鐵含量5.25 mg/kg、土壤全磷含量674.14 mg/kg、全鉀含量13.85 g/kg、土壤最大持水量16%。

供試微生物為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 (Bacillus methylotrophicus)，菌種保藏號為“CCTCCAB2014337”。以LB液體培養(yǎng)基作為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌培養(yǎng)基，將生長2～3天的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌液0.5 mL接種于裝有4.5 mL液體培養(yǎng)基的試管中。在溫度為29℃、轉速為180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，之后采用分光光度計測定菌液的OD值。菌液OD600值在0.82～0.84，菌液濃度約為1×108CFU/mL，納米顆粒在紫外光滅菌后加入無菌培養(yǎng)基用于制作不同濃度γ-Fe2O3NMs培養(yǎng)基。

1.2 盆栽試驗

盆栽用土包含 1.2 kg 河沙、1.2 kg 大顆粒土 (粒徑 2～1 cm) 以及 3.6 kg 小顆粒土 (粒徑小于 2 mm)。河沙和大顆粒土的使用是為避免土壤板結，透氣性不足，從而限制根系生長[29]。種植前，每盆施基肥(尿素 2.0 g、氯化鉀 0.5 g、磷酸二氫銨 1.0 g)。

大豆種子用H2O2浸泡5 min消毒并用去離子水清洗[30]。消毒后的種子在黑暗潮濕條件下25℃培育3天，出芽后移栽至盆中繼續(xù)培育，分別在大豆生長的第三葉期 (V3)、第四葉期 (V4)、第五葉期 (V5)、開花期 (R1)、盛花期 (R2)、結莢期 (R3)，分別用不同濃度納米懸液、菌液以及納米加菌懸液進行6次葉面噴施，于移入土后95天進行采樣。試驗共設10個處理：對照處理 (CK，葉面噴施超純水)；納米材料處理組設置 0、1、10、30和50 mg/L 5 個濃度梯度處理；納米材料與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌復合處理組中包含甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌懸液以及對應每個納米顆粒濃度，其中，不施γ-Fe2O3NMs的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處理以BM表示。每個處理設5次重復。每次每株噴施10 mL懸液，噴施過程中土壤表面覆膜避免污染。葉施在上午8:00—9:00進行，此時植物氣孔處于開放狀態(tài)，噴施后12 h保持葉面濕潤，避免溶液的蒸發(fā)導致納米氧化鐵在葉表面沉積。

1.3 測定方法

1.3.1 材料表征 稱取 0.1 mg γ-Fe2O3NMs 將其分散在10 mL Milli-Q超純水中，保持低溫水浴超聲震蕩30 min，取20 μL懸液滴于潔凈的雙聯(lián)鎳網(wǎng)，待自然風干后，用透射電子顯微鏡 (TEM，JEM-2100，Japan) 于 200 kV 下觀察 γ-Fe2O3NMs 形態(tài)和粒徑。水力學直徑和Zeta電位用納米粒度儀 (Malvern Instrument Inc.，UK) 測定。

1.3.2 γ-Fe2O3NMs 對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌落數(shù)和菌落形態(tài)的影響 γ-Fe2O3NMs經(jīng)紫外滅菌后，制備成 1、10、30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基。將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在不同濃度γ-Fe2O3NMs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，利用紫外分光光度計測定菌液600 nm處的吸光值 (OD600)。同時將未添加γ-Fe2O3NMs的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌液稀釋2×106倍后均勻涂布于含有不同濃度 γ-Fe2O3NMs (0、1、10、30、50 mg/L)的固體培養(yǎng)基上，于29℃微生物培養(yǎng)箱 (Thermo IGS100) 中繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，觀察菌落數(shù)及菌落形態(tài)。

1.3.3 植株生物量與產(chǎn)量 試驗以大豆地上部、地下部以及豆莢干重作為植株生物量。干重采用稱重法，用萬分之一電子天平 (OHAUS，上海) 稱量，干重為鮮樣在115℃殺青15 min，70℃烘干48 h至恒重后稱量。為保證籽粒的完整性，稱量時選擇帶莢稱重的方式。播種95天后，將大豆根部完整取出，利用蒸餾水清洗干凈，根尖數(shù)采用根系掃描儀WinRHIZO Pro 2017 b (Regent Instruments Inc.,Canada)進行分析。

