異鼠李素通過減輕氧化應(yīng)激延緩D-半乳糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老

蔣 杉，杜 鳳，康秉文，殷草草，周 健，石 瑩，王 玥，周耿瑤，秦緒軍，*

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系，軍隊(duì)健康教育與管理教研室，陜西 西安 710032；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

在全球范圍內(nèi)，老年人(65 歲或以上)的比例正在上升，老年人口成為了增長最快的年齡組。根據(jù)聯(lián)合國2019 年報(bào)告的數(shù)據(jù)，2019 年全球人口中每11 人中就有1人超過了65歲，到2050年，這一比例將增加到每6人中有1人是65歲以上的老年人。老齡化人口的數(shù)量逐漸增多，勢必給社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。如果能延緩老年人的衰老程度，減少老年人疾病的發(fā)生，提高老年人的生活質(zhì)量，就能在一定程度上緩解人口老齡化帶來的社會負(fù)擔(dān)。因此，迫切需要深入了解衰老進(jìn)程及機(jī)制，并尋找有效的抗衰老干預(yù)措施。

異鼠李素(isorhamnetin，ISO)是黃酮類化合物中一種含量較豐富的O-甲基化黃酮醇，普遍存在于沙棘、銀杏等植物中。由于其具有多種生物和藥理性質(zhì)，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、抗缺血再灌注損傷，以及內(nèi)皮功能障礙和神經(jīng)退行性損傷的保護(hù)作用等，ISO的應(yīng)用前景已獲得廣泛的關(guān)注。然而，ISO是否具有抗衰老作用，目前尚未見明確報(bào)道。本研究通過D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)建立衰老細(xì)胞模型，探討ISO的抗衰老作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

紫外線超凈臺(江蘇蘇凈安泰)；CKX41 倒置顯微鏡(日本Olympus)；二氧化碳孵育箱(美國Thermo)；5424R 高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)；臺式低速離心機(jī)(陜西環(huán)宇)；Infinite200 PRO 全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)；蛋白電泳儀、Trans Blot Turbo蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 主要試劑

異鼠李素(美國Target Mol，純度≥98%，批號T2836)；DMEM 高糖液體培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素溶液(上海源培)；BCA 蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence associated βgalactosidase，SA-β-Gal)染色試劑盒(上海碧云天)；CCK-8 試劑盒(上海漢恒)；2′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2, 7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFHDA) 熒光探針、 總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT) 活 性 試 劑 盒 ( 上 海 碧 云 天)； 丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(江蘇凱基)；GAPDH 兔抗單克隆抗體、p27鼠抗單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)；p21、核因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)兔抗單克隆抗體(武漢三鷹)；CAT、 SOD1、 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 1(glutathione peroxidase 1，GPX1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基(glutamate cysteine ligase modifier subunits，GCLM)兔抗單克隆抗體、SOD2 鼠抗單克隆抗體(美國Santa Cruz)；谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic subunits，GCLC)兔抗單克隆抗體(南京巴傲德)；血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)兔抗單克隆抗體(英國Abcam)。

1.3 方 法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將HUVEC 在添加了10%FBS，1%谷氨酰胺和1%青/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中于CO體積分?jǐn)?shù)為5%和37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取第20～23代的HUVEC置于含有不同濃度ISO(0～80 μmol/L)的DMEM中孵育72 h，觀察ISO對細(xì)胞活力的影響。然后，將HUVEC分別與5、10 μmol/L ISO在10 g/L D-Gal存在下孵育72 h，分為：對照組，正常培養(yǎng)的HUVEC；D-Gal 處理組，10 g/L D-Gal 處理72 h；2 個(gè) ISO 干預(yù)組(D-Gal+ISO)，即 10 g/L D-Gal處理，同時(shí)分別用5或10 μmol/L ISO共培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3.2 CCK-8法測定細(xì)胞活力

細(xì)胞按每孔5×10個(gè)接種在96 孔板上，加入不同濃度的ISO(0、5、10、20、40、80 μmol/L)，在CO體積分?jǐn)?shù)為5%和37 ℃條件下孵育72 h。更換培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 新鮮DMEM和10 μL CCK-8試劑，并在CO體積分?jǐn)?shù)為5%，37 ℃條件下繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀測定

D

(450)值并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.3 SA-β-Gal 染色

使用 SA-β-Gal 染色試劑盒進(jìn)行HUVEC的SA-β-Gal染色。首先將細(xì)胞固定，然后在37 ℃(無CO)下用SA-β-Gal 染色溶液染色24 h。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞并成像。

