MRI表觀彌散系數(shù)預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

黃夢(mèng)琪，宋晨宇，林映宇，馮仕庭，彭振鵬

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射診斷專(zhuān)科，廣東廣州 510058）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5 年生存率低［1-2］。免疫治療尤其是PD1/PDL1 為主的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在中晚期HCC 治療中發(fā)揮巨大潛能［3］。然而，HCC 免疫檢查點(diǎn)抑制劑的總客觀緩解率約22.7%，由副作用引起的治療中斷14.9%［4］，治療過(guò)程中出現(xiàn)進(jìn)展的約30%［5］。肝臟免疫耐受環(huán)境及慢性炎癥所致的免疫抑制微環(huán)境，是治療無(wú)效或耐藥的主要原因［6］。尋找一種準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)免疫微環(huán)境的方法，對(duì)免疫治療決策、監(jiān)測(cè)和預(yù)后預(yù)測(cè)至關(guān)重要。MRI 彌散成像（diffusion weighted imaging，DWI）針對(duì)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)成像，可反映腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)、血管和微結(jié)構(gòu)等，能重點(diǎn)表征腫瘤微結(jié)構(gòu)的不均質(zhì)特性［7］。因此DWI 被廣泛用于評(píng)估腫瘤侵襲性、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后等［8］。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究采用DWI 評(píng)估腫瘤及瘤周組織免疫浸潤(rùn)微環(huán)境。本研究針對(duì)PD1/PD-L1免疫治療，嘗試用MRI表觀彌散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）評(píng)估腫瘤及瘤周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

納 入2020 年10 月25 日 至2020 年12 月5 日 在我院接受手術(shù)切除治療的HCC 初治患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷為HCC 的患者；行手術(shù)切除治療者；術(shù)前2 周內(nèi)行上腹部釓塞酸二鈉增強(qiáng)MRI 及DWI檢查者。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為非HCC 者；MRI 圖像質(zhì)量差、臨床實(shí)驗(yàn)室資料不齊全者；在滿足患者后續(xù)醫(yī)療檢查所需樣品后，所剩術(shù)后取材樣品不足以用于流式細(xì)胞分析者。本次研究共納入HCC 患者24例，其中男性23例，女性1例，年齡范圍為28～68 歲，平均年齡51.5 歲。本研究經(jīng)過(guò)本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)申報(bào)（倫理號(hào)：IIT-2021-168），入組患者已簽署知情同意書(shū)。

1.2 磁共振檢查方法

采用3.0 T 磁共振掃描儀（MAGNETOM Prisma，西門(mén)子）及18 通道體線圈、仰臥位、足先進(jìn)掃描，檢查前4 h 禁食。彌散成像（序列名ep2d_diff_DKI）的掃描參數(shù)包括：軸位掃描，視野（FOV）380 mm×380 mm，層厚6.0 mm，TR 3 500 ms，TE 47.0 ms，體素大小1.4 mm×1.4 mm×6.0 mm，帶寬2 488 Hz/Px，壓脂方式SPAIR，PAT 并行采集加速因子2個(gè)，彌散方向3個(gè)。參考Sung等［9］的研究方法，DWI成像b 值設(shè)置4 個(gè)，分別為0，50，400，800 s/mm2，低b 值用于去除血管內(nèi)的血液高信號(hào)，高b 值用于產(chǎn)生擴(kuò)散對(duì)比；ADC值由兩個(gè)高低不同b值的圖像計(jì)算得出，本研究參考Sung 等［9］的研究方法，自動(dòng)導(dǎo)出ADC圖（b=0，800 s/mm2）用于測(cè)量ADC值。

1.3 磁共振圖像分析

圖像采集完成后，由兩名受培訓(xùn)的影像醫(yī)師先后進(jìn)行ADC 值測(cè)量，選取腫瘤的最大層面，在ADC圖上分別勾畫(huà)腫瘤和切緣方向的腫瘤旁組織（距腫瘤＜2 cm），腫瘤的感興趣區(qū)盡可能的包括腫瘤組織，腫瘤旁的感興趣區(qū)應(yīng)避開(kāi)血管等結(jié)構(gòu)（圖1）。記錄腫瘤的ADC 值，腫瘤旁組織的ADC 值（pADC）并計(jì)算相對(duì)ADC值（rADC）。rADC的計(jì)算算式為：