1.3.4 光合作用參數(shù) 葉綠素含量用乙醇浸提法[31]測定，采樣后選擇第6復葉中間葉片，去除主葉脈，組織研磨儀粉碎后稱量 20 mg，加入 5 mL 95 %乙醇溶液后，避光靜置24 h，在紫外分光光度計波長665、649、470 nm下測定，根據(jù)吸光值計算葉綠素含量。凈光合速率、蒸騰速率由便攜式光合測定系統(tǒng) (CIRAS-3，PP-Systems，USA) 于大豆生長第40天，在頂端3個復葉中間葉片上原位測定。

1.3.5 總碳水化合物 采樣后選擇葉片、籽粒、根的干樣，組織研磨儀粉碎后稱量，利用蒽酮比色法[32]測定總碳水化合物含量。

1.3.6 γ-Fe2O3NMs團聚體直徑 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，29℃培養(yǎng)36 h，高速離心后取上清液作為發(fā)酵液。以發(fā)酵液和LB培養(yǎng)基為溶劑制備 3 mg/L γ-Fe2O3NMs 懸液后稀釋 1000 倍，用于單顆粒電感耦合等離子體質譜 (SP-ICP-MS，iCAP-TQ，Thermo Fisher，Germany) 分析。

1.3.7 吲哚乙酸 (IAA) 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中IAA含量用Salkowki比色法[33]測定。LB液體培養(yǎng)基接種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌后29℃培養(yǎng)36 h，離心后取上清液，0.22 μm聚醚砜水相濾膜過濾后與Salkowki溶液按比例1∶1混合，于530 nm波長下比色測定。

1.3.8 養(yǎng)分含量 采樣后選擇葉片、籽粒、根的干樣，組織研磨儀粉碎后稱量25 mg，加入5 mL HNO3后冷卻，待樣品冷卻至室溫后使用微波消解儀(MARS 6，CEM，USA) 115℃ 消解 45 min，消解液稀釋定容后使用電感耦合等離子體質譜 (ICP-MS，iCAP-TQ，Thermo Fisher，Germany) 儀測定各元素含量[34]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用最小顯著差異 (least significant difference，LSD) 檢驗法進行多重比較 (P< 0.05 為差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 γ-Fe2O3 NMs的表征

透射電鏡圖顯示，γ-Fe2O3NMs主要呈橢圓形或圓形，粒徑主要分布在 10～30 nm (圖 1)。10、20、50 mg/L γ-Fe2O3NMs水力學直徑與 Zeta 電位見表 1。水力學直徑隨γ-Fe2O3NMs濃度上升而增加，Zeta電位絕對值隨著γ-Fe2O3NMs濃度增加而降低，這可能是由于γ-Fe2O3NMs自身較高的比表面積或磁性能導致團聚[27]。

圖 1 γ-Fe2O3 NMs的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy (TEM) image of γ-Fe2O3 NMs

表 1 不同濃度γ-Fe2O3 NMs的水力學直徑與Zeta電位Table 1 Hydrodynamic diameter and ζ-potential of γ-Fe2O3 NMs under different concentrations

2.2 γ-Fe2O3 NMs濃度對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生長的影響

如圖2所示，γ-Fe2O3NMs濃度對菌落數(shù)目影響不大，但 γ-Fe2O3NMs濃度在 10～50 mg/L 時，單菌落直徑較空白對照組及 1 mg/L γ-Fe2O3NMs處理組明顯增加。相較于空白對照組和 1 mg/L γ-Fe2O3NMs處理組，10～50 mg/L γ-Fe2O3NMs處理組甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌液OD600吸光值顯著增加 (圖2)，這表明γ-Fe2O3NMs能夠促進甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的生長。

