雙酶法制備條滸苔鮮味肽工藝研究

劉冰，周振，李若敏，趙行，盤賽昆，2，3，王文彬,2,3*

(1.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

鮮味肽作為一種可增強(qiáng)食物鮮味和醇厚味的呈味肽，具有易于加工、鮮味明顯以及營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1]，主要由蛋白酶水解或氨基酸合成獲得[2]。而滸苔作為制作鮮味劑的原料，必需氨基酸含量豐富，是一種高蛋白、低脂肪、礦物質(zhì)含量豐富的海藻[3]。以滸苔鮮味肽為基料制成的復(fù)合調(diào)味劑是滿足當(dāng)下調(diào)味品對(duì)兼具調(diào)味與營養(yǎng)雙重功效的需求[4]。

本試驗(yàn)以寧波的條滸苔為原料，以鮮味的感官評(píng)價(jià)及水解度為考察指標(biāo)，篩選出胰酶與風(fēng)味酶進(jìn)行復(fù)配，在各自單因素的基礎(chǔ)上采用均勻試驗(yàn)確定雙酶添加順序、酶解溫度及復(fù)配比例，并通過響應(yīng)面進(jìn)一步優(yōu)化雙酶酶解滸苔提取鮮味肽的工藝，得到最優(yōu)工藝條件。采用超濾膜分離技術(shù)得到分子量不同的3個(gè)組分，對(duì)各自組分進(jìn)行鮮味評(píng)價(jià)以及肽含量測定，為后期滸苔鮮味肽深加工提供了理論基礎(chǔ)，從而開辟出新的鮮味調(diào)味劑原料來源[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

條滸苔產(chǎn)于寧波，洗凈烘干備用。

纖維素酶(5.0×104U/g)、中性蛋白酶(2.2×104U/g)、胰蛋白酶(3.4×104U/g)、風(fēng)味蛋白酶(2.1×104U/g)、木瓜蛋白酶(2.2×104U/g)、復(fù)合蛋白酶(4.1×104U/g)：河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司；聚乙二醇(6000)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，福州飛凈生物科技有限公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純試劑。

ZNC-701超微粉碎機(jī) 北京華儀高科電氣有限公司；CMD2000/4濕法超微粉碎機(jī) 切可(上海)機(jī)械設(shè)備有限公司；Seven Easy S20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHA-2數(shù)顯冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市億通電子有限公司；SP-754紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；DMJ60-3三級(jí)膜分離過濾系統(tǒng) 山東博納生物科技集團(tuán)有限公司；Ultra-15超濾離心管Amicon (MWCO 10000) Millipore公司；MD34-100透析袋 Yi Bo Biological公司；AS-LGJ-10FG真空冷凍干燥機(jī) 鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；電腦恒溫層析柜 上海金達(dá)生化儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

干滸苔條→粗粉碎→濕法超微粉碎→纖維素酶酶解→滅酶(95 ℃，10 min)→調(diào)pH→加蛋白酶酶解→滅酶(95 ℃，10 min)→離心→取上清液。

操作要點(diǎn)：干滸苔用超微粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，按料液比1∶20 (g/mL)加蒸餾水，于濕法超細(xì)粉碎機(jī)中回流粉碎40 min，頻率40 Hz，制得滸苔勻漿保存于4 ℃冰箱備用。纖維素酶pH 3.0，加酶量5%(W/V)，溫度25 ℃，振蕩酶解6.5 h，98 ℃水浴滅酶10 min。

1.2.2 蛋白酶的篩選

選用中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶5種蛋白酶在各自適宜條件下酶解經(jīng)纖維素酶破壁后的滸苔液，時(shí)間為1，2，3，4，5，6 h。以鮮味感官評(píng)價(jià)和水解度為指標(biāo)，初步篩選出適宜酶解滸苔蛋白的雙酶組合。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以鮮味感官評(píng)價(jià)和水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察加酶量、酶解時(shí)間、溫度、pH及固液比這5個(gè)因素的酶解成效。