1.4 流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)方法

圖1 表觀彌散系數(shù)圖及感興趣區(qū)勾畫(huà)Fig.1 Apparent diffusion coefficient mapping and the region of interest

1.4.1 取 材 在患者手術(shù)切除術(shù)后標(biāo)本離體30 min 內(nèi)收集新鮮腫瘤及肝臟樣品，取無(wú)壞死區(qū)的腫瘤組織約1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm，取切緣方向腫瘤旁（距腫瘤＜2.0 cm）有活性肝組織約1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm，組織塊離體后置于1640 培養(yǎng)基中，4 ℃保存轉(zhuǎn)運(yùn)。

1.4.2 主要試劑 膠原酶I 型（翊圣）、膠原酶Ⅳ型（翊圣）、分散酶Ⅱ型（翊圣）、DNA 酶（Solarbo）、HBSS（HyClone）、紅細(xì)胞裂解液（Servico）、抗人CD45（BV510，Biolegend）、抗人CD3（FITC，Tonbo-Bioscience）、抗人CD19（APC/FireTM750，Biolegend）、抗 人CD4（PerCP-Cy5.5，TonboBioscience）、抗 人CD8（BV650，BD）、抗人CD14（PE/Cy7，Biolegend）、抗 人68（PE，Biolegend）、抗 人CD279（PD-1）（BV412TM，Biolegend）、抗人CD25（APC，TonboBioscience）、抗人Foxp3（PE，eBioscience），F(xiàn)oxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液（eBioscience）。

1.4.3 單細(xì)胞懸液制備 新鮮組織離體后，盡量1 h 內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。倒掉培養(yǎng)基，取組織塊于6 cm培養(yǎng)皿上，將腫瘤組織剪碎（直徑＜1 mm），加入適量消化酶，于15 mL離心管內(nèi)，37 ℃水浴消化30 min。消化結(jié)束后過(guò)70μm網(wǎng)篩過(guò)濾，在4 ℃、400×g條件下，離心5 min 收集沉淀。用2 mL 紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心收集沉淀。

1.4.4 多色流式細(xì)胞分析 細(xì)胞沉淀用6 mL PBS垂懸成單細(xì)胞懸液，每份樣品平均分成3 管。3 號(hào)管為空白對(duì)照管，1 號(hào)管加入抗體抗人CD45、CD19、CD3、CD4、CD8、PD-1和CD14各0.5μL，2號(hào)管加入抗人CD3、CD4 和CD25 抗體各0.5μL，充分混勻，于室溫避光孵育20 min。加2 mL PBS 并以400×g速度離心5 min，棄上清液，加2 mL PBS垂懸細(xì)胞，在4 ℃、400 ×g條件下離心5 min 后棄上清液。

每管加入0.8 mL 1×固定破膜劑，避光孵育40 min。加2 mL 緩沖液后在4 ℃、400×g條件下離心5 min，棄上清液，加2 mL 緩沖液離心1次后棄上清液。1號(hào)管加入抗人CD68抗體0.5μL/管，2號(hào)管加入抗人Foxp3 抗體0.5 μL/管，充分混勻，室溫避光孵育40 min。加2 mL 緩沖液并在4 ℃、400×g條件下離心5 min，棄上清液，再次加2 mL 緩沖液混懸細(xì)胞，在4 ℃、400 ×g條件下離心5 min 收集沉淀，用0.5 mL緩沖液再混懸細(xì)胞。

