槐耳對(duì)人急性T淋巴細(xì)胞白血病CEM-C1細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制

任丹薇，龍思利，覃祥，牛亞娜，鐘芳芳，劉靜，劉文君

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科血液腫瘤病區(qū)/四川省出生缺陷臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川瀘州 646000

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占15歲以下兒童確診總數(shù)的25%，且近年來(lái)ALL的發(fā)病率逐年升高[1-3]。文獻(xiàn)報(bào)道，T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)的無(wú)事件生存率(event-free survival，EFS)明顯低于B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)，且T-ALL誘導(dǎo)失敗、復(fù)發(fā)、早期死亡的風(fēng)險(xiǎn)高于B-ALL[4]。歐美國(guó)家T-ALL患兒的5年EFS(5-EFS)為65.7%～83.8%，我國(guó)為40.2%～66.0%，預(yù)后較差[5-6]。 耐藥及復(fù)發(fā)是ALL治療失敗的主要原因，也是阻礙ALL患兒長(zhǎng)期存活的瓶頸[7]。其中，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)耐藥是導(dǎo)致兒童ALL治療失敗的主要原因之一[8]。兒童ALL初治病例中，約有20%的患兒對(duì)GC產(chǎn)生原發(fā)性耐藥；而復(fù)發(fā)病例中，GC耐藥率高達(dá)70%[9-10]。因此，尋找ALL耐藥相關(guān)基因并制定克服ALL耐藥的方案，已成為ALL臨床研究的熱點(diǎn)。

槐耳清膏是槐耳菌質(zhì)的初提物，其主要活性成分是由6種單糖與18種氨基酸結(jié)合形成的多糖蛋白，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒等作用[11-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，槐耳可逆轉(zhuǎn)多種腫瘤的耐藥性[15-17]， 但目前尚無(wú)槐耳逆轉(zhuǎn)ALL耐藥的相關(guān)報(bào)道。莫羅尼鼠白血病病毒前病毒整合位點(diǎn)(provirus integrating site moloney murine leukemia virus，Pim)家族基因包括Pim1、Pim2及Pim3，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，可整合到細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞行為，如細(xì)胞增殖、存活及遷移等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-19]。Pim3是新近發(fā)現(xiàn)且研究較少的一個(gè)Pim亞型，與胰腺癌等多種腫瘤耐藥相關(guān)，可能參與了腫瘤耐藥性的形成過(guò)程[20-21]。本研究以GC耐藥細(xì)胞株CEM-C1及GC敏感細(xì)胞株CEM-C7為研究對(duì)象，探討槐耳能否逆轉(zhuǎn)ALL細(xì)胞對(duì)GC的耐藥性及其可能機(jī)制，旨在探索改善ALL對(duì)GC耐藥的新方法，為優(yōu)化兒童ALL治療方案及改善患兒預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人ALL細(xì)胞株CEM-C1、CEM-C7由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院馬志貴教授饋贈(zèng)?；倍?gòu)自中國(guó)江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司；地塞米松(dexamethasone，DEX)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自中國(guó)杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；青霉素及鏈霉素雙抗、總RNA提取試劑盒、CCK-8及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自上海碧云天公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自日本ToYoBo公司；GAPDH、Pim3引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；兔抗人GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔抗人多藥耐藥基因1(MDR1)、Pim3單克隆抗體一抗購(gòu)自英國(guó)CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)基中，并接種于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、100、200、400、600、800 μg/ml) 槐耳處理24、48、72 h后，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)確定48 h為干預(yù)時(shí)間，200、600 μg/ml槐耳為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度，100 μg/ml槐耳作為聯(lián)合用藥濃度與不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX聯(lián)合作用于CEM-C1細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，轉(zhuǎn)移90 μl細(xì)胞懸液至96孔板中，每孔加入10 μl預(yù)設(shè)濃度的各組藥物，使槐耳終濃度為50、100、200、400、600、800 μg/ml，DEX終濃度為12.5、25、50、100、200 μg/ml，以及100 μg/ml槐耳聯(lián)合不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(僅含培養(yǎng)基及細(xì)胞)及空白組(僅含培養(yǎng)基)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔再加10 μl CCK-8溶液，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)4次。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1－[(OD實(shí)驗(yàn)組－OD藥物對(duì)照)/(OD對(duì)照組－ OD空白組)]×100%。采用GraphPad Prism7軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥株的IC50/加藥處理耐藥株的IC50。兩藥相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)=AB/(A×B)，其中AB為OD聯(lián)合組/OD對(duì)照組，A、B分別為兩種藥物的OD單藥組/OD對(duì)照組。若CDI＜1，兩藥為協(xié)同作用，值越小協(xié)同作用越強(qiáng)；CDI=1，兩藥為相加作用；CDI＞1，兩藥為拮抗作用，值越大拮抗作用越強(qiáng)[22]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞，經(jīng)不同濃度(0、200、600 μg/ml)槐耳處理48 h后，用冷PBS洗滌2次，加入1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液于5 ml Falcon試管中，加入5 μl FITC Annexin V及5 μl PI，室溫避光染色15 min，然后加入300 μl結(jié)合緩沖液混勻，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞，經(jīng)不同濃度(0、200、600 μg/ml)槐耳處理48 h后，用冷PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，取1 ml單細(xì)胞懸液，棄上清，用70%的冷乙醇500 μl懸浮細(xì)胞，4 ℃過(guò)夜固定；PBS洗滌后加入500 μl預(yù)先配制的PI/RNase A工作液混勻，室溫、避光放置30～60 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm波長(zhǎng)處的紅色熒光。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞MDR1、Pim3蛋白的表達(dá)水平 收集細(xì)胞，設(shè)置CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞組及C E M-C 1 細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、2 0 0、600 μg/ml)槐耳處理組，按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞全蛋白。BCA法測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度取等量蛋白，加5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，經(jīng)PBST充分洗滌10 min×3次，MDR1、Pim3單克隆抗體均按1:1000稀釋。4 ℃孵育過(guò)夜，充分洗滌后加山羊抗兔二抗，按1:2000稀釋，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影。采用Image J軟件分析圖像，以MDR1、Pim3蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Pim3 mRNA的表達(dá)水平 收集細(xì)胞，設(shè)置CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞組及CEM-C1細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、200、600 μg/ml) 槐耳處理組，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR法擴(kuò)增目的基因及內(nèi)參基因GAPDH。Pim3引物：正向5'-ACCGACTT CGACGGCAC-3'，反向5'-TATCGTAGAGAAGCACG CCC-3'；GAPDH引物：正向5'-ATGCTGGCGCT GAGTACGTC-3'，反向5'-GGTCATGAGTCCTTCCA CGATA-3'。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 槐耳對(duì)ALL細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，用槐耳對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞處理24 h及72 h，100、200、400、600、800 μg/ml槐耳組的增殖抑制率明顯高于50 μg/ml槐耳組；槐耳處理48 h，細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴方式增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。根據(jù)結(jié)果選用200、600 μg/ml槐耳作為本實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度，100 μg/ml 槐耳作為聯(lián)合用藥濃度?；倍幚鞢E M-C 1 及CEM-C7細(xì)胞24、48、72 h后，CEM-C1細(xì)胞的IC50分別為2272.0、313.4、1275.0 μg/ml，CEM-C7細(xì)胞的IC50分別為1406.0、757.5、1653.0 μg/ml，表明槐耳處理48 h對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇48 h作為干預(yù)時(shí)間。

