右美托咪定通過α7nAChR介導(dǎo)的TLR4/NF-κB通路減輕脂多糖 誘導(dǎo)的急性肺損傷

姜遠旭，詹美俊，幸志強，劉占立，魏安山*

1深圳市人民醫(yī)院(南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)麻醉科，廣東深圳 518020；2深圳市麻醉醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣東深圳 518020

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種危重癥，主要由各種致病因素導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)失控所致[1-2]，由于其病死率高而備受關(guān)注。既往動物研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可通過抑制炎癥反應(yīng)而減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的ALI[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可通過減輕炎癥反應(yīng)對行全胸腔鏡二尖瓣手術(shù)患者的肺功能發(fā)揮保護作用[4]。 右美托咪定的抗炎作用比較明確，但具體機制尚不清楚。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路在炎癥反應(yīng)調(diào)控中扮演著重要角色[5-6]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可通過抑制TLR4/NF-κB的表達而減輕炎癥反應(yīng)[7]。煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChRs)在調(diào)節(jié)膽堿能抗炎系統(tǒng)中起重要作用，其中α7nAChR是研究最多的亞型之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，α7nAChR激動劑可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路減輕體外循環(huán)誘導(dǎo)的大鼠腦神經(jīng)元凋亡，并對其腦損傷起到保護作用[8]。在膿毒癥模型中，刺激α7nAChRs可抑制TLR4/NF-κB的表達，進而減輕膿毒癥損傷[9]。但右美托咪定減輕ALI的作用是否與α7nAChRs介導(dǎo)的TLR4/NF-κB下調(diào)有關(guān)尚不明確。本研究旨在探討右美托咪定是否通過α7nAChR介導(dǎo)的TLR4/NF-κB通路減輕LPS誘導(dǎo)的ALI。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 SPF級Wistar大鼠24只，4～7周齡，體重180～200 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；脂多糖(Escherichia coli 055:B5，美國Sigma公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10 ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)；抗α7nAChR、TLR4、p-NF-κB抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、β-actin(美國Abcam公司)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ALI模型制備及實驗分組 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，股靜脈置入24#套管供實驗中補液和給藥。頸部皮膚消毒，正中切口，暴露氣管并造口，插入自制氣管導(dǎo)管。大鼠隨機分為對照組、急性肺損傷組、右美托咪定治療組與α7nAChR抑制劑α-BGT組，每組6只。麻醉后，對照組腹腔注射生理鹽水；急性肺損傷組股靜脈注射LPS(10 mg/kg)誘導(dǎo)ALI模型；參照文獻[10]，右美托咪定治療組給予LPS后即刻股靜脈持續(xù)輸注右美托咪定[5 μg/(kg.h)]至實驗結(jié)束；α7nAChR抑制劑α-BGT組在輸注右美托咪定前半小時腹腔注射1 μg/kg α-BGT，其余處理同右美托咪定治療組。LPS注射后12 h處死大鼠，收集血液和肺組織。實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.2.2 HE染色觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化 參照文獻[11]進行肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷評分。取部分肺組織，用10%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察。采用半定量評分系統(tǒng)評價肺損傷情況，包括肺泡充血、肺泡出血、中性粒細胞浸潤和肺泡壁厚度。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分=無損傷；1分=輕度損傷(25%)；2分=中度損傷(50%)；3分=重度損傷(75%)；4分=極重度損傷(100%)。各項評定分?jǐn)?shù)相加為肺損傷總評分。

1.2.3 肺組織濕/干重比(W/D)測定 大鼠處死后，取右肺上葉，濾紙蘸干表面水分，置于干燥潔凈的玻璃瓶中，精確稱重，然后置于75 ℃恒溫烤箱中，烘烤24 h至恒重，測定肺組織干重，計算W/D。

1.2.4 動脈血氣分析 大鼠處死前抽取頸動脈血，檢測氧分壓(PaO2)、碳酸氫根(HCO3-)、乳酸(Lac)水平。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總細胞、中性粒細胞及巨噬細胞計數(shù) 開胸后，分離并結(jié)扎右側(cè)主支氣管，經(jīng)氣管緩慢注入冷生理鹽水3 ml，用注射器抽吸2或3次，每次間隔1 min，收集BALF，取1 ml于顯微鏡下在計數(shù)板上行細胞分類及計數(shù)。