用流式細(xì)胞分析儀（CytoFLEX，貝克曼庫(kù)爾特，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)，用CytExpert 軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，建立FSC/SSC，每管獲取10 000 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)同型對(duì)照分析，檢測(cè)細(xì)胞的類(lèi)型和比率情況。分別計(jì)算CD45+炎性細(xì)胞/總顆粒數(shù)（CD45+炎性細(xì)胞比率）、CD3+T 細(xì)胞/CD45+炎性細(xì)胞數(shù)（CD3+T 細(xì)胞比率）、CD19+B 細(xì)胞/CD45+炎性細(xì)胞數(shù)（CD19+B 細(xì)胞比率）、CD4+T 細(xì)胞/CD3+T 細(xì)胞數(shù)（CD4+輔助T 細(xì)胞比率）、CD8+T 細(xì)胞/CD3+T 細(xì)胞數(shù)（CD8+效應(yīng)T 細(xì)胞比率）、CD8+PD1+細(xì)胞/CD8+T 細(xì)胞數(shù)（CD8+PD1+比率）、CD8＋PD1+細(xì)胞/CD3+T 細(xì)胞數(shù)（PD1＋效應(yīng)T 細(xì)胞比率，PD1+Tc比率）、巨噬細(xì)胞/CD45+炎性細(xì)胞數(shù)（巨噬細(xì)胞比率，Mac）、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞/CD3+T 細(xì)胞數(shù)（調(diào)節(jié)T細(xì)胞比率，Treg；圖2）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0、R 語(yǔ)言、GraphPad Prism 9 等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制，連續(xù)性變量以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表述，分類(lèi)變量以頻數(shù)表示，分類(lèi)變量及有序多分類(lèi)變量組間比較采用Fisher 精確檢驗(yàn)。連續(xù)性變量先經(jīng)過(guò)Schapiro-Wilkes 正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)或曼-惠特尼檢驗(yàn)，觀察者間的一致性用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（interclass correlation coefficient，ICC）分析，連續(xù)性變量采用Pearson’s 相關(guān)分析，P＜0.05 表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究24 例HCC 患者，處于HBV 病毒復(fù)制活躍期16 例，HBV 病毒復(fù)制數(shù)＜100 U/mL 者8 例，余描述性參數(shù)具體情況如表1所示。

2.1 瘤內(nèi)與瘤旁肝組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況

腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，絕大多數(shù)為CD3+T 細(xì)胞（占CD45+炎性細(xì)胞的比例約70.98%），其次為巨噬細(xì)胞（占CD45+炎性細(xì)胞的比例約4.80%），再次為CD19+B 細(xì)胞（占CD45+炎性細(xì)胞的比例約3.48%）。CD3+T 細(xì)胞中CD8+T 細(xì)胞多于CD4+T 細(xì)胞（約36.79%vs.10.46%，P＜0.001），CD8+T細(xì)胞約46.22%呈現(xiàn)PD1高表達(dá)，余為中或低表達(dá)（表2）。通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)比對(duì)腫瘤以及瘤旁肝組織各類(lèi)型免疫細(xì)胞數(shù)量（表2），結(jié)果顯示腫瘤內(nèi)CD45+炎性細(xì)胞比率明顯低于腫瘤旁肝組織（18.39%vs.25.38%，P=0.026），其中瘤內(nèi)CD8+PD 1+T 細(xì)胞占比明顯增多（46.22%vs.18.78%，P＜0.001），此外，瘤內(nèi)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的比率明顯高于瘤旁肝組織（3.29%vs.2.01%，P=0.010）。

2.2 MRI ADC值測(cè)量的一致性

兩位醫(yī)生先后獨(dú)立地對(duì)ADC 值進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示rADC 值、ADC 值及pADC 值等測(cè)量值在兩位醫(yī)生之間都取得了良好的一致性（表3）。

表1 患者基線數(shù)據(jù)比對(duì)表Table1 Descriptive data of enrolled patients ［n，（）］

表1 患者基線數(shù)據(jù)比對(duì)表Table1 Descriptive data of enrolled patients ［n，（）］

HBV DNA-：the copy number of hepatitis B virus＜100 U/mL；HBV DNA+：the copy number of hepatitis B virus ≥100 U/mL；AFP：alpha foetoprotein；MVI：microvascular invasion

