CDC42抑制劑CASIN對食管癌細胞活力與遷移能力的抑制作用

陳婉嫻，王思夢 ，陳張瑜 ，王潘集，鄭淳文 ，李恩民，*，許麗艷

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，廣東汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

食管癌是常見的上消化道惡性腫瘤，是全球十大惡性腫瘤之一。全世界每年約有40 余萬人死于食管癌，我國是食管癌高發(fā)國，每年約一半的食管癌新發(fā)病例在我國。食管癌患者的預(yù)后差，5 年生存率僅15%左右，主要原因是缺少抗食管癌的特異性分子靶向藥物。細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，CDC42)是小G 蛋白Rho 家族的核心成員，在與GTP 結(jié)合/活化狀態(tài)和與GDP 結(jié)合/失活狀態(tài)之間循環(huán)切換，發(fā)揮“ON/OFF”開關(guān)作用。有研究報道，CDC42與細胞分裂、細胞侵襲、細胞偽足形成和細胞極性等密切相關(guān)，在細胞惡性演進中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示從分子水平上深入研究CDC42在腫瘤細胞惡變中所扮演的角色，將有助于明確CDC42抑制劑在腫瘤治療中的作用。已知CASIN是一個靶向CDC42的小分子抑制劑，通過抑制CDC42上的鳥嘌呤核苷酸交換而發(fā)揮作用。近年來，有報道將CASIN 用于臨床過敏性氣道炎癥和哮喘的治療。隨著對CDC42在惡性腫瘤中作用機制研究的不斷深入，CASIN 用于惡性腫瘤治療的前景已被充分展現(xiàn)。故本實驗擬探討CDC42抑制劑CASIN對食管癌細胞活力與遷移的抑制作用，為將來CASIN作為新型分子靶向藥物應(yīng)用于臨床抗食管癌的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

CDC42鼠抗(Cytoskeleton公司)，Beta Actin單克隆抗體和HRP偶聯(lián)的二抗(Proteintech公司)，F(xiàn)astPfu DNA聚合酶(北京全式金公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(Biomiga 公司)，F(xiàn)lag-CDC42 質(zhì)粒(本實驗室保存，攜有氨芐霉素抗性基因，F(xiàn)lag 標簽，

CDC42

基因編碼序列全長)，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Scientific 公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，CASIN(Med ChemExpress 公司，溶解于100%DMSO 保存)，胰酶、RMPI 1640 培養(yǎng)基和 DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，細胞增殖試劑盒(Promega 公司)，OD600蛋白含量測定試劑盒(Pierce公司)，凋亡抗體試劑盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 篩選食管癌細胞模型

使用SDS 裂解液分別提取9 種食管癌細胞系TE1、TE3、KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450、KYSE510 和Colo680N 中總蛋白。100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每泳道15 μL 蛋白進行SDS-PAGE 電泳。電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，將其置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加CDC42 鼠抗(1∶250)、β-actin 單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜后，HRP 偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ECL 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，然后選用CDC42內(nèi)源性高表達和低表達食管癌細胞系各2 種，在37 ℃、CO體積分數(shù)為5%的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建GFP-CDC42重組表達載體

根據(jù)NCBI 檢索的

CDC42

基因序列和pEGFP 的多克隆酶切位點，利用Snap Gene 軟件設(shè)計PCR 引物(上游 引 物 F： 5′-CTCAGATCTCGAGCTATGCAGACAATT AAGTGTGTTGTTGT-3′；下游引物 R：5′-TCGACTG CAGAATTCTCATAGCAGCACACACCTGC-3′)。引物由天一輝遠公司合成，以Flag-CDC42 重組質(zhì)粒為模板，使用FastPfu DNA聚合酶反應(yīng)體系進行PCR擴增(擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、20 s，58 ℃、20 s，72 ℃、40 s，共循環(huán) 30 次，72 ℃延伸 5 min)，PCR產(chǎn)物經(jīng)加入Goodview染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠電泳(40 V，15 min)，在紫外觀測儀上觀察電泳結(jié)果。按照試劑盒說明書對PCR 產(chǎn)物進行純化回收。然后，先用內(nèi)切酶

