四種消毒劑對菲律賓蛤仔的急性毒性研究

陳 志，李偉鵬，胡豐曉，黃 健，陳啟春，魏成陳，連晨陽

（1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州350002；2.福建農(nóng)林大學，福州350001；3.福建省水產(chǎn)技術推廣總站，福州350002）

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum），也稱雜色蛤，南方一般俗稱“花蛤”，其他不同地區(qū)也有稱作沙蜆子、沙蛤、蛤蜊等，其隸屬于瓣鰓綱真瓣鰓目簾蛤科蛤仔屬，廣泛分布于中國山東、福建、廣東等沿海，在日本、朝鮮、菲律賓等海區(qū)也多有分布［1］。菲律賓蛤仔肉質(zhì)細嫩，蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，是中國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一［2］，沿海灘涂養(yǎng)殖廣泛，在進行蛤仔人工育苗、養(yǎng)殖過程中，各類消毒劑的使用必不可少。因此，本試驗選用了4種市售常見的消毒劑，以菲律賓蛤仔成貝為試驗對象，進行急性毒性試驗，得出半數(shù)致死濃度和安全濃度等，探究菲律賓蛤仔在4種消毒劑不同濃度下的耐受能力，為菲律賓蛤仔人工育苗和養(yǎng)殖過程中消毒劑的選擇與使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

菲律賓蛤仔選購自福州市倉山區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，測量其平均殼長（3.13±0.22）cm，平均殼寬（2.09±0.15）cm，平均殼高（1.41±0.08）cm，平均重量（6.32±1.07）g，移至實驗室后用海水暫養(yǎng)2 h，期間投喂適量叉邊金藻，并及時剔除死亡個體。

1.2 試驗藥劑

選用了4種常見消毒劑，具體見表1，在試驗前先配制成適宜濃度的母液，試驗過程中可根據(jù)不同濃度梯度取相應量的母液進行稀釋，配成所需的試驗暴露濃度，試劑均現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 4種常用消毒劑

1.3 試驗方法

通過預試驗確定試驗濃度范圍，再在此濃度范圍內(nèi)按照等對數(shù)間距設置5個濃度梯度，然后將母液稀釋配成4種消毒劑各自對應選取的各組濃度，試驗開始時設置1個空白對照組，每組濃度設有3個平行試驗組，高錳酸鉀試驗濃度設置為0.79、2.00、5.00、12.60和31.60 mg/L；聚維酮碘試驗濃度設置為75.00、120.00、194.00、311.00和500.00 mg/L；二氧化氯試驗濃度設置為1.73、5.00、14.00、40.00和114.00 mg/L；甲醛試驗濃度設置為1.00、17.80、31.60、56.00和100.00 mg/L。

試驗方法為靜態(tài)急性毒性試驗法，在白色塑料箱（34 cm×22 cm×21 cm）中進行，每個箱內(nèi)加入已充分曝氣的海水5 L和受試的菲律賓蛤仔10只；試驗期間測得水溫為25.0～25.9℃，pH為7.75～8.05，鹽度為28.0，溶氧量為4～6 mg/L。整個試驗過程不換水、不充氣，持續(xù)96 h，每隔12 h觀察一次，并將死亡個體挑出，防止進一步惡化水體，在24、48、72和96 h時分別對菲律賓蛤仔死亡數(shù)進行統(tǒng)計并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)取試驗組與重復組的平均值，再利用SPSS19.0軟件Probit回歸分析測算4種消毒劑在各個時間段的95%置信區(qū)間，再通過寇氏法計算出對應的半數(shù)致死濃度（LC50），然后由這些數(shù)據(jù)計算出各安全濃度值。其計算公式為：安全濃度（SC）=LC50（96 h）×0.1［3］。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種消毒劑對菲律賓蛤仔的急性毒性結(jié)果

4種消毒劑的半數(shù)致死濃度和安全濃度結(jié)果如表2所示。隨著受試時間的延長，菲律賓蛤仔對4種消毒劑的半數(shù)致死濃度均呈明顯下降趨勢，且各安全濃度從大到小依次為聚維酮碘（11.04 mg/L）＞甲醛（1.87 mg/L）＞二氧化氯（0.68 mg/L）＞高錳酸鉀（0.24 mg/L）。

