重癥中暑早期大鼠認(rèn)知功能及腦能量代謝核磁共振氫譜研究

何國鑫，馬志全，潘升華，徐安聰，陳爾，徐嘯天，虞希沖

1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州 325200；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，浙江溫州 325200；3溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325200

重癥中暑(heat stroke，HS)是指暴露于高熱環(huán)境或強(qiáng)體力勞動條件下，機(jī)體中心體溫升高超過40 ℃，并出現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的一系列臨床表現(xiàn)，如譫妄、驚厥甚至昏迷等癥狀的一種重癥疾病。未能早期干預(yù)及治療的HS可快速進(jìn)展為多器官衰竭，病死率高達(dá)30%～50%[1]，在救治成功的患者中，仍有20%～30%的幸存者遺留永久性的中樞神經(jīng)功能障礙[2-3]。遭遇嚴(yán)重?zé)岽驌魰r，機(jī)體體溫會急劇升高，可在短時間內(nèi)提高細(xì)胞的化學(xué)反應(yīng)速率，導(dǎo)致顱腦缺血缺氧及中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝紊亂，代謝產(chǎn)物的積聚也會進(jìn)一步加重細(xì)胞的損 傷[4-5]。盡早防止熱打擊對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害對于HS的急救及預(yù)后有重要的意義。

核磁共振技術(shù)是最早應(yīng)用于代謝組學(xué)的分析方法之一，在生命科學(xué)領(lǐng)域擁有重要地位及明顯的優(yōu)勢，目前仍然是代謝組學(xué)研究的有力工具[6-7]。有學(xué)者應(yīng)用核磁共振波譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HS患者的小腦存在明顯代謝異常，并可通過小腦的代謝物N-乙酰天門冬氨酸/肌酸(NAA/Cr)比值判斷病情的輕重[8]，但熱打擊后腦代謝模式的變化及其與腦損傷的關(guān)系目前尚不清楚。本研究利用基于核磁共振氫譜(1H-NMR-based metabonomics，1H NMR)的代謝組學(xué)方法觀察HS早期大鼠腦代謝模式的變化，并結(jié)合行為學(xué)實驗，初步探討HS腦損傷后行為異常的代謝組學(xué)相關(guān)機(jī)制，以期進(jìn)一步了解熱打擊腦損傷的病理機(jī)制，為HS腦損傷的早期診斷及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及實驗動物 Agilent DD2 600 MHz核磁共振譜儀(美國Agilent公司)。重水(D2O，99.9%)及氘代氯仿(CDCl3，99.8%)購于英國劍橋同位素實驗室。磷酸鹽(K2HPO4/NaH2PO4)、甲醇、氯仿購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。核磁共振管(直徑5 mm)購于美國Wilmad-LabGlass公司。健康成年雄性清潔級SD大鼠25只，體重(254±18) g，購于溫州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證編號：X1104549。分籠飼養(yǎng)，室溫(22±1) ℃，12 h/12 h晝夜周期，自由進(jìn)食及飲水。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗，所有操作程序嚴(yán)格遵守美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)關(guān)于小鼠的實驗動物飼養(yǎng)及使用手冊。QHX-150型智能人工氣候箱(上海比朗儀器有限公司)由溫州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 HS模型的建立 將25只SD大鼠隨機(jī)分為對照組(11只)及HS組(14只)，實驗前4 h停止飲水進(jìn)食。將HS組大鼠置于智能人工氣候箱，設(shè)定溫度(40.5±0.5) ℃，相對濕度60%±3%，每隔30 min測其直腸溫度(Tc)。當(dāng)Tc達(dá)41 ℃時，每隔10 min測其Tc；參照本課題組前期HS動物造模方案，以大鼠Tc達(dá)42 ℃作為造模成功的標(biāo)志[9]，造模成功后立即將大鼠移至溫度(25.0±0.5) ℃、相對濕度35%±5%的環(huán)境下復(fù)溫3 h。對照組置于溫度(25.0±0.5) ℃、相對濕度35%±5%的環(huán)境中，禁水禁食。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評定 分別于造模前、造模后復(fù)溫0 h、造模后復(fù)溫3 h采用改良神經(jīng)功能評分(modified neurological severity scores，mNSS)對HS組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評定[9]。