1.2.3.1 酶添加量對(duì)酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃，胰酶pH 7.5、風(fēng)味酶pH 7.0，酶解時(shí)間3.0 h，固液比1∶20 (g/mL)條件下，設(shè)定酶添加量的6個(gè)水平為500，1000，1500，2000，2500，3000 U/g·pro，分別取胰酶和風(fēng)味酶酶解后的上清液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和水解度測定。

1.2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃，胰酶pH 7.5，風(fēng)味酶pH 7.0，酶添加量2000 U/g·pro，固液比1∶20 (g/mL)條件下，設(shè)定酶解時(shí)間的6個(gè)水平為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h，分別取胰酶和風(fēng)味酶酶解后的上清液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和水解度測定。

1.2.3.3 酶解pH對(duì)酶解效果的影響

在酶添加量2000 U/g·pro，酶解溫度50 ℃，固液比1∶20 (g/mL)，酶解時(shí)間3.0 h條件下，分別設(shè)定胰酶和風(fēng)味酶酶解pH 的6個(gè)水平為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，分別取這兩種酶酶解后的上清液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和水解度測定。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

在酶添加量2000 U/g·pro，pH 7.5，固液比1∶20 (g/mL)，酶解時(shí)間3.0 h條件下，設(shè)定酶解溫度的6個(gè)水平為35，40，45，50，55，60 ℃，酶解后取上清液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和水解度測定。

1.2.3.5 固液比對(duì)酶解效果的影響

在酶添加量2000 U/g·pro，胰酶pH 7.5，風(fēng)味酶pH 7.0，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度45 ℃ 條件下，設(shè)定固液比的5個(gè)水平為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)，酶解后分別將胰酶和風(fēng)味酶酶解液調(diào)至同一濃度后離心取上清液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和水解度測定。

1.2.4 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以鮮味評(píng)價(jià)和水解度為檢驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，考察雙酶添加順序、雙酶酶解溫度和雙酶復(fù)配比例這3個(gè)因素對(duì)雙酶酶解效果的影響，從而確定其適宜作用條件[6]。由于雙酶添加順序有3個(gè)水平，雙酶酶解溫度和復(fù)配比例各有6個(gè)水平，因此考慮采用擬水平法由U6(66)構(gòu)造[7]，酶解pH為7.5，酶添加總量為2000 U/g·pro，同步酶解時(shí)間為3.0 h，分步酶解時(shí)間各為1.5 h，具體因素水平見表1。

表1 均勻試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of uniform experiment

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于響應(yīng)面法可以通過建立曲面模型對(duì)影響雙酶酶解效果的因素水平及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)與分析[8]?？紤]采用Design-Expert的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法根據(jù)單因素和均勻設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果[9]，從酶解時(shí)間、pH、固液比和酶添加總量4個(gè)因素中選擇對(duì)酶解成效影響顯著的因素設(shè)計(jì)成三因素三水平的試驗(yàn)方案，具體因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of response surface experiment

1.2.6 指標(biāo)的測定

1.2.6.1 鮮味感官評(píng)價(jià)

a.評(píng)定方法

采用定量描述分析法對(duì)滸苔酶解液進(jìn)行感官品評(píng)。感官品評(píng)在溫度為(25±2) ℃的感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行，10位感官評(píng)定員在感官評(píng)定之前均經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，熟悉滸苔酶解產(chǎn)物的風(fēng)味特征和感官強(qiáng)度，進(jìn)行培訓(xùn)的參比溶液為谷氨酸鈉(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L)。評(píng)定成員用蒸餾水漱口之后，取待評(píng)樣品 5 mL 置于口中，10 s 后吐出，漱口后取參比液品嘗，根據(jù)感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(見表3)對(duì)此次感官結(jié)果給予記錄，結(jié)果取10人評(píng)定值的平均值[10]。

表3 感官評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) Table 3 The sensory evaluation standard

b.待評(píng)定樣品處理

取滸苔酶解液經(jīng)10000 Da超濾離心管離心后，裝入100 Da透析袋中，在盛有一定量聚乙二醇的培養(yǎng)皿中濃縮2 h至聚乙二醇完全溶解，將濃縮后的酶解液置于層析柜中，4 ℃透析脫鹽1 h，用鹽度計(jì)測量其鹽度，并調(diào)整至同一鹽度水平。