2.2 槐耳對(duì)CEM-C1細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX單獨(dú)作用于兩種細(xì)胞48 h后，CEM-C1細(xì)胞的IC50為98.89 μg/ml，CEM-C7細(xì)胞的IC50為0.16 μg/ml，依據(jù)公式計(jì)算CEM-C1細(xì)胞的耐藥倍數(shù)是CEM-C7細(xì)胞的618.06倍，符合兩種細(xì)胞的特性。槐耳(100 μg/ml)+DEX處理CEM-C1細(xì)胞后的IC50為73.75 μg/ml，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.34倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而聯(lián)合用藥對(duì)CEM-C7細(xì)胞無(wú)明顯影響。與單用DEX各組比較，100 μg/ml 槐耳聯(lián)合低濃度(12.5、25、50 μg/ml)DEX提高了CEM-C1細(xì)胞的增殖抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)；各濃度DEX聯(lián)用槐耳的CDI均＜1，表明兩藥具有協(xié)同作用。

圖1 槐耳對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞增殖的影響(n=4)Fig.1 Effect of Huaier on the proliferation of CEM-C1 and CEM-C7 cells (n=4)

2.3 槐耳對(duì)CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著槐耳濃度的增加，CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞的凋亡率逐漸增高，與對(duì)照組(0 μg/ml槐耳)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 DEX+槐耳對(duì)CEM-C1細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of DEX+Huaier on the inhibition ratio to CEM-C1 cells proliferation (±s, n=4)