表2 4種消毒劑對菲律賓蛤仔的半致死濃度和安全濃度

2.2 菲律賓蛤仔中毒表現(xiàn)以及死亡率與濃度關系分析

2.2.1 高錳酸鉀對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試驗開始后2 h內(nèi)，高錳酸鉀低濃度試驗組（0.79 mg/L）和對照組菲律賓蛤仔活動即恢復正常，殼口微開，水管已正常伸出過濾水體，部分個體斧足伸出，對比兩試驗組，受試個體狀態(tài)并無明顯差異；24 h時，低濃度組（0.79、2.00 mg/L）與對照組均表現(xiàn)正常，菲律賓蛤仔能正常進行水體交換，水管白凈未泛黃；48 h時，低濃度組（0.79、2.00 mg/L）開始出現(xiàn)死亡個體；96 h時，共有半數(shù)死亡，剩余存活個體活動顯著緩慢，對刺激的反應也較遲鈍，水管微微露出，殼口張開呈細縫狀。高錳酸鉀高濃度試驗組（12.60、31.60 mg/L）中，菲律賓蛤仔一直緊閉雙殼，未見明顯活動，且由于高錳酸鉀呈紫黑色，使菲律賓蛤仔的雙殼表面呈現(xiàn)出深紫色，殼口邊緣有臟物，撈出的死蛤殼口均張開，內(nèi)臟腐爛呈流體狀。各濃度梯度中死亡情率如圖1所示。由圖1可以看出，菲律賓蛤仔對高錳酸鉀較為敏感。隨著高錳酸鉀濃度的增加，死亡率逐漸增加，24 h最高濃度組（31.60 mg/L）死亡率低于40%；48 h各試驗組死亡率均明顯提高，且隨濃度升高而遞增；72 h最低濃度組死亡率也已經(jīng)高達46.7%；96 h最高濃度組（31.60 mg/L）死亡率達100%。從表2可知，高錳酸鉀對菲律賓蛤仔在24、48、72、96 h時半數(shù)致死濃度分別為28.61、14.48、6.49、2.41 mg/L，96 h的安全濃度為0.24 mg/L。

圖1 不同濃度高錳酸鉀對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響

2.2.2 聚維酮碘對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試

驗開始24 h時，聚維酮碘低濃度組（75.00、120.00 mg/L）和對照組的菲律賓蛤仔活動均恢復正常，水管伸出，部分個體斧足伸出。聚維酮碘高濃度試驗組（194.00、311.00、500.00 mg/L）個體外殼開始緊閉，1 h后少數(shù)外殼微張、水管微露，6 h后水管較對照組變軟，且明顯發(fā)黑，加以刺激收縮緩慢，24 h內(nèi)均出現(xiàn)死亡個體，存活個體中部分雙殼微張，部分雙殼閉合，但水管露出在外，且無法縮回，同時發(fā)現(xiàn)部分菲律賓蛤仔在死亡時殼雖閉合，但內(nèi)部已腐爛。菲律賓蛤仔死亡率隨各濃度梯度變化如圖2所示。由圖2可以看出，24 h內(nèi)各試驗組死亡率均較低，最高濃度組（500.00 mg/L）死亡率低于30%；48 h后，隨聚維酮碘濃度的升高，菲律賓蛤仔死亡率增加趨勢明顯，且在72 h最高濃度組（500.00 mg/L）死亡率達到100%。從表2可知，聚維酮碘對菲律賓蛤仔 在24、48、72、96 h時 的半數(shù)致死濃 度分別為472.88、317.20、176.26、110.36 mg/L，96 h的安全濃度為11.04 mg/L。

圖2 不同濃度聚維酮碘對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響

2.2.3 二氧化氯對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試

驗開始24 h內(nèi)，二氧化氯低濃度試驗組（1.73、5.00 mg/L）和對照組的菲律賓蛤仔活動逐漸恢復正常，觀察到外殼緩慢張開且水管伸出；48 h時，低濃度組（1.73、5.00 mg/L）與空白對照組均表現(xiàn)正常，出現(xiàn)死亡個體；72 h時，二氧化氯低濃度試驗組（1.73、5.00 mg/L）死亡數(shù)逐漸增多。二氧化氯高濃度試驗組（14.00、40.00、114.00 mg/L）中，菲律賓蛤仔表現(xiàn)為外殼緊閉，在外殼表面能觀察到許多細小致密的氣泡，且濃度越高，氣泡數(shù)明顯越多，死亡個體外殼張開，內(nèi)部腐爛程度不一，由于二氧化氯具有漂白性，死蛤殼面略微發(fā)白。菲律賓蛤仔死亡率隨各濃度梯度變化如圖3所示。