1.2.6.2 水解度測定

參考張麗華的方法，酶解液中氨基態(tài)氮含量計(jì)算公式見式(1)：

式(1)

式中：X為樣品中氨基態(tài)氮濃度(mg/mL)；V1為樣品滴至pH 9.2所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH體積(mL)；V2為空白滴至pH 9.2所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH體積(mL)；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度(mol/L)；14.008為消耗堿量換算為氮的系數(shù)；V為測定用樣品溶液體積(mL)。

水解度計(jì)算公式見式(2)：

式(2)

式中：X為水解后生成的氨基態(tài)氮含量；N為樣品總氮含量。

1.2.6.3 不同分子量肽段初步分離與鮮味評(píng)價(jià)

通過超濾膜分離系統(tǒng)的陶瓷膜將酶解上清液中的滸苔多糖去除后，依次經(jīng)過有機(jī)膜MWCO 10000和MWCO 3000，分離得到3個(gè)不同的組分，分別命名為：組分Ⅰ(Mw>10 kD)、組分Ⅱ(3 kD

1.2.7 肽含量的測定

采用雙縮脲法檢測溶液中的多肽含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0373X+0.032，R2=0.9989。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 篩酶試驗(yàn)

在固液比為1∶20、加酶量為1500 U/g ·pro時(shí)，分別在5種蛋白酶的最適條件下酶解6 h，每1 h取樣測一次，條滸苔蛋白的水解進(jìn)程曲線見圖1。

圖1 不同蛋白酶對(duì)條滸苔蛋白水解度的影響Fig.1 The effects of different proteases on the hydrolysis degree of Enteromorpha clathrata protein

由圖1可知，選取的5種蛋白酶對(duì)滸苔蛋白酶解均表現(xiàn)出一定的酶解效果，對(duì)比各種蛋白酶的酶解效果，結(jié)果表明胰蛋白酶的水解度最高，中性蛋白酶次之，復(fù)合蛋白酶最低。條滸苔蛋白水解的速率不一致，可能是由于蛋白酶的水解催化點(diǎn)不同。

圖2 不同蛋白酶的水解物感官評(píng)價(jià)分值Fig.2 The sensory evaluation scores of hydrolysates of different proteases

由于不同的酶具有不同的生物活性成分，作用的肽鍵也不相同，酶解條滸苔蛋白得到的肽鏈結(jié)構(gòu)和長度是不同的，其滋味也可能不同，若單純地追求高水解度指標(biāo)，可能會(huì)導(dǎo)致酶解液的感官品質(zhì)不高，所以在篩選制備滸苔鮮味肽的適宜酶種類時(shí)，還應(yīng)該考察酶解物的鮮味評(píng)價(jià)。在固液比為1∶20、加酶量為1500 U/g·pro時(shí)，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶5種蛋白酶在各自適宜條件下水解6 h，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)其進(jìn)行感官鑒定。由圖2可知，5種酶解液在1～3 h鮮味是隨時(shí)間的延長有所增加，酶解超過3 h后，鮮味逐漸下降。

由于胰蛋白酶水解度較高，水解液感官評(píng)價(jià)分值較低；風(fēng)味蛋白酶水解度較低而感官評(píng)價(jià)分值較高，其中胰蛋白酶為肽鏈內(nèi)切酶，風(fēng)味蛋白酶既是內(nèi)切酶同時(shí)也是外切酶，因而考慮將這兩種酶進(jìn)行復(fù)配，從而在不降低水解度的條件下得到具有較高鮮味品質(zhì)的水解液。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶添加量的影響