Eco

R I，

Xho

I處理pEGFP-C1質(zhì)粒，再用外切酶

EXo

Ⅲ處理PCR產(chǎn)物及pEGFP-C1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入

Trans5

α感受態(tài)細胞，涂布在培養(yǎng)基上；挑取白色菌落，使用帶染料的2×Taq PCR StarMix 反應(yīng)體系進行菌落PCR 鑒定(擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、40 s，共循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min)，使用瓊脂糖電泳鑒定，方法同上；之后，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，挑選影印板上的陽性克隆菌落，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶(

Eco

R I和

Xho

I)酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，方法同上；最后送華大基因公司對重組質(zhì)粒測序，確定表達載體構(gòu)建是否成功。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染和分組

使用Lipofectamine 3000試劑進行轉(zhuǎn)染，操作方法按照說明書進行。轉(zhuǎn)染Flag-CDC42質(zhì)粒的細胞命名為Flag-CDC42 組，轉(zhuǎn)染Flag 空載體對照的細胞命名為Flag 組；轉(zhuǎn)染GFP-CDC42 質(zhì)粒的細胞命名為GFPCDC42 組，轉(zhuǎn)染GFP 空載體對照的細胞命名為GFP組。

1.5 細胞活力分析

在內(nèi)源性CDC42高/低表達組中，分別將4種食管癌細胞系(KYSE30、KYSE510、KYSE150 和 TE1)接種到96孔板中，1×10個/孔，待細胞培養(yǎng)至貼壁后，分別加入完全培養(yǎng)基和不同濃度的CASIN，實驗分為空白對照組，陰性對照組和CASIN 1.875、3.75、7.5、15、30、60 μmol/L 實驗組，處理細胞24 h。每組3個平行孔，實驗至少重復(fù)3次。

在外源性CDC42 高/低表達組中，將轉(zhuǎn)染Flag 或Flag-CDC42 的 2 種食管癌細胞系(KYSE510 和 TE1)接種到96 孔板中，1×10個/孔，待細胞培養(yǎng)至貼壁后，分別加入完全培養(yǎng)基和0、20 μmol/L的CASIN，實驗分為空白對照組，陰性對照組和20 μmol/L 的CASIN組，處理細胞24 h。每組3 個平行孔，實驗至少重復(fù)3 次。之后根據(jù)說明書，每個孔加入20 μL 的MTT 溶液(5 mg/mL)，使用Biotek EL×800 酶標儀檢測每個孔在490 nm處的吸光度，并計算細胞存活率。

細胞存活率=[

D

(490)-

D

(490)]/[

D

(490)-

D

(490)]×100%

1.6 劃痕實驗

在內(nèi)源性CDC42高/低表達組中，將上述4種食管癌細胞系接種至12 孔板中，3.5×10個/孔，貼壁后饑餓12 h，用200 μL 槍頭尖端進行劃痕，分別加入0、15和30 μmol/L的CASIN，處理細胞24 h后，拍照。

在外源性CDC42 高/低表達組中，將轉(zhuǎn)染Flag 或Flag-CDC42 的2 種食管癌細胞系接種接種至12 孔板中，3.5×10個/孔，貼壁后饑餓12 h，用200 μL槍頭尖端進行劃痕，分別加入0和20 μmol/L的CASIN，處理細胞24 h后，拍照。

在指定區(qū)域顯微成像，用ImageJ 軟件分析創(chuàng)面愈合情況。重復(fù)3次實驗。計算愈合率。

愈合率=(劃痕初始面積-培養(yǎng)后的劃痕面積)/劃痕初始面積×100%

1.7 Western blot 檢測 Caspase-3 和 PARP 蛋白表達情況

在內(nèi)源性CDC42 高/低表達組中，細胞用CASIN抑制劑處理24 h后，經(jīng)SDS裂解液裂解，提取細胞蛋白，并使用OD600 蛋白試劑盒檢測蛋白含量。Western blot 操作方法按說明書進行。蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，將其置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加PARP 抗體(1∶2 000)、Caspase-3 抗體(1：1 000)、Beta-Actin 單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，HRP偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ECL顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.8 免疫熒光檢測細胞偽足的形成