表1 DEX+槐耳對(duì)CEM-C1細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of DEX+Huaier on the inhibition ratio to CEM-C1 cells proliferation (±s, n=4)

CDI. 兩藥相互作用指數(shù)

DEX濃度(μg/ml) 細(xì)胞增殖抑制率(%) CDI t/Z P DEX組 100 μg/ml槐耳+DEX組12.5 10.020±0.783 20.820±2.224 0.847±0.108 -9.163 0.001 25 13.850±1.302 25.140±3.352 0.817±0.121 -6.282 0.004 50 23.160±5.649 32.240±2.353 0.816±0.120 -2.968 0.025 100 48.410±6.810 58.280±4.428 0.768±0.240 -2.429 0.051 200 74.000±2.593 77.190±0.553 0.794±0.190 -2.406 0.088

表2 不同濃度槐耳對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞凋亡率的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of Huaier on the apoptosis of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

表2 不同濃度槐耳對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞凋亡率的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of Huaier on the apoptosis of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

與0 μg/ml槐耳組比較，(1)P＜0.05；與200 μg/ml槐耳組比較，(2)P＜0.05。

槐耳濃度 CEM-C1細(xì)胞凋亡率 CEM-C7細(xì)胞凋亡率0 μg/ml 9.937±0.966 7.810±0.850 200 μg/ml 27.780±0.528(1) 26.643±1.310(1)600 μg/ml 35.577±1.258(1)(2) 34.820±0.697(1)(2)F 556.401 590.162 P＜0.001 ＜0.001

2.4 不同濃度槐耳對(duì)CEM-C1細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，200、600 μg/ml槐耳處理CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞48 h后，S期細(xì)胞比例比對(duì)照組增高，G0/G1期細(xì)胞比例比對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各組細(xì)胞的G2/M期比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表3)。

2.5 CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞中及槐耳處理后CEM-C1細(xì)胞中MDR1、Pim3蛋白表達(dá)水平比較 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，CEM-C1細(xì)胞中MDR1蛋白表達(dá)水平(2.41±0.32)明顯高于CEM-C7細(xì)胞(1.34±0.43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.45，P＜0.05，圖2A)。CEM-C1細(xì)胞經(jīng)200、600 μg/ml槐耳處理后，MDR1蛋白表達(dá)水平均低于0 μg/ml槐耳組(1.62±0.03、1.34±0.16 vs. 1.92±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2B)。CEM-C7細(xì)胞中Pim3蛋白表達(dá)水平(0.13±0.05)明顯低于低于CEM-C1細(xì)胞(0.39±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.94，P＜0.05，圖2C)。CEM-C1細(xì)胞經(jīng)200、600 μg/ml槐耳處理后，Pim3蛋白表達(dá)水平均低于0 μg/ml槐耳組(1.05±0.14、0.75±0.13 vs. 1.48±0.33)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2D)。

2.6 CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞中及槐耳處理后CEM-C1細(xì)胞中Pim3 mRNA表達(dá)水平的比較 qRTPCR結(jié)果顯示，CEM-C7細(xì)胞的Pim3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于CEM-C1細(xì)胞(0.37±0.02 vs. 1.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=58.88，P＜0.05，圖3A)；與0 μg/ml槐耳組(1.00)比較，200、600 μg/ml槐耳組CEM-C1細(xì)胞中Pim3 mRNA的表達(dá)水平均明顯降低(分別為0.79±0.12、0.59±0.10)，且600 μg/ml槐耳組明顯低于200 μg/ml槐耳組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3B)。

表3 不同濃度槐耳對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.3 Effects of different concentrations of Huaier on the cell cycle of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

表3 不同濃度槐耳對(duì)CEM-C1及CEM-C7細(xì)胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.3 Effects of different concentrations of Huaier on the cell cycle of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

與0 μg/ml槐耳組比較，(1)P＜0.05。

槐耳濃度(μg/ml) CEM-C1細(xì)胞周期 CEM-C7細(xì)胞周期S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 0 34.807±1.305 9.967±0.112 55.227±1.416 37.823 ±6.362 8.483±1.292 53.693±7.547 200 39.363±0.785(1) 12.790±1.523 47.847±1.250(1) 61.010 ±1.715(1) 6.010±0.306 32.977±1.486(1)600 44.253±2.975(1) 7.663±1.438 48.083±1.857(1) 41.617 ±1.364(1) 10.680 ±0.528 47.553±0.970(1)F 17.985 13.481 22.567 30.752 5.725 16.955 P 0.028 0.059 0.001 ＜0.001 0.068 0.003