1.2.3 Morris水迷宮檢測 實驗分為定位航行實驗與空間探索實驗。水迷宮裝置由一圓柱形水池及一個可移動位置的站臺組成(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供)。對照組大鼠訓(xùn)練期結(jié)果為基線數(shù)據(jù)，實驗當(dāng)天不予熱打擊處理，直接行Morris水迷宮實驗，實驗當(dāng)天結(jié)果為處理后數(shù)據(jù)。HS組實驗當(dāng)天于造模成功并復(fù)溫3 h后行Morris水迷宮測試，所得結(jié)果為處理后數(shù)據(jù)。(1)定位航行實驗：在建立HS模型前訓(xùn)練4 d，4次/d，每次訓(xùn)練間隔2 h。每次分別隨機(jī)從東、西、南、北4個入水點將大鼠頭朝池壁放入水池中。設(shè)定潛伏期時間為120 s，若大鼠在120 s內(nèi)找到站臺，讓其在站臺上停留30 s，若大鼠未找到站臺，將其引導(dǎo)至站臺上，使其停留30 s，攝像頭追蹤大鼠至其到達(dá)站臺或耗時120 s終止記錄。HS模型建立且復(fù)溫后再進(jìn)行定位航行實驗，記錄大鼠尋找平臺的潛伏期及航行距離。(2)空間探索實驗：在最后一次定位航行實驗結(jié)束24 h后，撤去平臺，任選1個入水點將大鼠放入水中，所有大鼠為同一入水點，自由游泳120 s，每只大鼠進(jìn)行1次，記錄大鼠120 s內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)及在目標(biāo)象限停留所占時間比例。

1.2.4 大鼠腦組織樣本的收集與處理 復(fù)溫3 h后，將兩組大鼠處死后快速分離出腦組織，迅速放入液氮中急凍，置于-80 ℃保存。取對照組8只、HS組11只大鼠腦組織冷凍樣本，按常規(guī)方法制備腦組織提取液，供1H NMR檢測用。取對照組及HS組剩余各3只大鼠的腦組織，按常規(guī)方法制備冷凍切片，供HE染色用。

1.2.5 HE染色觀察大鼠腦組織病理變化 按常規(guī)方法制備大鼠腦組織冷凍切片，進(jìn)行HE染色，將所有切片進(jìn)行隨機(jī)編碼后由病理醫(yī)師在光鏡下觀察并比較兩組大鼠的腦組織病理學(xué)改變。

1.2.6 腦組織提取物的1H NMR檢測及數(shù)據(jù)處理 按常規(guī)方法制備大鼠腦組織提取液，于600 MHz核磁共振(NMR)波譜儀上進(jìn)行NMR采集實驗，1H共振頻率是599.83 MHz，采用水峰抑制的Noesygppr1d序列，弛豫延遲2.0 s，采集時間1.3 6 s，譜寬12 000 Hz，溫度25 ℃，累加次數(shù)64次，采樣點數(shù)32 k。使用MestReNova軟件(v9.0.1)對采集的所有1H NMR譜圖的FID信號加上增寬因子為1 Hz的指數(shù)窗函數(shù)后進(jìn)行傅立葉變換，然后進(jìn)行手動校正相位及基線，采用以TSP的單峰定標(biāo)(δ0.00)。將核磁共振譜圖進(jìn)行分段積分(0.002 ppm/段)，將積分后的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件(V14.1)進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)，該空間中每一個點代表一個樣本，圖中橢圓區(qū)域代表95%置信區(qū)間。對OPLS-DA模型各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，對有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝物進(jìn)一步歸納。在相關(guān)系數(shù)圖中，將每一個變量的loading值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換，基于P=0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義的臨界值，自由度為9，再與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進(jìn)行比對，最終篩選出引起組間差異的代謝物[10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，Morris水迷宮定位航行實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用重復(fù)測量資料的方差分析，其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)多重比較配對t檢驗LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠腦組織病理學(xué)變化 對照組大鼠腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核清晰，神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)、組織間隙均未見明顯異常；相較于對照組，經(jīng)熱打擊復(fù)溫3 h后的HS組大鼠腦組織病理切片可見神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡，細(xì)胞核固縮，染色較深，并見細(xì)胞外間質(zhì)疏松(圖1)。