1.3.4 MDA含量、SOD和CAT活性測定

用裂解液充分裂解各組處理后的細(xì)胞，12 000 g 離心20 min，收集上清并測量上清中的MDA含量。另將上清液稀釋3～4 倍，用于檢測SOD 和CAT 活性。具體步驟嚴(yán)格按照MDA、SOD和CAT試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3.5 細(xì)胞總活性氧水平的測量

使用測定試劑盒測量細(xì)胞總活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。將處理的各組細(xì)胞與DCFH-DA在37 ℃避光孵育30 min，用PBS 洗滌3 次，去除細(xì)胞外的熒光染料。用酶標(biāo)儀測量平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.3.6 Western blot 檢測分析

將HUVEC 在含有50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)，150 mmol/L NaCl，1%脫氧膽酸鈉，1% NP-40、1 mmol/L 苯基甲基磺酰氟和1 mmol/L 乙二胺四乙酸的RIPA 裂解液中裂解。使用BCA蛋白定量試劑盒測量上清液中總蛋白質(zhì)含量。細(xì)胞裂解物上清液通過SDS-PAGE 分離，并電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉2 h，并與相應(yīng)一抗在4 ℃孵育過夜。第2 天用TBST 將PVDF 膜洗滌3 次，每次5 min，然后與二抗一起在室溫下孵育2 h。用 TBST 洗滌 4 次后，將發(fā)光液 A 和 B 按 1∶1 混合后均勻滴于PVDF 膜上，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用Bio-Rad Quantity One軟件對條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ISO對HUVEC活力的影響

圖 1 結(jié)果表明，當(dāng) ISO 在濃度≥20 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低。因此，后續(xù)使用5 和10 μmol/L 的ISO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度的ISO處理后對HUVEC活力的影響

2.2 ISO對D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC衰老的影響

圖2 ISO對D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC衰老的影響

ISO 對D-Gal 誘導(dǎo)的HUVEC 衰老的影響見圖2。與對照組比較，D-Gal處理72 h引起HUVEC中β-Gal染色顯著增加。不同濃度的ISO(5和10 μmol/L)均能顯著降低由D-Gal 引起的β-Gal 陽性染色。與對照組比較，D-Gal 處理后p21、p27蛋白表達(dá)水平較對照組顯著升高(

P

＜0.05)；與D-Gal 處理組比較，ISO 顯著抑制p21 和p27 的蛋白表達(dá)水平(

P

＜0.05)。細(xì)胞周期抑制蛋白p21、p27表達(dá)增加被認(rèn)為是衰老的分子標(biāo)志。這些結(jié)果表明，ISO可以減輕D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC衰老。

2.3 ISO 對 D-Gal 誘導(dǎo)的 HUVEC 總 ROS 與 MDA 水平的影響

ISO 對 D-Gal 誘導(dǎo)的 HUVEC 總 ROS 與 MDA 水平的影響如圖3 所示。與對照組相比，D-Gal 組HUVEC中總 ROS 和 MDA 水平均升高(

P

＜0.05)；與 D-Gal 組比較，ISO處理后ROS和MDA水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。這些結(jié)果表明，ISO 能夠抑制DGal 誘導(dǎo)的細(xì)胞總ROS 和MDA 水平，從而減輕D-Gal誘導(dǎo)的衰老。

圖3 ISO對D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC的總ROS與MDA水平的影響

2.4 ISO 對D-Gal 誘導(dǎo)的HUVEC 抗氧化酶活性的影響

圖4 ISO素對D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC抗氧化酶活性的影響

ISO 對D-Gal 誘導(dǎo)的HUVEC 抗氧化酶活性的影響如圖4所示。與對照組相比，D-Gal 處理的HUVEC 中SOD和CAT活性顯著降低(

P

＜0.05)；與D-Gal處理組比較，當(dāng)與ISO 共培養(yǎng)時(shí)，這些抗氧化酶的活性均有不同程度的恢復(fù)(

P

＜0.05)。結(jié)果表明，ISO 可以提高HUVEC 中的抗氧化酶活性，從而緩解氧化應(yīng)激。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，D-Gal 組和對照組SOD 活性絕對值差別不大，這可能是由于HUVEC 的抗氧化系統(tǒng)在DGal組中并未完全崩潰，D-Gal導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的ROS仍然多于抗氧化防御系統(tǒng)清除的ROS。而ISO 處理組既減少了ROS 的產(chǎn)生，又提高了抗氧化系統(tǒng)的防御能力，因此，有較大的升高。

2.5 ISO對D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC中Nrf2及其下游蛋白的影響

ISO 對 D-Gal 誘導(dǎo)的 HUVEC 中 Nrf2 及其下游蛋白的影響如圖5 所示。與對照組相比，經(jīng)D-Gal 處理的HUVEC 細(xì)胞中核內(nèi) Nrf2 水平降低(

