黑種草子總皂苷對人宮頸癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

方 磊，楊 濤，盛 磊，木塔力甫·艾買提，齊鑫鑫，艾尼娃爾·艾克木，*，伊力亞爾·尼加提，*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

宮頸癌是全球發(fā)病率第4 的婦科惡性腫瘤，每年有超過100萬婦女被診斷患有宮頸癌，并有30多萬人因此死亡，宮頸癌對全球女性生命健康造成巨大威脅。在宮頸癌治療方面，放射治療、化學(xué)藥物治療和手術(shù)治療仍是主要治療手段，這些治療方法雖能在一定程度上改善臨床癥狀，提高患者預(yù)后生存率，但會(huì)影響患者的免疫功能導(dǎo)致并發(fā)癥。因此尋找更安全有效的治療手段對改善宮頸癌患者生命質(zhì)量具有重大意義。

傳統(tǒng)中藥可通過多成分、多靶點(diǎn)和多途徑聯(lián)合作用于腫瘤細(xì)胞增殖和周期進(jìn)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，影響相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞因子進(jìn)而發(fā)揮抗宮頸癌作用。黑種草子為瘤果黑種草(

Nigella glandulifera

Freyn)的干燥成熟種子，是一種藥食同源的藥材，在我國新疆地區(qū)有著悠久的藥用和食用歷史?，F(xiàn)代研究表明，黑種草子中富含皂苷、黃酮和生物堿等，具有廣泛的藥理活性。在抗腫瘤作用方面，黑種草子皂苷類單體Nigella A、總黃酮及酚酸類物質(zhì)都表現(xiàn)出良好效果。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞通過降解胞內(nèi)損壞的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)等，以進(jìn)行細(xì)胞自身代謝和更新，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身物質(zhì)循環(huán)利用的過程。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)過程，腫瘤細(xì)胞可通過自噬維持自身環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在各種惡劣生長環(huán)境下生存。然而長時(shí)間高水平的自噬則會(huì)失去對細(xì)胞的保護(hù)作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此尋找針對細(xì)胞自噬途徑的治療靶點(diǎn)，可能建立新的腫瘤治療方法。

本研究在黑種草子總皂苷(total saponins from the seeds of

Nigella glandulifera

Freyn，TSNG)對人宮頸癌SiHa細(xì)胞體外增殖活性及遷移抑制作用的研究基礎(chǔ)上，擬探討TSNG對SiHa細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人宮頸癌SiHa細(xì)胞株，由新疆醫(yī)科大學(xué)地方病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；黑種草子，購自新疆麥迪森有限公司，經(jīng)質(zhì)檢鑒定符合藥典規(guī)定；胎牛血清，購自美國Gibco 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶，均購自天津?yàn)笊锕?；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)，購自美國MP biomedical 公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購自美國BIO FROXX 公司；凋亡檢測試劑盒，購自美國BD 公司；Hoechst33342 試劑盒、單丹磺酰戊二胺(monodansyl cadaverine，MDC)試劑盒，均購自北京索萊寶公司；硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)，購自上海源葉公司；抗LC3B、抗p62 抗體均購自美國Abcam 公司；抗β-actin抗體，購自affinity公司。

1.2 儀器設(shè)備

本研究使用的主要儀器有：低溫高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter 公司)；MLS-3020U 高壓滅菌鍋(日本Snayo 公 司)； 倒 置 熒 光 顯 微 鏡(德 國 Leica 公 司)；Thermo Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀(美國 Thermo 公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)；激光共聚焦顯微鏡(日 本 Nikon 公 司)； 電 泳 儀 (美 國 Bio-Rad 公 司)；FluorChem E 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.3 TSNG制備

黑種草子粉碎，以固液比1∶10 加入30%乙醇70 ℃回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，旋蒸濃縮后經(jīng)AB-8 大孔樹脂純化后得TSNG，以香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測定總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.2%。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌SiHa細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于CO體積分?jǐn)?shù)為5%的37 ℃培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長至匯合度為80%～90%時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置TSNG 系列濃度(0、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL)，作用24 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 200 μL后于酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度值

D

(490)，按下式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率/%＝[

D

(490)-

D

(490)/

D

(490)]×100%

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)所得IC，分別選擇IC的60%、70%、80%作為TSNG的作用濃度進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。以不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG 作用 24 h 后分別在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長密度、形狀、體積等細(xì)胞形態(tài)特征，并拍照。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。待細(xì)胞生長至100%，用200 μL 槍頭在每孔中做3 條平行劃痕。PBS 洗凈漂浮細(xì)胞，于倒置顯微鏡下對各組劃痕拍照。再以含2%胎牛血清培養(yǎng)基配制不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG 作用 24 h 后使用倒置顯微鏡對劃痕拍照，使用ImageJ軟件計(jì)算各組劃痕面積