圖2 各組細(xì)胞中MDR1、Pim3蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of the protein expression levels of MDR1, Pim3 in each group

圖3 各組細(xì)胞中Pim3 mRNA表達(dá)水平比較 (n=3)Fig.3 Comparison of the expression levels of Pim3 mRNA in each group (n=3)

3 討 論

目前對(duì)腫瘤的治療多采用放療、化療、手術(shù)等綜合治療，但隨著對(duì)中草藥認(rèn)識(shí)的深入，中草藥在腫瘤治療中也發(fā)揮了獨(dú)特的作用，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可增效解毒、延長(zhǎng)生命、改善患者生存狀態(tài)，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)?；倍置彼ň?，為寄生于槐樹(shù)上的木耳，是一種非常重要的藥用真菌，始載于《唐本草》[23]?；倍甯嘧鳛榛倍|(zhì)的初提物，通過(guò)加入相應(yīng)的輔料、烘干可制作成槐耳顆粒?；倍蚓哂锌鼓[瘤作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于原發(fā)性肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的輔助治療[24-26]。單中心研究發(fā)現(xiàn)，槐耳顆粒治療成人慢性粒細(xì)胞白血病慢性期患者的總有效率可達(dá)80%[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，槐耳可劑量依賴性地抑制CEM-C1、CEM-C7細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，表明槐耳對(duì)ALL細(xì)胞具有抗腫瘤效應(yīng)。有研究表明，槐耳可逆轉(zhuǎn)肝癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的耐藥性[28-30]。Qu等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，槐耳可增強(qiáng)伊馬替尼在Ikaros基因亞型6(ikaros isoform 6，Ik6)陽(yáng)性及Ph染色體陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病(Ik6+Ph+ALL)中的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，與單用DEX比較，100 μg/ml槐耳聯(lián)合DEX可進(jìn)一步抑制CEM-C1細(xì)胞的增殖，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.34倍。與對(duì)照組(0 μg/ml槐耳)比較，200、600 μg/ml 槐耳組的G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例增高，提示槐耳可在一定程度上阻滯細(xì)胞的G0/G1期，減少細(xì)胞分裂增殖，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，部分逆轉(zhuǎn)CEM-C1細(xì)胞對(duì)GC的耐藥性。本研究還發(fā)現(xiàn)，與GC敏感株CEM-C7細(xì)胞比較，GC耐藥株CEM-C1細(xì)胞中多藥耐藥基因MDR1呈高表達(dá)，經(jīng)槐耳處理后，CEM-C1細(xì)胞中MDR1的表達(dá)呈劑量依賴性的下降，與童琳等[12]在肝癌中的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明，槐耳可在一定程度上逆轉(zhuǎn)ALL細(xì)胞的耐藥性，并增強(qiáng)CEM-C1細(xì)胞對(duì)DEX的敏感性。

Pim3基因最初是通過(guò)病毒插入篩選發(fā)現(xiàn)的，該基因可促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)展[32-33]。作為Pim家族中的一員，Pim3位于22號(hào)染色體(22q13)，是發(fā)現(xiàn)最晚、研究最少的一個(gè)亞型[34-35]。Pim3參與介導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性白血病及淋巴瘤等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)[36-41]。還有研究發(fā)現(xiàn)抑制Pim3能抑制前列腺癌、肝癌、胃癌等腫瘤的進(jìn)展[36-37,42]。作為新近發(fā)現(xiàn)且研究較少的一個(gè)亞型，Pim3還被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤耐藥相關(guān)：Guo等[37]發(fā)現(xiàn)，沉默Pim3能逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥；Xu等[20]發(fā)現(xiàn)，沉默Pim3可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖并增加其對(duì)吉西他濱化療的敏感性。本研究結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞CEM-C1中Pim3蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于敏感細(xì)胞CEM-C7，提示Pim3可能參與介導(dǎo)了ALL的耐藥；采用不同濃度槐耳處理CEM-C1細(xì)胞后，其Pim3蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯降低，表明Pim3可能是槐耳逆轉(zhuǎn)ALL耐藥性的靶點(diǎn)之一。因此，以Pim3為目的基因的基因抑制可能為逆轉(zhuǎn)ALL耐藥提供新的治療策略及治療靶點(diǎn)。

綜上所述，槐耳作為一種中成藥制劑，可抑制ALL細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)GC的敏感性，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Pim3有關(guān)。本研究結(jié)果為槐耳輔助治療ALL提供了新的理論依據(jù)，槐耳抑制Pim3基因的表達(dá)可能是一種潛在的治療ALL耐藥的有效方法，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。