圖 2 γ-Fe2O3 NMs濃度對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌落生長及甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌液OD600吸光值的影響Fig.2 Effect of concentrations of γ-Fe2O3 NMs on the growth of Bacillus methylotrophicus and OD600 values of Bacillus methylotrophicus suspensions

2.3 γ-Fe2O3 NMs濃度對大豆生理特征和碳水化合物的影響

從圖 3 可以看出，30和50 mg/L γ-Fe2O3NMs處理顯著增加了大豆葉中葉綠素含量，γ-Fe2O3NMs顯著提高了大豆葉面的凈光合速率及蒸騰速率。圖4顯示，30 mg/L γ-Fe2O3NMs施用后，大豆葉片中總碳水化合物含量相較于其他處理顯著上升；施用γ-Fe2O3NMs后，籽粒中總碳水化合物含量均有一定程度的增加，其中10、30、50 mg/L濃度下增加顯著。這表明，γ-Fe2O3NMs能夠促進大豆光合作用，提高大豆光合產(chǎn)物的累積，進而促進大豆生長及產(chǎn)量提升。

圖 3 葉面施用γ-Fe2O3 NMs對大豆葉片葉綠素含量、凈光合速率、蒸騰速率的影響Fig.3 Effects of foliar application of γ-Fe2O3NMs on the chlorophyll content, net photosynthetic rate,and transpiration rate of soybean

圖 4 葉面施用γ-Fe2O3 NMs對大豆葉片和籽?？偺妓衔锖康挠绊慒ig.4 Effects of foliar application of γ-Fe2O3 NMs on the carbohydrate content in soybean leaves and seeds

2.4 γ-Fe2O3 NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌配施對大豆生長及產(chǎn)量的影響

如圖5所示，葉面施用γ-Fe2O3NMs增加了作物地上部及地下部干重，并提高了大豆產(chǎn)量。施用10、30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs 處理明顯增加了大豆地下部干重 ； 1、10、30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs 處理顯著提高了大豆地上部干重；30和50 mg/L γ-Fe2O3NMs處理顯著提高了大豆產(chǎn)量。以上結果表明，30 mg/L為 γ-Fe2O3NMs的最優(yōu)施用濃度。

單獨施用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對大豆生物量及產(chǎn)量沒有明顯的影響 (圖 5)，結合 γ-Fe2O3NMs 施用后，明顯增加了大豆的地下部及地上部干重。其中，30和50 mg/L γ-Fe2O3NMs配合甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處理組大豆產(chǎn)量較單施γ-Fe2O3NMs分別增加了 31.5%和13.4%。這表明，30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs既能夠促進大豆生長、增加大豆產(chǎn)量，又可以提高促生菌對大豆生長的調節(jié)作用。

圖 5 葉面噴施不同濃度γ-Fe2O3 NMs對大豆地下部、地上部和豆莢干重的影響Fig.5 Effects of foliar application of different concentrations of γ-Fe2O3 NMs on the dry weight of soybean root, shoot and pod

2.5 γ-Fe2O3 NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌協(xié)同促生效應

為探究γ-Fe2O3NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌協(xié)同促生機制，將γ-Fe2O3NMs加入LB培養(yǎng)基與36 h培養(yǎng)的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液中，稀釋至相同倍數(shù)。SP-ICP-MS結果 (圖6) 顯示，發(fā)酵液中平均團聚體粒徑約為135.52 nm，明顯低于LB培養(yǎng)基中的159.19 nm。這表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液明顯降低了γ-Fe2O3NMs的團聚作用，提高了其生物可利用性。

圖 6 γ-Fe2O3 NMs在LB培養(yǎng)基中與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液中的粒徑分布比較Fig.6 Comparison of the particle size distribution of γ-Fe2O3 NMs in LB medium and Bacillus methylotrophicus broth

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的代謝物中含有IAA，其可被作物利用，進而促進作物生長[35]。不同濃度γ-Fe2O3NMs 處理 36 h 后，10、30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs顯著提高了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液中IAA的濃度，使其濃度從3.8 mg/L增加至7.6～8.8 mg/L(圖 7)。