在外源性CDC42 高/低表達組中，將轉(zhuǎn)染pEGFP或pEGFP-CDC42 的2 種食管癌細胞系(KYSE30 和KYSE150)接種至 12 孔板中，3.5×10個/孔，待細胞培養(yǎng)至貼壁后，加入CASIN(KYSE30 細胞系采用0 和15 μmol/L的CASIN；KYSE150細胞系采用0和20 μmol/L的CASIN)，處理細胞24 h。取出培養(yǎng)板后，用PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100通透30 s，再用25 μg/mL熒光素標記鬼筆環(huán)肽(Actinstain555 Fluorescent Phalloidin)染色 40 min，PBS 洗3次，封片，蔡司800共聚焦顯微鏡下拍照成像。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)源性CDC42 蛋白高、低表達食管癌細胞模型的篩選結(jié)果

Western blot 檢測結(jié)果見圖1，CDC42 蛋白在不同食管癌細胞系中表達存在明顯的差異?；诖耍瑥闹羞x擇KYSE30和KYSE510(CDC42內(nèi)源性高表達)，以及KYSE150和TE1(CDC42內(nèi)源性低表達)共4種細胞進行后續(xù)的實驗研究。

圖1 Western blot檢測CDC42蛋白在9種不同食管癌細胞系中的表達

2.2 CASIN影響內(nèi)源性高/低表達CDC42食管癌細胞的活力和遷移能力

CASIN 對上述4 種食管癌細胞系細胞活力的影響見圖 2A～D。與對照組(即 CASIN 濃度為 0 μmol/L)比較，當(dāng)CASIN為低濃度(0～7.5 μmol/L)時，細胞的活力 不 降 反 升 (

P

＜0.05)； 而 當(dāng) CASIN 為 高 濃 度 (15～60 μmol/L)時，細胞的活力顯著降低(

P

＜0.05)?；诒疚牡难芯磕繕?，將CASIN 的濃度設(shè)置在較高的15～30 μmol/L，以此開展后續(xù)的研究。隨后，通過劃痕實驗(圖2E～H)發(fā)現(xiàn)，處理24 h 后，與對照組相比，15 μmol/L CASIN，可明顯抑制KYSE150、KYSE510和TE1 這3 種食管癌細胞的遷移能力(

P

＜0.05)；對于KYSE30食管癌細胞，15 μmol/L的CASIN雖然也抑制其遷移能力，但差異不顯著，說明不同的食管癌細胞對于CASIN 的抑制作用不同。30 μmol/L 的CASIN，對于 KYSE150、KYSE510、TE1 和 KYSE30 這 4 種食管癌細胞，抑制效果較15 mol/L 時均明顯增強(

P

＜0.01)。

圖2 細胞活力分析和劃痕實驗結(jié)果(n=3，)

2.3 CASIN誘導(dǎo)內(nèi)源性高/低表達CDC42的食管癌細胞發(fā)生細胞凋亡

圖3 CASIN 誘導(dǎo)食管癌細胞Caspase-3 高表達及促進PARP 蛋白裂解的Western blot檢測結(jié)果

Western blot 檢測結(jié)果見圖3?？梢?，與對照組(0 μmol/L的CASIN)比較，15和30 μmol/L的CASIN均可以明顯促進食管癌細胞(KYSE150和KYSE30)凋亡酶Caspase-3 高表達，同時顯著促進了Caspase-3 底物蛋白PARP 的裂解。由此，推測CASIN 可能通過激活凋亡酶Caspase-3的表達，促進其底物蛋白PARP裂解的細胞信號通路，誘導(dǎo)食管癌細胞發(fā)生凋亡，抑制食管癌細胞的活力和遷移能力。

2.4 GFP-CDC42重組表達載體成功構(gòu)建

擴增的CDC42 片段經(jīng)回收后，與pEGFP 載體連接，獲得的重組質(zhì)粒pEGFP-CDC42經(jīng)

Eco

R I和

Xho

I雙酶切鑒定，結(jié)果提示(圖4A)，重組表達載體中外源片段的長度(576 bp)同理論CDC42編碼區(qū)的長度一致，表明已成功構(gòu)建重組表達載體pEGFP-CDC42。測序結(jié)果(圖4B)亦顯示擴增序列與GenBank中的完全一致。

圖4 GFP-CDC42重組表達載體成功構(gòu)建

2.5 CASIN抑制外源性CDC42高表達食管癌細胞的活力和遷移能力

從圖5 可見，與對照組(0 μmol/L 的CASIN)相比，20 μmol/L的CASIN作用后，2種食管癌細胞的活力和遷移能力均被顯著抑制(

P

＜0.05)。此外，從圖5A、5B和5F可見，當(dāng)CASIN濃度為0時，與轉(zhuǎn)染Flag質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染Flag-CDC42質(zhì)粒組細胞的活力和遷移能力可以明顯增加(