圖2 多色流式細(xì)胞分析術(shù)分析流程圖Fig.2 The analysis of multi-color flow cytometry

2.3 MRI ADC值與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比率的相關(guān)性分析

Pearson’s 相關(guān)性分析結(jié)果提示ADC 與多個(gè)類(lèi)型的免疫細(xì)胞比率具有相關(guān)性（表4，圖3）。rADC與瘤內(nèi)的CD4+T 細(xì)胞比率成正相關(guān)（r＝0.523，P＝0.009），腫瘤彌散受限程度越重，腫瘤內(nèi)輔助T細(xì)胞比率越低。rADC 值與瘤旁肝組織的PD1+Tc 細(xì)胞比率亦呈正相關(guān)（r＝0.535，P＝0.007），間接顯示肝組織彌散受限程度越重，rADC 值越高，肝組織的pPD1+Tc比率越高（圖4）。

腫瘤ADC 值與瘤旁肝組織CD19+B 細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.476，P＝0.019），ADC值越低，腫瘤彌散受限程度越重，瘤旁肝組織CD19+B 細(xì)胞數(shù)量越多（圖4）。

表2 腫瘤與癌旁組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比率對(duì)比分析Table 2 Comparative analysis of the immune cells infiltration in tumor and peritumor ［，%，（n=24）］

表2 腫瘤與癌旁組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比率對(duì)比分析Table 2 Comparative analysis of the immune cells infiltration in tumor and peritumor ［，%，（n=24）］

1）P＜0.05；2）P＜0.001；Mac：macrophage

pADC 值與瘤內(nèi)PD1＋Tc 細(xì)胞浸潤(rùn)比率呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.410，P＝0.047），pADC 值越低，肝組織彌散受限程度越嚴(yán)重，肝硬化程度越嚴(yán)重，腫瘤內(nèi)PD1＋Tc 細(xì)胞越高，腫瘤免疫抑制微環(huán)境情況越重（圖4）。

3 討論

圖3 MRI表觀彌散系數(shù)與腫瘤、腫瘤旁免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比率的Pearson’s相關(guān)分析Fig.3 The Pearson’s correlation analysis of the ADC with the immune cell percentage of the tumor and peritumoral area

免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HCC 腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，絕大多數(shù)為CD3+T 細(xì)胞，CD3+T 細(xì)胞中以CD8+T 細(xì)胞為多，CD8+T 細(xì)胞約46.22%呈現(xiàn)PD1 高表達(dá)，與Ma等［10］的流式分析結(jié)果一致。但Rohr-Udilova 等［11］的研究采用基因測(cè)序結(jié)果分析免疫細(xì)胞分群，發(fā)現(xiàn)未活化CD4+記憶細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例更為豐富。這種差異可能與不完全取材導(dǎo)致取材偏倚、免疫細(xì)胞的分析方法、HCC 腫瘤分化程度或肝慢性疾病背景不一致等因素有關(guān)。

與瘤旁組織相比，瘤內(nèi)CD45+炎性細(xì)胞比率偏低而瘤內(nèi)CD8+PD1+T 細(xì)胞占比明顯偏多，瘤內(nèi)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的比率也明顯偏高。PD1 是T 細(xì)胞表面的負(fù)調(diào)控因子，上調(diào)會(huì)引起T 細(xì)胞功能抑制，在腫瘤中促進(jìn)腫瘤免疫逃逸［12］。調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)源于外周血T淋巴細(xì)胞或肝臟常駐T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同樣與促免疫抑制相關(guān)［13］。因此，腫瘤組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)減少、CD8+PD1+T 細(xì)胞數(shù)增多、Treg 細(xì)胞數(shù)增多，均提示腫瘤比癌旁肝組織免疫抑制微環(huán)境更嚴(yán)重。

抗PD-1 抗體被認(rèn)為是起中斷活化的CD4+和CD8+T 細(xì)胞表面的PD1 與腫瘤細(xì)胞表面配體的結(jié)合，從而提高CD8+T 細(xì)胞的抗腫瘤作用。然而，腫瘤組織內(nèi)PDL1 的表達(dá)比我們想象的要低，因此還存在其他免疫細(xì)胞參與了CD8+T 細(xì)胞表面的PD1的上調(diào)，例如調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞等［14］。此外，腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的B 細(xì)胞與T 細(xì)胞密切分布并參與了T細(xì)胞的抗腫瘤過(guò)程［15］。PD1／PDL1 通路免疫治療的療效取決于復(fù)雜的腫瘤-免疫微環(huán)境，除了與腫瘤內(nèi)T 細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)外，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞等均參與了T 細(xì)胞的活化、抑制和抗腫瘤過(guò)程，尋找可靠的生物標(biāo)志物能篩選適合PD1／PDL1 通路的免疫治療的HCC 患者和對(duì)患者治療過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。為更好分析免疫細(xì)胞與免疫治療療效的相關(guān)性，本研究選擇CD45+炎性細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、CD19+B 細(xì)胞、CD4+輔助T 細(xì)胞、CD8+效應(yīng)T細(xì)胞以及PD1+的效應(yīng)T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等與PD1／PDL1 通路免疫治療密切相關(guān)的免疫細(xì)胞進(jìn)行分析。