圖3 加酶量對(duì)水解度和鮮味感官評(píng)價(jià)的影響Fig.3 The effects of enzyme additive amount on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由圖3可知，當(dāng)加酶量小于2000 U/g·pro時(shí)，條滸苔胰酶酶解液和風(fēng)味酶酶解液的水解度都隨著酶添加量的增大而升高，當(dāng)酶添加量達(dá)到2000 U/g·pro時(shí)，水解度都達(dá)到最大值，其中，胰酶達(dá)到15.12%±0.6%，風(fēng)味酶達(dá)到10.25%±0.4%。兩種酶解液的鮮味也是先升后降，在2000 U/g·pro時(shí)最鮮。之后，隨著加酶量的增加，底物濃度小于所加酶的濃度，溶液中的蛋白酶因此產(chǎn)生競爭，發(fā)生自溶從而使蛋白酶活力下降，水解度和鮮味也隨之降低。綜上所述，胰酶和風(fēng)味酶酶解條滸苔的添加量都以2000 U/g·pro較為適宜。

2.2.2 時(shí)間的影響

圖4 時(shí)間對(duì)水解度和鮮味感官評(píng)價(jià)的影響Fig.4 The effects of time on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由圖4可知，兩種蛋白酶酶解條滸苔時(shí)，隨著時(shí)間的延長，水解度都呈先上升后下降的趨勢。這是由于反應(yīng)初期底物都被兩種蛋白酶充分酶解，水解度顯著上升，達(dá)到3 h后，底物減少且兩種酶的活性逐漸喪失，反應(yīng)速率下降，水解度增加放緩并趨于平衡。而兩種酶的水解液的鮮味則呈先升后降的趨勢，在3 h達(dá)到最鮮，感官評(píng)分為3.75±0.49和6.75±0.5。鮮味下降是由于隨著時(shí)間的延長，酶解液的酸味逐漸加重，影響甚至掩蓋了其中的鮮味，因而感官評(píng)分逐漸下降。綜上所述，胰酶和風(fēng)味酶酶解條滸苔的時(shí)間都以3 h較為適宜。

12月1日，全國第六屆“書香三八”讀書活動(dòng)頒獎(jiǎng)典禮暨第七屆“書香三八”讀書活動(dòng)啟動(dòng)儀式在北京舉辦。全國總工會(huì)女職工部領(lǐng)導(dǎo)參加頒獎(jiǎng)典禮并致辭。兵團(tuán)工會(huì)在第六屆“書香三八”讀書活動(dòng)中，榮獲優(yōu)秀組織獎(jiǎng)。

2.2.3 pH的影響

圖5 pH對(duì)水解度和鮮味感官評(píng)價(jià)的影響Fig.5 The effects of pH values on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

pH的變化會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對(duì)酶解反應(yīng)效果影響較為顯著。由圖5可知，胰酶pH在達(dá)到7.5之前，水解度和鮮味隨著pH增加而上升，而pH超過7.5之后，水解度和鮮味都有十分明顯的下降。這說明胰蛋白酶在pH超過7.5的環(huán)境下容易失活使底物不能得到充分酶解。鮮味的下降可能是因?yàn)閜H對(duì)胰蛋白酶催化條滸苔蛋白基團(tuán)的解離狀態(tài)產(chǎn)生影響，使水解液中的正負(fù)基團(tuán)以及疏水基團(tuán)不能滿足產(chǎn)生鮮味的要求，從而使評(píng)分明顯下降。風(fēng)味酶在pH達(dá)到7.0之前，水解度和鮮味呈上升趨勢，pH超過7.0后，水解效果以及酶解液的鮮味都降低。綜上所述，胰酶酶解條滸苔的pH以7.5較為適宜，而風(fēng)味酶酶解條滸苔的pH以7.0較為適宜。

2.2.4 溫度的影響

圖6 溫度對(duì)水解度和鮮味感官評(píng)價(jià)的影響 Fig.6 The effects of temperatures on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由圖6可知，隨著溫度的上升，兩種酶酶解液的水解度和鮮味都呈先升后降的趨勢，在溫度為45 ℃時(shí)兩種酶解液的水解度和鮮味都達(dá)到最大值。這是因?yàn)榈鞍酌赣衅溥m宜的溫度，在未達(dá)到該溫度時(shí)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的活性都不高，與底物接觸較少；而超過該溫度時(shí)，蛋白酶結(jié)構(gòu)都遭到破壞，活力下降，水解度與鮮味都下降。綜上所述，胰酶和風(fēng)味酶酶解條滸苔的溫度都以45 ℃較為適宜。