1.2.6 肺組織MPO活性檢測 取肺組織100 mg解凍，制備肺組織勻漿測定MPO活性，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.2.7 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-10水平 取冰凍血清，解凍，采用ELISA法測定TNF-α、IL-6、IL-10水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 Western blotting檢測肺組織中α7nAChR、TLR4、p-NF-κB蛋白的表達 取部分肺組織，經(jīng)細胞裂解、蛋白定量、凝膠電泳分離及轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗α7nAChR(1:400)、TLR4(1:1000)、p-NF-κB(1:1000)一抗，1%脫脂奶粉孵育過夜。洗膜，加入辣根過氧化物酶二抗(1:2000)孵育；洗膜，加入化學(xué)發(fā)光增強劑自顯影。采用ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)對蛋白條帶進行掃描分析，以β-actin為內(nèi)參，計算各蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；急性肺損傷組肺組織間隔增厚，肺血管充血，炎性細胞浸潤；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組肺組織形態(tài)變化減輕(圖1A)。與對照組比較，急性肺損傷組肺損傷病理評分升高[(0.17±0.41)分 vs. (3.33±0.52)分，P＜0.01]；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組肺損傷病理評分降低[(1.50±0.55)分，P＜0.01]；與右美托咪定治療組比較，α7nAChR抑制劑α-BGT組肺損傷病理評分升高[(3.00±0.63)分，P＜0.01，圖1B)。

2.2 各組肺組織W/D比較 與對照組比較，急性肺損傷組W/D升高(P＜0.01)；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組W/D降低(6.63±0.53 vs. 4.62±0.71，P＜0.01)；與右美托咪定治療組比較，α7nAChR抑制劑α-BGT組W/D升高(4.62±0.71 vs. 5.42±0.48，P＜0.05，圖1C)。

圖1 右美托咪定對LPS誘導(dǎo)的ALI的影響(HE ×200)Fig.1 Effects of dexmedetomidine on LPS-induced ALI (HE ×200)

2.3 各組大鼠PaO2、HCO3-、Lac水平比較 動脈血氣分析結(jié)果顯示，與對照組比較，急性肺損傷組血液PaO2、HCO3-水平降低，Lac水平升高(P＜0.01)；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組PaO2、HCO3-水平升高[(61±8) mmHg vs. (86±8) mmHg，(12.23±1.87) mmol/L vs. (20.08±1.93) mmol/L，P＜0.01]，Lac水平降低[(4.95±0.51) mmol/L vs. (2.00±0.26) mmol/L， P＜0.01]；與右美托咪定治療組比較，α7nAChR抑 制 劑α -B G T 組P a O2、 H C O3-水 平 降 低[(74±4) mmHg、(16.95±1.86) mmol/L]，Lac水平升高[(2.65±0.29) mmol/L，P＜0.01，圖2]。

2.4 各組大鼠BALF中總細胞、中性粒細胞、巨噬細胞計數(shù)及肺組織MPO活性比較 與對照組比較，急性肺損傷組BALF中總細胞、中性粒細胞、巨噬細胞計數(shù)增多(P＜0.01)，肺組織MPO活性升高(P＜0.01)；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組BALF中總細胞、中性粒細胞、巨噬細胞計數(shù)減少[(5.63±0.51)×106/ml vs. (3.62±0.44)×106/ml，(0.54±0.09)×106/ml vs. (0.30±0.07)×106/ml，(2.47±0.37)×106/ml vs. (1.36±0.32)×106/ml，P＜0.01]，肺組織MPO活性降低[(4.22±0.63) U/g vs. (2.08±0.26) U/g，P＜0.01]；與右美托咪定治療組比較，α7nAChR抑制劑α-BGT組BALF中總細胞[(4.68±0.50)×106/ml]、中性粒細胞[(0.41±0.04) ×106/ml]、巨噬細胞[(2.00±0.16)×106/ml]計數(shù)增多，肺組織MPO活性升高[(3.11±0.28) U/g，P＜0.01，圖3]。

圖2 右美托咪定對各組大鼠PaO2、HCO3-及Lac水平的影響Fig.2 Effects of dexmedetomidine on PaO2, HCO3- and Lac in arterial blood of rats in each group

圖3 右美托咪定對各組大鼠BALF中炎性細胞和肺組織MPO活性的影響Fig.3 Effects of dexmedetomidine on inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid and MPO activity in lung tissues of rats in each group