圖1 兩組大鼠腦組織病理改變(HE ×400)Fig.1 Pathological changes of rats' brain tissue in each group (HE ×400)

2.2 HS組大鼠造模前后的mNSS評分比較 造模前，H S 組大鼠的m N S S 評分為0 分，無神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)；造模后復(fù)溫0 h的mNSS評分為(11.79±0.89)分，造模后復(fù)溫3 h的mNSS評分為(9.29±0.83)分，均明顯高于造模前(P＜0.05)，而造模后復(fù)溫3 h與造模后復(fù)溫0 h的mNSS評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 兩組大鼠Mo r r i s 水迷宮實驗結(jié)果比較 定位航行實驗結(jié)果顯示，對照組尋找平臺潛伏期的時間基線為(34.86±1.96) s，處理后為(33.14±1.51) s；HS組尋找平臺潛伏期的時間在造模前的基線值為(33.93±1.27) s，造模處理后為(53.14±2.14) s，長于造模前基線值及對照組處理后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對照組尋找平臺航行距離的基線值為(377.07±15.39) cm，處理后為(360.79±13.50) cm；HS組尋找平臺航行距離在造模前的基線值為(374.71±11.67) cm，造模處理后為(693.29±28.63) cm，長于造模前基線值及對照組處理后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?？臻g探索實驗結(jié)果顯示，對照組大鼠在目標(biāo)區(qū)域穿越次數(shù)的基線值為(5.79±0.80)次，處理后為(6.36±0.84)次；HS組目標(biāo)區(qū)域穿越次數(shù)在造模前的基線值為(6.29±0.83)次，造模處理后為(2.64±0.75)次，低于造模前基線值及對照組處理后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對照組在目標(biāo)象限航行時間百分比的基線值為(58.42%±1.57%)，處理后為(65.78%±1.06%)；HS組目標(biāo)象限航行時間百分比在造模前的基線值為(59.34%±1.73%)，造模后為(35.81%±1.14%)，低于造模前基線值及對照組處理后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.4 HS大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代謝組學(xué)分析

2.4.1 大鼠腦組織提取物的1H NMR波譜 對照組及HS組大鼠腦組織提取液的典型1H NMR譜(δ0.5～4.5)如圖3所示。歸屬的代謝物包括異亮氨酸(Ile，δ0.94，δ1.01)，乳酸(Lac，δ1.33，δ4.11)，丙氨酸(Ala，δ1.48)，醋酸(Ace，δ1.92)，谷氨酸(Glu，δ2.35，δ2.12，δ2.07)，琥珀酸(Suc，δ2.42)，谷氨酰胺(Gln，δ2.45)，天冬氨酸(Asp，δ2.67，δ2.81，δ3.95)，膽堿(Cho，δ3.2)，肌醇(m-I，δ3.26，δ3.62，δ4.07)，甘氨酸(Gly，δ3.56)，還原型谷胱甘肽(GSH，δ2.56，δ2.95)，丙酮酸(Py，δ2.38)。

圖2 兩組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果Fig.2 Morris water maze tests results of two groups of rats

圖3 兩組大鼠腦組織提取物典型1H NMR波譜Fig.3 Typical 1H NMR spectrum of rats' brain tissue extracts of control group and HS group

圖4 兩組大鼠腦組織提取物1H NMR數(shù)據(jù)OPLS-DA得分散點分布Fig.4 Score scatter plot of OPLS-DA model in 1H NMR of rats' brain tissue extracts of control group and HS group