2.2.5 固液比的影響

圖7 固液比對(duì)水解度和鮮味感官評(píng)價(jià)的影響Fig.7 The effects of solid-liquid ratios on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由圖7結(jié)合預(yù)試驗(yàn)可知，當(dāng)?shù)孜镙^濃時(shí)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的活性受到抑制且多糖析出較多，使得酶解液在離心后都呈凝膠狀，鮮味較弱。當(dāng)固液比達(dá)到1∶20時(shí)兩種水解液的水解度和鮮味都達(dá)到最大值。當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?∶20時(shí)，水解度和鮮味都呈下降趨勢，但差異不顯著。綜上所述，胰酶和風(fēng)味酶酶解條滸苔的固液比都以1∶20較為適宜。

2.3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析

依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知雙酶的添加順序和復(fù)配比例對(duì)雙酶酶解效果的影響較大，且單因素試驗(yàn)結(jié)果表明溫度對(duì)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解效果影響都較為顯著，因此需選擇合適的試驗(yàn)設(shè)計(jì)來確定雙酶添加順序、復(fù)配比例以及溫度這3個(gè)因素的適宜作用條件。若采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為保證試驗(yàn)點(diǎn)的整齊可比，需進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)量較大，而均勻試驗(yàn)可以較少的試驗(yàn)次數(shù)較準(zhǔn)確地反映各因素的試驗(yàn)條件，且與正交試驗(yàn)相比若初步確定的各因素作用范圍不夠準(zhǔn)確，均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以求得現(xiàn)有范圍之外的最佳水平組合[11]。本試驗(yàn)選擇U6(66)表，共進(jìn)行6組試驗(yàn)，以鮮味評(píng)價(jià)和水解度為指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.6和0.4，采用綜合評(píng)分法對(duì)酶解效果進(jìn)行綜合評(píng)分[12],試驗(yàn)結(jié)果及方案見表4。

表4 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 The uniform experiment design and results

考慮到因素間的交互作用，對(duì)表4進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得回歸方程：Y=-4.9945+0.3591X2+0.2092X3+0.0780X12-0.0039X22，其相關(guān)系數(shù)R=1.0000，F(xiàn)=24999.8125>F0.01(4,1)=563 ，顯著水平P=0.0021，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.0003，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=1.0000，決定系數(shù)R2=1.0000，方程通過檢驗(yàn)，對(duì)該模型各項(xiàng)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 二次多項(xiàng)式逐步回歸模型各項(xiàng)顯著性分析Table 5 The significance analysis of quadratic polynomial stepwise regression model

由表5可知，模型中的各項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響都是極顯著的。其中主效應(yīng)只有X1對(duì)響應(yīng)值沒有顯著性影響，但X1的平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值是有顯著影響的，這說明對(duì)雙酶酶解效果的影響主要是因素的主效應(yīng)，而不是各因素間的交互作用。

經(jīng)DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)優(yōu)化后，結(jié)合實(shí)際和生產(chǎn)操作的可行性得到3個(gè)因素各自最適宜條件為：雙酶同時(shí)添加、溫度46.5 ℃、胰酶∶風(fēng)味酶2∶1，在此條件下模型的預(yù)測值為4.48，實(shí)際綜合評(píng)分為4.44，用SPSS進(jìn)行T檢驗(yàn)，P=0.762>0.05，與預(yù)測值無顯著性差異，模型可靠。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

條滸苔酶解工藝各因素間存在交互作用，依據(jù)單因素方差分析和均勻試驗(yàn)分析的結(jié)果，為確定最佳工藝，選擇酶解時(shí)間、pH和總酶添加量3個(gè)因素，采用Design-Expert 8.0的Box-Behnken中心組合來設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 6 The response surface experiment design and results