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較 ELISA法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，急性肺損傷組血清TNF-α、IL-6及IL-10水平升高(P＜0.01)；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組TNF-α、IL-6水平降低[(1046.41±109.61) pg/ml vs. (469.69±53.82) pg/ml，(2347.94±196.11) pg/ml vs. (1408.64±163.20) pg/ml]，IL-10水平升高[(652.94±53.49) pg/ml vs. (1249.35±136.69) pg/ml， P＜0.01]；與右美托咪定治療組比較，α7nAChR抑制劑α-BGT組TNF-α、IL-6水平升高[(821.64±65.72) pg/ml、 (2007.788.64±142.67) pg/ml]，IL-10水平降低[(862.96±69.15) pg/ml，P＜0.01，圖4]。

2.6 各組大鼠肺組織α7nAChR、TLR4、p-NF-κB蛋白表達水平比較 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，急性肺損傷組肺組織α7nAChR、TLR4、p-NF-κB蛋白表達水平升高(0.05±0.02、0.08±0.02、0.27±0.02，P＜0.01)；與急性肺損傷組比較，右美托咪定治療組α7nAChR蛋白表達水平進一步升高(0.16±0.01 vs. 0.36±0.01)，TLR4、p-NF-κB蛋白表達水平降低(0.40±0.03 vs. 0.15±0.01，0.69±0.07 vs. 0.33±0.03，P＜0.01)；與右美托咪定治療組比較，α7nAChR抑制劑α-BGT組α7nAChR蛋白表達水平降低(0.28±0.02)，TLR4、p-NF-κB蛋白表達水平升高(0.21±0.02、0.46±0.02，P＜0.01，圖5)。

圖4 右美托咪定對各組大鼠血清炎性細胞因子的影響Fig.4 Effects of dexmedetomidine on inflammatory cytokines in blood of rats in each group

圖5 右美托咪定對各組大鼠肺組織α7nAChR、TLR4、p-NF-κB蛋白表達的影響Fig.5 Effects of dexmedetomidine on the expression of α7nAChR, TLR4 and p-NF-κB proteins in lung tissues of rats in each group

3 討 論

LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，常用來誘導(dǎo)建立ALI模型[12]。本研究動脈血氣分析結(jié)果顯示，靜脈注射10 mg/kg LPS 12 h后，急性肺損傷組大鼠PaO2水平降低，HCO3-、Lac水平升高，表明大鼠出現(xiàn)明顯的低氧血癥及細胞缺氧；急性肺損傷組W/D增高表明肺組織水腫。MPO活性可反映中性粒細胞在組織中的聚集程度，本研究中急性肺損傷組MPO活性明顯增高，提示肺組織中有大量中性粒細胞浸潤；急性肺損傷組BALF中中性粒細胞、巨噬細胞計數(shù)明顯增多，表明LPS誘導(dǎo)了明顯的炎癥反應(yīng)。肺組織病理學(xué)觀察顯示，急性肺損傷組肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁水腫，肺間質(zhì)增厚，肺泡腔內(nèi)有中性粒細胞等炎性細胞浸潤；與對照組比較，急性肺損傷組肺損傷病理評分明顯增高，提示股靜脈注射LPS成功制備了大鼠ALI模型。