圖3 不同濃度二氧化氯對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響

由圖3可以看出，48 h內(nèi)，菲律賓蛤仔的死亡率隨著二氧化氯濃度的增加而緩慢升高，最高濃度組（114.00 mg/L）在48 h的死亡率未達到50%；96 h時，死亡率隨濃度上升較快，在最高濃度組（114.00 mg/L）中個體全部死亡。從表2可知，二氧化氯對菲律賓蛤仔在24、48、72、96 h時的半數(shù)致死濃度分別為116.31、90.21、49.57、6.78 mg/L，96 h的安全濃度為0.68 mg/L。

2.2.4 甲醛對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試驗開

始24 h內(nèi)，甲醛低濃度試驗組（1.00 mg/L）中的菲律賓蛤仔均正常存活，所有個體外殼微張開并伸出水管，水管彎曲向上，部分水管長度超過體長，活力較好；48 h內(nèi)，甲醛試驗組（17.80 mg/L）開始出現(xiàn)死亡個體。高濃度組（31.60、56.00、100.00 mg/L）中，多數(shù)菲律賓蛤仔緊閉外殼，少數(shù)微張，48 h后，死亡個體急劇增加，且死亡個體內(nèi)部腐爛物流出，剩余空殼，水體表面浮有些許黏稠狀不溶于水的物質(zhì)，試驗水體也變得有些渾濁。

圖4 不同濃度甲醛對菲律賓蛤仔的急性中毒死亡率的影響

由圖4可以看出，24 h內(nèi)各試驗組死亡率均較低，在最高濃度組（100.00 mg/L）中達到33.4%；48 h后，死亡率隨濃度提高迅速攀升，最高濃度組（100.00 mg/L）死亡率高達90%。從表2可知，甲醛對菲律賓蛤仔在24、48、72、96 h時的半數(shù)致死濃度分別為92.00、48.79、24.43、18.67 mg/L，96 h的安全濃度為1.87 mg/L。

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，水產(chǎn)消毒劑的品類也紛繁多樣，但在殺菌過程中除了考慮消毒劑的性質(zhì)外，還必須結(jié)合待消毒物品或生物的自身特點。盡管目前市面上已有許多高效用消毒劑，但仍難以達到徹底將病原微生物殺滅的程度，且某些消毒劑在使用過程對原有生態(tài)環(huán)境可能會產(chǎn)生一定的影響［4］。菲律賓蛤仔大規(guī)模人工育苗過程中，為減少育苗水體環(huán)境中病原微生物，通常要對外殼進行全面消毒，在外界藥物刺激下，活力好的菲律賓蛤仔緊閉外殼，通常除了達到消毒效果，可進一步淘汰活力差的個體，剔除死亡個體。故在選用適合于菲律賓蛤仔的消毒劑上，首先需要考慮消毒劑對菲律賓蛤仔的安全性，再根據(jù)具體情況，在保證能達到殺菌目的的前提下，優(yōu)先使用安全性較高的消毒劑［5］，繼而選出最適合菲律賓蛤仔催產(chǎn)、養(yǎng)殖用的消毒劑。

高錳酸鉀是一種性質(zhì)不穩(wěn)定的強氧化劑，溶于水后含有的結(jié)合態(tài)氧能與有機物接觸釋放出新生態(tài)氧，從而快速氧化蛋白，使其活性基因失活，進而殺滅細菌［6］。其使用后副作用小，且又具有無污染無殘留等優(yōu)點，被廣泛使用于水產(chǎn)生產(chǎn)中。本試驗中菲律賓蛤仔對高錳酸鉀的安全濃度為0.24 mg/L，而在生產(chǎn)上用于防治魚類病菌常用的潑灑劑量一般是2～5 mg/L，且高錳酸鉀對方斑東方螺面盤幼蟲和雜色鮑幼鮑等貝類毒性較大［7］，故在菲律賓蛤仔的育苗和養(yǎng)殖中需十分注意對高錳酸鉀的使用，濃度和時間必須要控制好；而從高錳酸鉀對菲律賓蛤仔的12、48、36和96 h的LC50來看，幾乎呈現(xiàn)出遂次減半，說明高錳酸鉀在使用過程中會被還原成二氧化錳，并在菲律賓蛤仔呼吸時不斷沉積于鰓部，進而影響其正常呼吸，這與劉銀華等［8］和柯浩等［9］使用高錳酸鉀對各自受試對象試驗所做出的結(jié)論一致。