2.4.2 回歸方程擬合和方差分析

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到鮮味感官評(píng)價(jià)與各因素二次回歸方程模型為：Y1=7.31-0.35A-0.33B-0.33C-0.33AC-0.29BC-0.67A2-0.75B2-0.27C2。

表7 鮮味感官評(píng)價(jià)方差分析表Table 7 The variance analysis of umami sensory evaluation

回歸模型系數(shù)R2=0.9620，P<0.0001，模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.3298,不顯著，說明方程擬合較好，試驗(yàn)誤差較小。校正系數(shù)RAdj2=0.9241，表明該模型可以解釋92.41%響應(yīng)值的變化，可用該方程來描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表7可知，一次項(xiàng)對(duì)鮮味的感官評(píng)價(jià)影響都極顯著；二次項(xiàng)除了加酶量C2影響顯著，其余都具有極顯著性影響；交互項(xiàng)只有AC、BC影響顯著。參照F值可知，時(shí)間(A)>加酶量(C)>pH(B)。

水解度對(duì)時(shí)間(A)、pH(B)、加酶量(C)的回歸模型方程為：Y2=22.43+0.062A+0.30B+0.22C-0.38AB+0.87BC-0.29A2-1.26B2-0.69C2。

表8 水解度方差分析表Table 8 The variance analysis of hydrolysis degree

回歸模型系數(shù)R2=0.9668，P<0.0001，模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.1469，不顯著，說明方程擬合較好，試驗(yàn)誤差較小。校正系數(shù)RAdj2=0.9337，表明該模型可以解釋93.37%響應(yīng)值的變化，可用該方程來描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表8可知，一次項(xiàng)中pH(B)對(duì)水解度有極顯著影響，加酶量(C)有顯著影響，而時(shí)間(A)影響不顯著；二次項(xiàng)除了時(shí)間A2是影響顯著，以其余都具有極顯著性影響；交互項(xiàng)中BC對(duì)水解度影響極顯著，AB影響顯著。參照F值可知，pH(B)>加酶量(C)>時(shí)間(A)。

2.4.3 響應(yīng)面分析

固定3個(gè)因素其中之一，考察其他2個(gè)因素的交互作用對(duì)滸苔雙酶酶解效果的影響。根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)面及等高線圖(見圖8～圖11)，可直觀反映各參數(shù)對(duì)響應(yīng)值的影響。

圖8 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)鮮味感官評(píng)價(jià)的交互作用及等高線Fig.8 Interaction effect and contour between enzyme additive amount and reaction time on umami sensory evaluation

圖9 加酶量和反應(yīng)pH對(duì)鮮味感官評(píng)價(jià)的交互作用及等高線Fig.9 Interaction effect and contour between enzyme additive amount and pH value on umami sensory evaluation

圖10 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH對(duì)水解度的交互作用及等高線Fig.10 Interaction effect and contour between reaction time and pH value on hydrolysis degree

圖11 加酶量和反應(yīng)pH對(duì)水解度的交互作用及等高線Fig.11 Interaction effect and contour between enzyme additive amount and pH value on hydrolysis degree

由圖8可知，在pH不變的情況下，感官評(píng)價(jià)隨著時(shí)間和加酶量的上升都呈先增后降的趨勢，且曲面都較陡，影響較顯著。由等高線圖呈橢圓形且在數(shù)值較大時(shí)較密可得加酶量和時(shí)間的變化對(duì)酶解液鮮味影響較大，交互作用顯著。

由圖9可知，pH和加酶量曲面都較陡，對(duì)鮮味感官評(píng)價(jià)的影響都顯著。由等高線圖可知，pH和加酶量較小時(shí)，等高線較平緩，其數(shù)值變化對(duì)鮮味影響較??；而在較高范圍內(nèi)，等高線比較陡峭，說明因素?cái)?shù)值變化對(duì)鮮味影響較大，由此可知加酶量和酶解pH之間交互作用顯著。

由圖10可知，pH曲面較陡，時(shí)間曲面較平緩，說明pH較時(shí)間對(duì)水解度的影響更顯著。等高線圖呈橢圓形且在pH軸處更密表明pH值的變化對(duì)水解度影響更大，酶解pH與時(shí)間的交互作用較強(qiáng)。