炎癥反應(yīng)在ALI發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。LPS使中性粒細胞激活，然后巨噬細胞等炎性細胞被激活而大量釋放TNF-α等炎性細胞因子，這些炎性細胞因子反過來激活炎性細胞，最終形成炎癥瀑布反應(yīng)，損害各個器官的功能，其中肺組織最先受到打擊。中性粒細胞激活后，通過釋放ROS、中性粒細胞彈性蛋白酶等造成肺毛細血管內(nèi)皮和肺泡上皮等實質(zhì)細胞損傷，導(dǎo)致肺通透性增加[13-14]，從而使肺組織內(nèi)液體生成增多。此外，中性粒細胞等炎性細胞釋放的炎性細胞因子如TNF-α、IL-6等還可導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體吸收減少。故炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺水腫，進而導(dǎo)致氧合功能障礙及嚴(yán)重的低氧血癥。因此，抑制炎癥反應(yīng)在ALI的治療中尤為重要。右美托咪定是一種高選擇性的α2腎上腺素能受體(α2AR)激動劑，因其鎮(zhèn)靜作用強且對呼吸的影響小而廣泛應(yīng)用于重癥患者的鎮(zhèn)靜及作為全麻輔助用藥[15]。一項隨機對照臨床研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可降低術(shù)后肺部并發(fā)癥的發(fā)生率[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定具有抗炎作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示，右美托咪定可降低肺組織MPO活性及BALF中中性粒細胞及巨噬細胞計數(shù)，抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-6等的釋放，促進抗炎細胞因子IL-10的釋放，提示右美托咪定可減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，右美托咪定治療可明顯減輕LPS誘導(dǎo)的肺水腫，改善呼吸功能及減輕肺損傷，提示右美托咪定的治療作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。雖然右美托咪定減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有明確的結(jié)論，但其具體作用機制仍不清楚。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，自主神經(jīng)系統(tǒng)在控制炎癥及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[19]。膽堿能抗炎通路是一種神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)軸，可調(diào)節(jié)先天免疫細胞反應(yīng)。膽堿能抗炎通路包括傳出的迷走神經(jīng)、乙酰膽堿和α7nAChR。中樞神經(jīng)膽堿能神經(jīng)元被炎癥激活，將信息傳遞給傳出的迷走神經(jīng)，從而釋放乙酰膽堿，乙酰膽堿通過與免疫細胞上的α7nAChR相互作用，抑制促炎因子的產(chǎn)生[20]。因此，膽堿能抗炎通路在炎癥發(fā)展中起到負反饋調(diào)節(jié)的作用。既往研究報道，在膿毒癥和缺血再灌注損傷實驗?zāi)Ｐ椭校憠A能抗炎通路能抑制炎性細胞因子的釋放，進而抑制過度的炎癥反應(yīng)[20-22]。既往研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可通過加強副交感神經(jīng)系統(tǒng)的活動而激活傳出的迷走神經(jīng)，進而抑制促炎細胞因子的生物合成和釋放[23]，而通過選擇性抑制劑抑制α7nAChR或切斷迷走神經(jīng)后，其抗炎作用明顯減弱[24]。本研究結(jié)果與上述研究一致：右美托咪定減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及肺損傷的作用被α7nAChR抑制劑α-BGT部分逆轉(zhuǎn)，提示右美托咪定的抗炎作用與膽堿能通路有關(guān)。

TLR4是LPS的主要受體，廣泛分布于肺組織中性粒細胞中，LPS與TLR4結(jié)合后，可激活NF-κB，促進炎性細胞因子釋放。有研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的ALI中，TLR4/NF-κB激活與過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[25]。最近研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制TLR4/NF-κB而發(fā)揮抗炎作用[26]。既往有研究報道，右美托咪定下調(diào)TLR4依賴于α7nAChR[27]，提示右美托咪定抑制TLR4/NF-κB信號通路可能與α7nAChR有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，給予LPS后，TLR4/NF-κB表達增加，且α7nAChR表達增加，分析原因為LPS作用后，機體在啟動促炎反應(yīng)的同時激發(fā)了抗炎反應(yīng)系統(tǒng)，試圖在促炎與抗炎之間達到平衡，以避免過度炎癥反應(yīng)對組織細胞的損傷，這是一種保護機制。本研究還觀察到，給予右美托咪定治療后，α7nAChR的表達進一步增加，而TLR4/NF-κB表達減少，但α7nAChR抑制劑α-BGT部分逆轉(zhuǎn)了右美托咪定對TLR4/NF-κB的抑制作用，表明右美托咪定的抗炎作用與α7nAChR介導(dǎo)的LR4/NF-κB表達抑制有關(guān)。

本研究存在以下局限性：(1)本研究未通過免疫組化證實α7nAChR在肺組織中的分布及表達，因而不能證實右美托咪定的作用是否通過nAChR的其他亞基起作用；(2)本研究中右美托咪定的用量遠超過臨床用量，因而其臨床作用仍需要進一步驗證；(3)作為α2AR激動劑，右美托咪定處理后α7nAChR的表達是否與α2AR有關(guān)尚待進一步研究。因此，仍需深入研究探討右美托咪定的抗炎及器官保護作用的具體機制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，右美托咪定可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及減輕ALI，其機制與增加α7nAChR的表達及抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。此外，在危重癥患者的鎮(zhèn)靜及全麻術(shù)中，右美托咪定雖然可明顯減少傷害性刺激，但其用于治療ALI等炎癥促發(fā)的危重疾病尚需深入的臨床研究以觀察治療效果。