2.4.2 兩組大鼠腦組織樣本提取物1H NMR數(shù)據(jù)的OPLS-DA分析 由OPLS-DA得分散點圖(圖4)可見，對照組與HS組的差異沿t[1]軸已達(dá)到最大化，兩組大鼠腦組織代謝輪廓存在明顯差異。橫坐標(biāo)t[1]P表示第一主成分的預(yù)測主成分得分，縱坐標(biāo)t[1]O表示正交主成分得分；兩組樣本區(qū)分顯著，樣本均處于99%置信區(qū)間內(nèi)。圖中一個點代表兩組某一個時間點的代謝輪廓。結(jié)合腦組織樣本荷載圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HS早期大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代謝模式發(fā)生明顯改變，與對照組相比，HS組大鼠腦內(nèi)谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、琥珀酸等的含量升高(P＜0.05)，而天冬氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽、丙酮酸等的含量下降(P＜0.05，圖5)。

3 討 論

圖5 兩組大鼠腦組織提取物1H NMR數(shù)據(jù)OPLS-DA載荷特點Fig.5 Load diagram of OPLS-DA model in 1H NMR of rats' brain tissue extracts of control group and HS group

腦是HS早期最易受損的靶器官，磁共振檢查發(fā)現(xiàn)HS腦損傷患者的靶部位多位于海馬、小腦及丘腦[10]。研究顯示，隨著HS程度加重，腦組織會逐漸出現(xiàn)水腫、神經(jīng)元變性、壞死等[11]。本研究結(jié)果顯示，HS可在短時間內(nèi)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，早期即可出現(xiàn)神經(jīng)元壞死或凋亡，更加明確了熱打擊對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

HS患者在發(fā)病早期主要表現(xiàn)為精神異常及認(rèn)知功能障礙，若不盡早予以干預(yù)，隨即發(fā)生記憶減退、意識模糊直至譫妄、驚厥、四肢抽搐，甚至昏迷、死亡[12]。針對HS的有效治療干預(yù)應(yīng)在發(fā)病幾個小時內(nèi)完成，因此，闡明熱打擊相關(guān)的早期腦損傷分子機(jī)制更具現(xiàn)實意義及臨床應(yīng)用價值。

目前研究顯示，熱打擊致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制主要包括高熱直接損傷、腦缺血缺氧性改變、全身炎癥反應(yīng)、自由基損傷、內(nèi)皮素增加及多種神經(jīng)遞質(zhì)改變等，其中，腦缺血缺氧后出現(xiàn)的腦組織代謝紊亂被認(rèn)為是熱打擊影響腦功能的首要因 素[13-14]?；贜MR的代謝組學(xué)技術(shù)可以實現(xiàn)無創(chuàng)、無偏向性的檢測，具有良好的客觀性及可重復(fù)性，在疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療研究方面具有重要作用[6-7]。

有研究報道，熱打擊可誘導(dǎo)大鼠腦中的神經(jīng)炎癥，造成谷氨酸含量異常[15]。本研究應(yīng)用基于1H NMR的代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，HS組大鼠腦中谷氨酸及谷氨酰胺含量均明顯升高，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)甘氨酸明顯下調(diào)，進(jìn)一步證實了熱打擊可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)代謝紊亂。谷氨酸作為哺乳動物體內(nèi)分布最廣、最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與機(jī)體的多種細(xì)胞活動及生理功能[16]。神經(jīng)元釋放的谷氨酸被星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取并轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，谷氨酰胺又被轉(zhuǎn)運(yùn)回神經(jīng)元合成谷氨酸，谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)是體內(nèi)生成谷氨酸的主要途徑[17]。谷氨酸異常增多可過度激活谷氨酸受體，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷級聯(lián)反應(yīng)，造成神經(jīng)元的凋亡[18]。甘氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是腦組織中重要的自我保護(hù)調(diào)節(jié)劑，對腦神經(jīng)元起到保護(hù)作用，可以抑制興奮性中毒及氧化應(yīng)激，防止神經(jīng)細(xì)胞受損[19]。