由圖11可知，固定時(shí)間不變時(shí)，水解度隨著加酶量和pH的增加先升后降，且曲面都較陡，有較顯著影響。等高線圖呈橢圓形，在pH和加酶量值較小時(shí)，等高線較稀疏，對(duì)水解度影響較小；而在較高范圍內(nèi)等高線較密集，表明加酶量和pH對(duì)水解度影響較大，兩者交互作用顯著。

2.4.4 工藝條件的優(yōu)化與驗(yàn)證

利用Design Expert 8.0.6.1軟件獲得了最佳雙酶酶解條件的因素組合：酶添加總量1965.26 U/g·pro、pH 7.49、酶解時(shí)間2.91 h，此時(shí)模型預(yù)測的鮮味感官評(píng)價(jià)和水解度分別為7.37和22.39%。為驗(yàn)證響應(yīng)面模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，以此條件做3組平行試驗(yàn)，測得鮮味評(píng)分和水解度分別為7.34±0.24、22.34%±0.38%，用SPSS對(duì)其進(jìn)行T檢驗(yàn)，得P1=0.846、P2=0.839，均大于0.05，無顯著性差異，模型可靠。

2.5 超濾膜分離

經(jīng)蛋白酶水解后的上清液中，肽分子量一般集中在100～100000 Da之間，且以親水性肽為主，這與蛋白酶專一水解含疏水性氨基酸和堿性氨基酸殘基的肽鍵有關(guān)[13]。采用超濾膜分離將酶解液分成3個(gè)組分，對(duì)其進(jìn)行鮮味感官評(píng)價(jià)可初步估計(jì)呈鮮明顯組分的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果見表9。

表9 酶解液超濾前后鮮味感官評(píng)分 Table 9 The umami sensory evaluation scores of hydrolysate before and after ultrafiltration

由表9可知，超濾后各組分的鮮味存在一定差異。組分Ⅰ和組分Ⅱ鮮味評(píng)分較原酶解液顯著降低，截留的鮮味較弱；而組分Ⅲ截留液鮮味的感官指標(biāo)較原酶解液有所提高，這表明經(jīng)過超濾膜的處理可有效提高酶解液的鮮味，這與穆利霞等[14]的研究結(jié)果一致。

2.6 肽含量測定

用分光光度計(jì)采用雙縮脲法檢測溶液在540 nm波長下的吸光值(OD)，代入標(biāo)曲Y=0.0373X+0.032，得出各組分的肽含量，結(jié)果見表10。

表10 不同分子量酶解液肽含量測定結(jié)果 Table 10 The determination results of peptides＇ content in hydrolysate with different molecular weight

由表9和表10可知，組分Ⅲ肽含量最低,而鮮味最高，可能是由于呈鮮味的肽段大多集中于3 kD以下，而大于3 kD的組分雖然肽含量較高但可能具有其他功能的蛋白肽，并不具有鮮味，這與王莉等[15]關(guān)于具有鮮味的肽分子量在1 kD以下是一致的。

3 結(jié)論

通過對(duì)單酶水解與雙酶水解工藝的研究優(yōu)化出條滸苔蛋白酶最佳水解工藝為：胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶同步水解，溫度 46.5 ℃，胰酶和風(fēng)味酶比例為2∶1(酶活比)，酶添加總量1965.26 U/g·pro，pH 7.49，酶解時(shí)間 2.91 h，固液比1∶20 (g/mL)。經(jīng)驗(yàn)證，鮮味評(píng)分達(dá)到7.34±0.24、水解度為22.34%±0.38%。與單酶水解相比，鮮味與水解度均有顯著提高，也是本文的創(chuàng)新之處。

采用超濾膜分離技術(shù)初步分離出鮮味較強(qiáng)的組分，并對(duì)其進(jìn)行肽含量檢測，從而為鮮味調(diào)味品原料開發(fā)提供了新思路，轉(zhuǎn)變了市場觀念，生產(chǎn)出更符合當(dāng)下食品發(fā)展需求的天然調(diào)味料。