P

＜0.05)；而用20 μmol/L的CASIN處理24 h后，可以削弱CDC42對細胞活力和遷移能力的增強作用(

P

＜0.05)。

圖5 CASIN抑制外源性CDC42高表達食管癌細胞活力和遷移能力的檢測結(jié)果(n=3，)

2.6 CASIN影響外源性CDC42高表達食管癌細胞偽足的形成

本研究成功構(gòu)建pEGFP-CDC42 綠色熒光標簽表達載體后，將其轉(zhuǎn)染至KYSE150 和KYSE30 食管癌細胞中，利用細胞免疫熒光實驗觀察(圖6)發(fā)現(xiàn)，與GFP對照組相比，GFP-CDC42 組細胞的偽足數(shù)量增多，偽 足的長度變長；與此同時，用15 或20 μmol/L 的CASIN處理24 h，可使CDC42高表達食管癌細胞偽足變多變長的效果被明顯抵消。

圖6 CASIN影響外源性CDC42高表達食管癌細胞偽足形成的免疫熒光實驗觀察結(jié)果(×40)

3 討 論

迄今為止，同步放化療依然是局部晚期不可手術(shù)切除食管癌的標準治療方法。但是，放化療的非選擇性與毒副作用嚴重影響著患者的預(yù)后。相比較而言，分子靶向藥物可以選擇性地作用于與腫瘤細胞相關(guān)的靶點分子，相應(yīng)地減少毒性反應(yīng)，因此，可以明顯提高療效?；诖耍狙芯恳晕覈l(fā)病率高且缺少分子靶向藥物的食管癌為研究對象，以CDC42為分子靶點，采用CDC42抑制劑CASIN，探究其對食管癌細胞的抑制作用，為將CASIN最終開發(fā)成抗食管癌的分子靶向藥物奠定實驗基礎(chǔ)。

首先，本研究采用細胞活力實驗和劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)，給予一定濃度(15～30 μmol/L)的CASIN，能夠明顯抑制食管癌細胞的活力和遷移能力。其次，為了明確CDC42表達能夠增強食管癌細胞的活力和遷移能力，進一步構(gòu)建了外源性CDC42高表達的食管癌細胞模型；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDC42高表達的確可以顯著增強食管癌細胞的活力和遷移能力。此外，CDC42外源性高表達的食管癌細胞，其受到CASIN 抑制作用的程度，明顯強于CDC42低表達的對照組食管癌細胞。由此可見，CDC42在食管癌細胞的惡性演進中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而CDC42抑制劑CASIN被開發(fā)成用于治療食管癌的分子靶向藥物有現(xiàn)實的研究價值。

已知CDC42是重要的細胞信號網(wǎng)絡(luò)開關(guān)，研究確定CASIN抑制食管癌細胞活力和遷移能力的分子作用機制，可在理論上解釋CASIN 可抑制食管癌的增殖。近年有關(guān)肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤的研究報道提示，CDC42 的作用與抗腫瘤細胞凋亡有密切關(guān)系?；诖?，結(jié)合本文所獲得的實驗結(jié)果推測，給予一定濃度的CASIN處理食管癌細胞，阻斷細胞的CDC42激活信號，抑制CDC42 的激活，最終可引起Caspase-3 表達增加，裂解PARP，可能誘導(dǎo)了食管癌細胞發(fā)生凋亡。與此同時，在實驗中還發(fā)現(xiàn)，CDC42高表達能夠促進食管癌細胞的偽足明顯變多變長，表明CDC42有促進食管癌細胞偽足形成的作用，而CASIN 可使CDC42 高表達的食管癌細胞偽足形成的作用被明顯削弱。

綜上，一定濃度(15～30 μmol/L)的CASIN 可阻斷食管癌細胞CDC42信號激活，使細胞的活力和遷移能力明顯下降，抑制細胞偽足的形成，并最終可能誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。CDC42是一種有潛力的食管癌分子靶點，其抑制劑CASIN有望被研究開發(fā)成一種新型的抗食管癌的分子靶向藥物。