P

＜0.05)，GCLM、GCLC、HO-1、SOD1、SOD2、CAT、GPX1 等下游蛋白表達(dá)水平均降低(

P

＜0.05)，表明Nrf2通路在D-Gal處理后受到抑制。與D-Gal 處理組比較，ISO 能夠顯著提高核內(nèi)Nrf2 及其下游蛋白的表達(dá)水平(

P

＜0.05)。這些結(jié)果表明，ISO 能夠激活Nrf2 通路并提高細(xì)胞抗氧化能力，可能是ISO 發(fā)揮上述抗氧化、抗衰老的重要機(jī)制之一。

3 討 論

衰老是生命進(jìn)程中的一種生理狀態(tài)，并受多種內(nèi)外環(huán)境影響。細(xì)胞周期停滯是衰老的重要特征。已有研究表明，D-Gal 可以引起類似于衰老的生理狀態(tài)改變。D-Gal 誘導(dǎo)衰老模型應(yīng)用廣泛，具有操作方便，副作用少，細(xì)胞生存率較高等優(yōu)勢，被認(rèn)為是衰老研究的有效工具。本研究中采用10 g/L的D-Gal處理HUVEC 72 h 可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞SA-β-Gal 活性增加和細(xì)胞周期相關(guān)衰老標(biāo)志蛋白p21 和p27 水平增加，表明細(xì)胞衰老模型的成功建立。已有研究報(bào)道ISO 對多種疾病均有治療作用，而ISO 對衰老的作用卻鮮見報(bào)道。朱棟良等在研究中發(fā)現(xiàn)，ISO通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老來抑制腫瘤的增殖和生長。然而，ISO 對正常細(xì)胞衰老的影響還未見報(bào)道。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ISO能夠顯著抑制D-Gal誘導(dǎo)的SA-β-Gal活性及衰老相關(guān)蛋白p21、p27水平的增加，表明ISO具有抗細(xì)胞衰老作用。

圖5 ISO對D-Gal誘導(dǎo)的HUVEC的Nrf2及其下游蛋白的影響

細(xì)胞衰老可受多種因素影響，其中一個(gè)重要因素就是氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)。OS是指ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)清除ROS之間的不平衡。OS能夠引起細(xì)胞大分子包括脂質(zhì)、膜、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，在D-Gal誘導(dǎo)HUVEC 衰老過程中，ROS 和氧化損傷產(chǎn)物MDA水平均升高，而總SOD和CAT活性均下降，抗氧化防御系統(tǒng)清除ROS的能力降低。而ISO能夠顯著改善DGal造成的OS，表現(xiàn)為ROS和MDA水平降低，總SOD和CAT 活性升高。以上結(jié)果表明ISO 可能是通過減輕OS來抗衰老。

Nrf2 通路由Kelch like-ECH 相關(guān)蛋白1(Kelchlike ECH-associated protein-1，Keap1)、下游 II 期解毒酶和抗氧化酶組成。在正常情況下，Nrf2 與Keap1結(jié)合并停留在細(xì)胞質(zhì)中。在OS作用下，Nrf2與Keap1解離并移至核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，從而直接調(diào)控其下游的抗氧化酶和解毒酶的轉(zhuǎn)錄。GCLC 和GCLM 是谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)的重要組成部分，它們可以調(diào)節(jié)谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成速率。GSH 是GPX 將氫過氧化物還原為相應(yīng)醇的重要還原劑，可以提高GPX 活性，緩解OS。血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)可以通過產(chǎn)生一氧化碳來提高SOD活性，使氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，HO-1還可以減弱內(nèi)毒素對CAT活性的影響，促使過氧化氫分解成氧和水，從而發(fā)揮抗氧化作用。Nrf2 通路的激活增強(qiáng)了細(xì)胞清除ROS 和應(yīng)對OS 的能力，是保護(hù)細(xì)胞免受OS 侵襲的重要抗氧化防御機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，DGal 處理能夠抑制核內(nèi)Nrf2 及其下游蛋白HO-1、GCLC、GCLM、SOD1、SOD2、CAT、GPX1 的表達(dá)水平，而ISO 可以提高核內(nèi)Nrf2 及其下游蛋白的表達(dá)水平。這些結(jié)果進(jìn)一步表明ISO 可能是通過激活Nrf2 通路，減輕了OS，從而延緩了衰老。

綜上所述，本研究采用D-Gal誘導(dǎo)HUVEC建立細(xì)胞衰老模型，發(fā)現(xiàn)ISO 可以顯著提高細(xì)胞抗氧化的能力，緩解D-Gal 引起的OS，延緩細(xì)胞衰老，而激活Nrf2通路可能是其中重要的機(jī)制。該結(jié)果為深入研究ISO 抗衰老作用以及進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。