S

，并按下式計(jì)算細(xì)胞相對遷移率。相對遷移率=(

S

-

S

)/

S

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。鑒于流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI 染色法是一種能準(zhǔn)確定量檢測細(xì)胞凋亡率的手段，因此為更準(zhǔn)確反映TSNG 對SiHa 細(xì)胞凋亡率的影響，本研究設(shè)置稍大作用濃度范圍，分別用0、1.0、1.2、1.4 mg/mL TSNG 作用24 h 后收集細(xì)胞。采用凋亡試劑盒進(jìn)行染色，以流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.9 Hoechst和MDC染色實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于四格玻底皿，過夜培養(yǎng)貼壁。分別以不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG作用24 h后，使用Hoechst33342工作液37 ℃避光染色20 min 后，再以MDC 染色工作液室溫避光染色20 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光顆粒的熒光強(qiáng)度和數(shù)量，以判斷細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量。

1.10 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。分別以不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG 作用24 h。同時(shí)設(shè)置HCQ 干預(yù)組，使用自噬抑制劑HCQ(10 μmol/L)提前干預(yù)4 h 后再以TSNG(1.0 mg/mL)作用24 h。收集各組細(xì)胞并提取總蛋白。經(jīng)十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入抗LC3B 抗體(1∶3 000 稀釋)，抗 p62 抗體(1∶3 000 稀釋)，抗β-actin抗體(1∶3 000 稀釋)，4 ℃過夜孵育后，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。ECL 化學(xué)發(fā)光顯影后，ImageJ 軟件分析蛋白條帶，蛋白表達(dá)水平以相對值表示。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 TSNG抑制SiHa細(xì)胞增殖

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。TSNG對SiHa細(xì)胞增殖具有抑制作用，且隨TSNG 作用濃度的增加，生長抑制率升高(

P

＜0.05)。使用SPSS 23.0 軟件對抑制率進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算得出其IC=1.322 mg/mL。

表1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度TSNG作用后SiHa細(xì)胞的吸光度值和生長抑制率(n=3，)

2.2 TSNG對細(xì)胞形態(tài)的影響

形態(tài)觀察結(jié)果見圖1?？瞻讓φ战M細(xì)胞多呈梭形，形態(tài)飽滿，數(shù)量多，輪廓清晰。TSNG 作用后細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生空泡，并且皺縮，破裂，死亡細(xì)胞逐漸增多。

2.3 TSNG抑制SiHa細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2 和圖3。作用后24 h 后，空白組劃痕面積及距離明顯減小，TSNG 作用組隨著藥物濃度的增大，劃痕面積減小程度逐漸降低。使用ImageJ 軟件分析各組處理前后劃痕面積并計(jì)算相對遷移率，0.9、1.0、1.1 mg/mL TSNG 作用組細(xì)胞相對遷移率分別為(20.40±2.49)%、(15.14±0.39)%、(5.05±1.04)%，均低于空白對照組的(36.63±2.52)% (

P

＜0.01)。

2.4 TSNG對SiHa細(xì)胞凋亡影響

細(xì)胞凋亡率檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。不同濃度(1.0、1.2、1.4 mg/mL)TSNG 作用于SiHa 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率(Q2+Q4)分別為(39.10±0.22)%，(68.37±0.58)%和(80.93±0.12)%。與空白對照組的(10.73±0.82)%相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.01)。TSNG對SiHa細(xì)胞凋亡具有明顯誘導(dǎo)作用，特別是對早期凋亡影響顯著。

圖1 TSNG作用SiHa細(xì)胞后的形態(tài)觀察(×100)

圖2 TSNG作用SiHa細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果(×50)

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TSNG作用SiHa細(xì)胞后的相對遷移率

2.5 Hoechst和MDC染色結(jié)果

Hoechst33342 和MDC 染色共染結(jié)果見圖5。相較于空白對照組，隨著TSNG 作用濃度的增加，細(xì)胞核固縮、破裂，呈致密濃染細(xì)胞數(shù)量增多。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光顆粒數(shù)量明顯增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。表明TSNG 能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和引起細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量的增加。

2.6 TSNG對SiHa細(xì)胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。與空白對照組相比，TSNG作用后SiHa細(xì)胞LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)變化不明顯，但LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)量均有明顯上升(

P

＜0.05或0.01)。為進(jìn)一步探究其可能的影響機(jī)制，使用HCQ合并TSNG 干預(yù)。相較于TSNG 作用組，HCQ 干預(yù)組LC3-Ⅱ和p62 蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明TSNG 可能作用于自噬流后期，阻礙自噬體和溶酶體的融合。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測TSNG作用SiHa細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率

圖5 Hoechst和MDC染色觀察TSNG作用SiHa細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度(×600)