圖 7 不同濃度γ-Fe2O3 NMs暴露36 h后對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液中IAA濃度的影響Fig.7 IAA concentration produced by Bacillus methylotrophicus after exposure to different concentrations of γ-Fe2O3 NMs for 36 h

如圖8所示，γ-Fe2O3NMs對大豆新根的形成影響較小，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可顯著促進大豆新根的形成，二者配合施用則進一步促進了大豆新根的形成。

圖 8 葉面噴施不同濃度γ-Fe2O3 NMs對大豆單株根尖數(shù)的影響Fig.8 Soybean root tips per plant after foliar application of different concentrations of γ-Fe2O3 NMs

表2顯示，施用30與50 mg/L濃度γ-Fe2O3NMs后，大豆地下部鐵含量顯著高于對照組與低濃度γ-Fe2O3NMs處理組，但鐵在植物體內(nèi)遷移性較差[11]，這可能是由于高濃度γ-Fe2O3NMs處理后顯著促進了大豆根系生長，進而加強了根部對營養(yǎng)元素的吸收。另外，已有研究表明，葉面施用納米顆?？梢酝ㄟ^維管束系統(tǒng)向植物根部運輸，因此地下部鐵元素含量變化也可能是由于γ-Fe2O3NMs在植物體內(nèi)的遷移造成[36]。表2表明，葉面施用γ-Fe2O3NMs對大豆P、Ca含量的影響較小；但使S、Mg和Fe、Mn含量明顯增加。此外，葉面施用γ-Fe2O3NMs在一定程度上提高了地上部營養(yǎng)元素含量。相較于對照處理，10、30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs處理籽粒中鐵含量平均提高約50%。施用30 與 50 mg/L γ-Fe2O3NMs后，大豆籽粒中磷元素與鈣元素含量同樣明顯高于對照組與低濃度處理組。圖8所示，相較于納米處理組，與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌配合施用后，根尖數(shù)均有明顯增加，這將進一步促進大豆根系對營養(yǎng)元素的吸收，表2顯示，相較于同濃度納米處理，大豆各部位各元素含量在加菌處理后均明顯增加。

3 討論

3.1 γ-Fe2O3 NMs對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生長的影響

與對照組及 1 mg/L γ-Fe2O3NMs處理相比，10、30、50 mg/L γ-Fe2O3NMs處理菌液 OD600吸光值與平板單菌落直徑明顯增加 (圖2)。本研究結果表明，γ-Fe2O3NMs能夠促進甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的生長。其主要原因可能為：1) γ-Fe2O3NMs 作為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的支撐與固定材料，可加快其生長速度，提高細胞活性[27]；2) γ-Fe2O3NMs 作為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生長鐵源，為細菌生長、色素合成提供養(yǎng)分，促進細菌代謝生長[37-38]。

3.2 γ-Fe2O3 NMs對大豆生長及產(chǎn)量的影響

在高等植物中，葉綠素是由前體氨基乙酰丙酸(ALA) 形成的，而ALA的合成過程中需要鐵氧還原蛋白參與[39]。鐵氧還原蛋白作為植物光合作用中光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ) 的電子傳遞體，直接影響植物光合作用速率[40]。本次試驗中大豆凈光合速率相較于對照組顯著增加。Alidoust等[21]得到類似研究結果，葉面施用γ-Fe2O3NMs后，凈光合速率提高6%，氣孔導度提高20%。籽粒中碳水化合物含量的增加可能是由于γ-Fe2O3NMs促進了大豆光合作用速率，進而提高了光合產(chǎn)物 (碳水化合物) 在葉面及籽粒中的累積[41-42]。碳水化合物是大豆果實中重要的營養(yǎng)品質指標[43]，γ-Fe2O3NMs不僅提高了大豆的產(chǎn)量，同時也提升了大豆的營養(yǎng)品質。以上結果表明，γ-Fe2O3NMs能夠促進大豆光合作用，提高大豆光合產(chǎn)物的累積，進而促進大豆生長及產(chǎn)量形成。

3.3 γ-Fe2O3 NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌葉面配施對大豆生長及產(chǎn)量的影響