離子型谷氨酸受體(N-methy l-D-aspar tate receptor，NMDA)廣泛存在于大腦神經(jīng)元表面，在海馬CA1區(qū)表達(dá)最為密集，與學(xué)習(xí)記憶活動及認(rèn)知功能緊密相關(guān)[20]。NMDA-ERK-CREB信號通路是學(xué)習(xí)記憶相關(guān)通路中的重要環(huán)節(jié)，該通路發(fā)生異常與多種伴有認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)精神疾病相關(guān)，如阿爾茨海默病、精神分裂癥、抑郁癥、腦卒中后腦損傷等。生理情況下，谷氨酸可與NMDA結(jié)合，引起Ca2+內(nèi)流，結(jié)合到鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)后，通過Ras-Raf-MEK途徑調(diào)節(jié)下游ERK-CREB通路的活性，調(diào)控長時程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)與神經(jīng)元突觸的可塑性，參與學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知功能形成過程[21-22]。而過度激活海馬與皮質(zhì)神經(jīng)元的NMDA可導(dǎo)致興奮性氨基酸毒性損傷，從而影響學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號通路，造成認(rèn)知功能受損[20]。本研究從組織病理學(xué)方面發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HS組大鼠的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生明顯的壞死、凋亡；通過mNSS評分分析、Morris水迷宮實驗可以發(fā)現(xiàn)，在HS早期，大鼠的運(yùn)動、平衡、肌張力等基本神經(jīng)功能以及空間記憶、方位定向能力等認(rèn)知功能就已經(jīng)受損，提示在HS早期腦損傷中，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂發(fā)揮了一定作用。

高熱刺激會使組織細(xì)胞的蛋白酶變性失活，細(xì)胞膜及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，干擾有氧代謝途徑[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱打擊可導(dǎo)致腦組織中乳酸異常升高，而乳酸在腦內(nèi)是由能量底物葡萄糖通過無氧酵解方式代謝產(chǎn)生的，說明熱打擊過程中有氧代謝途徑被抑制，而無氧酵解途徑增強(qiáng)。熱打擊結(jié)束后，經(jīng)3 h的復(fù)溫后，三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物琥珀酸含量增多，天冬氨酸、丙酮酸含量下降，提示三羧酸循環(huán)及有氧代謝途徑均增強(qiáng)。大鼠經(jīng)熱打擊出艙后，直腸溫度在1～2 h會迅速降低，表現(xiàn)為特有的低體溫狀態(tài)，然后進(jìn)入恢復(fù)期[24]。HS早期，腦組織中能量代謝模式從無氧酵解向有氧代謝的轉(zhuǎn)變可能與熱刺激的解除及大鼠進(jìn)入恢復(fù)期、腦功能緩慢平穩(wěn)恢復(fù)有關(guān)，致使復(fù)溫3 h后的mNSS評分較造模后0 h有下降 趨勢。

谷胱甘肽是體內(nèi)重要的自由基清除劑及抗氧化劑，還原型谷胱甘肽可促進(jìn)體內(nèi)自由基的清除，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[25]。本研究發(fā)現(xiàn)熱打擊可致大鼠腦組織還原型谷胱甘肽含量下降，可能與熱打擊所致的腦組織氧化損傷引起的還原型谷胱甘肽過度消耗相關(guān)[26]。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的大量氧自由基可引起細(xì)胞壞死、凋亡[27-28]，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。

綜上所述，本研究應(yīng)用組織病理學(xué)分析、動物行為學(xué)分析及基于1H NMR的代謝組學(xué)分析方法研究了HS早期大鼠腦損傷及其相關(guān)代謝的變化，結(jié)果顯示在HS早期大鼠即出現(xiàn)了神經(jīng)功能損害及認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能涉及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂、能量代謝模式的改變及氧化應(yīng)激過程。但本研究以觀察性研究為主，且缺乏腦組織定位信息，尚需要對局部腦區(qū)進(jìn)行獨立、動態(tài)的代謝組學(xué)分析。本研究從代謝水平初步探討了HS腦損傷的相關(guān)機(jī)制，為深入認(rèn)識HS腦損傷提供了新思路。