3 討 論

傳統(tǒng)中藥可通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗宮頸癌作用，且有并發(fā)癥少的優(yōu)勢，具有良好的臨床應(yīng)用開發(fā)前景。皂苷類物質(zhì)作為中醫(yī)藥用植物中常見的活性物質(zhì)，可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)分化和促進(jìn)凋亡等途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSNG 對SiHa 細(xì)胞增殖和遷移表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，目的是調(diào)控發(fā)育、維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是細(xì)胞的基本生命活動(dòng)，對維持機(jī)體正常生理功能具有重要意義。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與凋亡相關(guān)蛋白p53、Bcl-2 和Bax 等的異常表達(dá)密切相關(guān)，同時(shí)宮頸癌傳統(tǒng)治療手段如放射治療和化學(xué)藥物治療等部分作用機(jī)制也與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。故而細(xì)胞凋亡途徑可作為宮頸癌治療潛在靶點(diǎn)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測TSNG 作用后的SiHa細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明，TSNG 在體外可顯著誘導(dǎo)宮頸癌SiHa 細(xì)胞凋亡，尤其是對細(xì)胞早期凋亡影響顯著。同時(shí)經(jīng)凋亡特異性染料Hoechst33342 染色觀察，TSNG 干預(yù)后細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、破裂呈致密濃染等經(jīng)典凋亡現(xiàn)象，且藥物干預(yù)濃度越大，現(xiàn)象越明顯。

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬存在著多重聯(lián)系，二者常伴隨發(fā)生，既能相互抑制，也能相互促進(jìn)。在腫瘤治療過程中，抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞生存產(chǎn)生壓力，細(xì)胞則會(huì)啟動(dòng)自噬進(jìn)行自我保護(hù)并抑制細(xì)胞凋亡。因此對細(xì)胞自噬與凋亡的相互作用研究，可能有助于尋找腫瘤治療新途徑。

圖6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)

細(xì)胞自噬對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，在腫瘤形成早期，自噬可維持基因組和染色體的穩(wěn)定從而抑制腫瘤的發(fā)生。但當(dāng)腫瘤發(fā)展至一定階段，腫瘤細(xì)胞將面臨營養(yǎng)缺乏、缺氧的微環(huán)境改變，此時(shí)自噬可通過對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)再利用，維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，幫助腫瘤細(xì)胞生存。自噬調(diào)控主要是由自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，ATGs)編碼蛋白質(zhì)完成的，現(xiàn)階段常用于自噬水平檢測的蛋白標(biāo)志物為LC3(microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3)和p62/SQSTM1(Sequestosome-1)等自噬相關(guān)蛋白。LC3 蛋白分為胞質(zhì)狀態(tài)Ⅰ型(LC3-Ⅰ)和膜結(jié)合狀態(tài)Ⅱ型(LC3-Ⅱ)，自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ存在于自噬前體和自噬體，隨自噬體膜的增多而表達(dá)量增加。因此，LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平與自噬體數(shù)量密切相關(guān)。在自噬發(fā)生過程中，自噬體的生成增加、成熟或自噬后期自噬體降解障礙均能導(dǎo)致LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的升高。p62 作為連接LC3 和泛素化底物的自噬受體蛋白，最終將被整合至自噬體中，隨后在自噬溶酶體中被酶解。通常情況下，當(dāng)自噬流被阻斷時(shí)p62 不能被正常降解，導(dǎo)致p62 表達(dá)水平上升。本研究在檢測LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，試圖通過檢測p62蛋白的表達(dá)水平來證明TSNG對細(xì)胞自噬流的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSNG 作用后細(xì)胞LC3-Ⅱ和p62 蛋白表達(dá)水平均明顯上升，TSNG 可對細(xì)胞自噬造成影響。但LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平同時(shí)上調(diào)，并非自噬發(fā)生的常規(guī)現(xiàn)象。

為進(jìn)一步研究，采用自噬抑制劑HCQ干預(yù)，進(jìn)行LC3 蛋白 turnover 實(shí)驗(yàn)。HCQ 作為常見自噬抑制劑，可作用于溶酶體蛋白酶干擾自噬體和溶酶體的融合以阻斷自噬流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCQ 干預(yù)組與TSNG作用組的LC3-Ⅱ和p62蛋白相對表達(dá)水平未見明顯差異。同時(shí)MDC 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSNG 引起細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量增加。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測TSNG 可能作用于自噬流后期，干擾自噬體和溶酶體的融合以阻斷自噬流造成自噬體降解障礙，從而導(dǎo)致LC3-Ⅱ和p62蛋白堆積。

綜上所述，本研究中TSNG 對SiHa 細(xì)胞的增殖、遷移表現(xiàn)出抑制作用，對SiHa細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用并且可阻斷細(xì)胞自噬流。但其對SiHa細(xì)胞自噬的具體影響機(jī)制以及自噬與誘導(dǎo)凋亡間相互作用仍需進(jìn)一步研究，以開發(fā)其抗宮頸癌臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值。