表3 觀察者間MRI表觀彌散系數(shù)測(cè)量一致性Table 3 Interclass correlation coefficient between observers

表4 MRI表觀彌散系數(shù)與免疫細(xì)胞比率的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of ADC and immune cell ratio

圖4 腫瘤、腫瘤旁肝組織彌散受限與免疫浸潤(rùn)環(huán)境的關(guān)系Fig.4 The relationship between the ADC of the tumor，the peritumoral liver tissue with immune microenvironment

本研究結(jié)果表明MRI ADC 與多個(gè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況相關(guān)。rADC 與腫瘤旁的pPD1+Tc 比率呈正相關(guān)，與瘤內(nèi)的CD4+輔助T 細(xì)胞比率呈正相關(guān)，ADC值與瘤旁CD19+B細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)，pADC值與腫瘤PD1+Tc 浸潤(rùn)比率呈負(fù)相關(guān)。組織的彌散受限程度與ADC 值呈負(fù)相關(guān)，腫瘤內(nèi)細(xì)胞密度越大，間質(zhì)成分越復(fù)雜，彌散受限越嚴(yán)重，ADC 值越低。因此腫瘤ADC 值越低，彌散受限程度越嚴(yán)重，瘤內(nèi)CD4+輔助T 細(xì)胞越少，瘤旁B 細(xì)胞越多、pPD1+Tc 越少。有研究表明，PD-1/PD-L1 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)CD8+細(xì)胞的抑制性功能狀態(tài)，但并非所有的PD1+T細(xì)胞均具有可逆性，腫瘤免疫微環(huán)境中的其他細(xì)胞也參與調(diào)節(jié)了這一過(guò)程［5］。物理環(huán)境（例如乳酸堆積、酸性環(huán)境、乏氧）、代謝競(jìng)爭(zhēng)、CD4+T 輔助細(xì)胞的缺乏和高表達(dá)免疫調(diào)節(jié)分子均會(huì)限制和影響細(xì)胞毒性T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ［16］。因此ADC 和rADC 值越低，瘤內(nèi)CD4+輔助T 細(xì)胞減少，瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞功能抑制，瘤旁B 細(xì)胞增多，pPD1+Tc 比例減少，提示腫瘤免疫抑制微環(huán)境。此外有研究表明，ADC值與肝纖維化和肝硬化嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［17］，故pADC值越低，提示細(xì)胞越密集，間質(zhì)成分越復(fù)雜，肝纖維化和肝硬化級(jí)別越嚴(yán)重，但腫瘤PD1+Tc 聚集越多，可為抗PD-1 抗體治療提供靶點(diǎn)，可能提示抗PD1+抗體治療靶細(xì)胞比率越高，更傾向于出現(xiàn)治療反應(yīng)。

本研究存在一些局限性：第一，本研究為單中心研究，樣本量小，可能會(huì)存在選擇偏倚。第二，本研究采用的ADC 基于單指數(shù)模型，主要與細(xì)胞密度相關(guān)，如采用更先進(jìn)的計(jì)算模型分別表征微灌注、微結(jié)構(gòu)甚至亞結(jié)構(gòu)等信息可能會(huì)更全面地反映腫瘤免疫微環(huán)境信息。

綜上所述，彌散成像可無(wú)創(chuàng)性地評(píng)估腫瘤及瘤旁肝組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，有望成為免疫檢查點(diǎn)療法篩選患者、療效及預(yù)后預(yù)測(cè)的有效手段。