聚維酮碘是聚乙烯吡咯烷酮與分子碘結(jié)合形成的高分子絡合物，表面活性劑PVP提供對菌膜的親和力，將其載有的碘與細胞膜和細胞質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)等失活，從而殺滅細菌［10］。其具有高效、低毒、作用對象廣等優(yōu)點，較早便被投入到各類水產(chǎn)品種養(yǎng)殖中進行使用。本試驗中菲律賓蛤仔對聚維酮碘的安全濃度為11.04 mg/L，遠高于聚維酮碘在魚蝦類（0.2～0.5 mg/L）、鱉蛙類（0.3～0.7 mg/L）等的養(yǎng)殖生產(chǎn)中的常用潑灑劑量，表現(xiàn)出了較強的耐受能力。

二氧化氯是一種有刺激性氯臭味的強氧化劑，屬于第四代消毒藥劑，具有廣譜、安全、高效等特點，對病菌具有很強的殺滅作用［11］。當其溶解在水中，會迅速吸附聚集在病毒的顆粒表面，破壞病毒衣殼上的蛋白質(zhì)，抑制其特異性吸附，阻止對宿主細胞的感染［12，13］。二氧化氯具有很強的殺菌能力，藥性的持續(xù)時間也較長，有試驗表明，當用2.0 mg/L的劑量作用30 min時就能殺死幾乎100%的病原微生物［14］。本試驗中菲律賓蛤仔對二氧化氯的安全濃度為0.68 mg/L，相較于已有報道的一些魚蝦類養(yǎng)殖品種，菲律賓蛤仔對二氧化氯的表現(xiàn)較為敏感，但仍高于生產(chǎn)上二氧化氯在水體潑灑的常用量（0.1～0.3 mg/L）［15］，故綜合考慮二氧化氯的諸多方面，就菲律賓蛤仔病害防治來說是較為理想的消毒劑。

水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用甲醛溶液濃度通常在40%左右，也被稱為福爾馬林，歸屬于醛類消毒劑，具強烈刺激性氣味，通過阻止細菌核蛋白的合成或是抑制細菌蛋氨酸的合成影響細胞或細菌的正常生理代謝功能最終致死，達到殺菌殺蟲的目的［16］。本試驗中甲醛表現(xiàn)出較強的毒性，隨著藥物在體內(nèi)積累，48 h致死率較高，菲律賓蛤仔對甲醛溶液的安全濃度為1.87 mg/L，遠低于一些養(yǎng)殖魚類的安全濃度劑量，但高于方斑東風螺面盤幼體的安全濃度（0.28 mg/L）［17］，這說明菲律賓蛤仔對甲醛較為敏感，但是否由其生物特性所致，還需進一步加以驗證。雖然甲醛價廉，水體消毒效果也較好，但長期頻繁使用也會影響到養(yǎng)殖生物的健康，且藥物在生物體內(nèi)殘留時間不確定，故一般不推薦優(yōu)先使用甲醛作為菲律賓蛤仔的消毒劑。

4 結(jié)論

本試驗采用靜態(tài)水試驗法，期間不換水不喂藻，以期試驗結(jié)果更加接近真實值，但在試驗中存在某些不可控因素，如難以做到試驗環(huán)境條件完全不變，加之深夜死亡的菲律賓蛤仔未能及時挑出，加劇了試驗水質(zhì)的惡化，對存活的菲律賓蛤仔造成一定程度的影響。結(jié)果表明，4種消毒劑對菲律賓蛤仔的毒性大小為高錳酸鉀＞二氧化氯＞甲醛＞聚維酮碘。綜合4種消毒劑的各方面效能，在菲律賓蛤仔的催產(chǎn)育苗過程中宜選用聚維酮碘進行消毒，最適使用濃度還有待繼續(xù)探究；在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，消毒藥劑對菲律賓蛤仔的毒性還會受到養(yǎng)殖水體溶氧、pH、水溫、自身狀態(tài)等系列因素影響，故在使用消毒劑時要密切觀察菲律賓蛤仔的活動情況，視具體情況調(diào)整消毒劑的使用濃度和消毒時間以確保安全。