本研究中，50 mg/L γ-Fe2O3NMs對大豆生長及產(chǎn)量的促進及提高效果與 30 mg/L γ-Fe2O3NMs差異不顯著，其可能原因是：1) 過量施用 γ-Fe2O3NMs，導致其不能被大豆葉面完全吸收。Hong等[44]研究發(fā)現(xiàn)，葉面施用CeO2NPs后，葉片中鈰濃度在80、160、320 mg/L CeO2NPs處理后并未有顯著差異。另外，隨著γ-Fe2O3NMs濃度逐漸增大，其懸浮液更易發(fā)生團聚 (表 1)，大的 γ-Fe2O3NMs 團聚體附著于大豆葉表面，難以被吸收進入大豆體內(nèi)。2) 高濃度γ-Fe2O3NMs相較于低濃度可能對植物產(chǎn)生一定負面影響。Hu 等[20]發(fā)現(xiàn)柑橘經(jīng)高濃度 (100 mg/L) γ-Fe2O3NMs處理后，植株鮮重低于低濃度 (20 mg/L) 處理的柑橘幼苗，這可能是由于高濃度γ-Fe2O3NMs對植物造成了一定氧化脅迫。單獨施用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對大豆生物量及產(chǎn)量沒有明顯的影響 (圖5)。這可能是由于葉際環(huán)境缺少水分及養(yǎng)分，不利于促生菌的生長[45]。

3.4 γ-Fe2O3 NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌協(xié)同促生效應

SP-ICP-MS分析結果表明，發(fā)酵液中γ-Fe2O3NMs團聚體直徑小于LB培養(yǎng)基中γ-Fe2O3NMs團聚體直徑。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中含有脂肽[46]，這種生物表面活性劑可能是減少γ-Fe2O3NMs團聚的原因。

Idris等[35]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中含有IAA，其可被作物利用，進而促進作物生長。γ-Fe2O3NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌配合施用進一步提高了其對大豆新根形成的促進作用。其可能原因是，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液中的IAA能夠促進植物根系的生長與新根的形成[47]。

γ-Fe2O3NMs與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌配合施用可提高根部對營養(yǎng)元素的吸收(表2)，這對植物生長發(fā)育具有重要意義。如，硫元素在植物的代謝和發(fā)育過程中同樣起著舉足輕重的作用，不僅是構建蛋白質的必要元素，而且還可作為前體合成谷胱甘肽、輔助因子、基本的維生素等[48]。鐵元素參與植物光合作用與呼吸作用中的電子傳遞過程，與植物體內(nèi)眾多酶的合成相關[49]。錳元素作為植物體內(nèi)眾多酶的催化因子，對植物體內(nèi)的氧化過程催化至關重要[50]。

表 2 不同處理大豆各器官營養(yǎng)元素含量 (mg/g)Table 2 Contents of nutrient elements in soybean organs under different treatments

籽粒中營養(yǎng)元素的提升對提高大豆營養(yǎng)品質同樣具有積極作用，由于人體對大豆中鐵蛋白吸收機制與非血紅素鐵不同，大豆中的鐵更易被人體吸收[51]；磷元素參與大豆油脂和蛋白質等物質的合成[52]；同時已有研究表明，大豆蛋白的攝入可以有效緩解骨質流失，這與大豆蛋白中鈣元素含量有關[53]。

4 結論

葉面施用γ-Fe2O3NMs能夠提高大豆葉片總葉綠素含量，促進大豆光合作用，提高大豆葉片與籽粒中總碳水化合物含量，進而促進大豆生長，其中γ-Fe2O3NMs濃度為 30 mg/L 處理對于大豆生長促進效果最顯著。相較于納米材料單獨施用的對照組，濃度為 30、50 mg/L 的 γ-Fe2O3NMs和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌聯(lián)合施用增加大豆干重的效果更明顯。γ-Fe2O3NMs和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可作為一種新型環(huán)境友好的葉面肥應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。另外，γ-Fe2O3NMs對大豆根系根瘤固氮、大豆體內(nèi)氮素循環(huán)及籽粒中蛋白質積累等的影響機制還需進一步研究。